本科生物工程专业代谢工程菌株构建与性能评价综合实验教案

本科生物工程专业代谢工程菌株构建与性能评价综合实验教案

一、教学整体设计思路

本教学设计面向生物工程、生物技术及相关专业本科高年级学生，开设于专业核心课程“生物工程综合实验”或“代谢工程”之后，属于高阶实践模块。教学设计的核心理念是模拟工业生物技术研发与生产一线的完整工作流程，将经典的代谢工程“设计-构建-测试-学习”（DBTL）循环与现代系统生物学、合成生物学工具深度融合。教学设计不再局限于验证单一技术，而是强调从实际工业需求（如高效合成目标化合物）出发，引导学生完成从理性设计、分子操作、菌株培养到多维度性能分析与迭代优化的全链条、系统性工程实践。教学过程以项目式学习为主线，学生以小组为单位，扮演“细胞工厂”研发团队的角色，在教师（作为项目总监与技术顾问）的指导下，自主决策技术路径，应对实验中出现的复杂问题，最终交付一份符合工业研究报告标准的项目报告与一株性能优化的工程菌株。本设计旨在培养学生的工程思维、跨学科整合能力、创新意识及解决复杂生物技术问题的综合素养。

二、教学内容与学情分析

（一）教学内容深度解析

本实验的核心教学内容聚焦于代谢工程菌株的理性构建与系统性评价，涵盖以下关键知识模块与技能体系：

1.代谢通路理性设计基础：深入理解中心代谢网络（如糖酵解、磷酸戊糖途径、三羧酸循环）与目标产物合成途径（例如：萜类、芳香族氨基酸衍生物、聚羟基脂肪酸酯）的代谢流分配与调控节点。重点掌握基于基因组尺度代谢网络模型（GEM）的模拟分析，用于预测基因敲除、过表达或引入外源途径对代谢流重定向的影响。

2.现代分子克隆与基因组编辑技术：超越传统的限制性酶切连接，重点应用Gibson组装、GoldenGate等无缝克隆技术进行多基因操纵子的模块化组装。核心技能是掌握CRISPR-Cas9系统在模式工业微生物（如大肠杆菌Escherichiacoli，酿酒酵母Saccharomycescerevisiae，谷氨酸棒状杆菌Corynebacteriumglutamicum）中进行精准、高效的基因编辑（敲除、点突变、整合表达）。

3.发酵过程与在线监测技术：学习与操作小型发酵罐（如1-5L工作体积），掌握分批发酵、补料分批发酵的基本原理与控制策略。关键技能包括对溶解氧（DO）、pH、温度、转速、补料速率等关键参数的在线监控与调控，以及离线取样操作规范。

4.多维度性能评价体系：建立从分子到工艺水平的综合评价指标。包括：（1）细胞生长性能：比生长速率、最大生物量。（2）代谢通量性能：底物比消耗速率、产物比生成速率、得率系数。（3）遗传稳定性：工程菌株在无选择压力下连续传代后的质粒保留率或基因组编辑位点的稳定性。（4）工艺鲁棒性：菌株在不同初始糖浓度、pH波动等微环境压力下的性能表现。（5）组学初步分析：引入转录组测序（RNA-seq）或代谢组学数据的解读，关联基因型改变与表型变化。

（二）学情精准分析

教学对象为已完成微生物学、生物化学、分子生物学、化工原理及生物反应工程等先修课程学习的本科生。他们具备以下特点：

1.知识储备：已掌握基本的微生物实验操作、DNA操作技术及发酵原理，但知识模块相对孤立，缺乏在复杂工程问题中进行系统性整合与应用的经验。

2.技能水平：具备基础实验技能，但对自动化工作站、在线监测设备、高通量筛选平台等现代生物技术研发工具接触较少，数据分析多依赖于预设公式计算，缺乏基于原始数据进行深度挖掘和建模的能力。

3.思维模式：习惯于按照既定实验步骤操作的验证性思维，而面对开放性的工程设计与优化问题时常感到迷茫，批判性思维、风险评估与应变能力有待强化。

4.学习动机：对前沿生物技术有浓厚兴趣，渴望参与具有挑战性和实际应用价值的项目，期待将所学知识转化为解决实际问题的能力，为未来从事研发工作或深造打下坚实基础。

三、教学目标

（一）核心素养与能力目标

1.工程实践能力：能够完整实施一个代谢工程项目的DBTL循环，独立完成从菌株设计、分子构建、摇瓶初筛到发酵罐验证的全流程操作。

2.系统思维与整合能力：能够从系统层次理解并分析基因操作、代谢网络、发酵环境与最终产物合成之间的复杂相互作用与权衡。

3.数据驱动决策能力：能够科学地采集、处理、分析与解读多维实验数据，并基于数据做出下一轮菌株改造或工艺优化的理性决策。

4.创新与解决问题能力：在遇到构建失败、生长受抑、产物得率不达预期等实际问题时，能够提出合理的假设并设计实验进行验证与解决。

5.沟通与协作能力：在团队中有效分工协作，撰写专业的技术报告，并进行清晰、严谨的口头答辩。

（二）具体知识与技能目标

1.知识层面：阐述代谢工程的基本原理与DBTL循环；比较不同基因编辑技术的原理与适用场景；解释发酵过程参数对细胞代谢的影响机制；说明多组学数据在代谢工程中的应用价值。

2.技能层面：熟练运用CRISPR-Cas9系统构建基因敲除或整合菌株；使用无缝克隆技术组装多基因表达框；独立操作生物反应器并完成一个标准的补料分批发酵实验；运用统计分析软件（如Origin，R）对生长与产物数据进行分析与绘图；初步解读RNA-seq差异表达基因分析结果。

四、教学重点与难点

（一）教学重点

1.代谢工程理性设计策略的实施：引导学生将理论上的途径设计转化为具体的基因操作清单（如靶点基因、启动子强度、拷贝数等）。

2.CRISPR-Cas9系统的实操与问题排查：确保学生掌握从sgRNA设计、编辑质粒构建、转化到编辑效率验证的关键步骤及常见失败原因分析。

3.发酵过程的动态监控与策略调整：指导学生根据在线数据（特别是DO和pH的变化）实时判断细胞代谢状态，并决策补料或调节策略。

4.多源数据的关联分析与结论提炼：训练学生将生长曲线、产物滴定曲线、得率系数及可能的组学数据整合分析，形成对工程菌株性能的全面、深刻评价。

（二）教学难点

1.理性设计中的代谢流权衡预测：学生对基因操作可能引起的代谢负担、辅因子失衡、毒性中间体积累等副作用难以准确预估。

2.复杂分子构建项目的规划与管理：多片段组装、多轮编辑项目的实验流程长，易出错，需要学生具备出色的项目管理和实验记录能力。

3.发酵过程中异常现象的归因分析：当出现生长迟滞、产物合成提前停止等现象时，学生难以从环境条件、菌株遗传特性或操作失误等多个维度进行快速、准确的归因。

4.从数据到知识的升华：学生倾向于罗列数据，而难以挖掘数据背后的生物学意义和工程学启示，提出有见地的迭代优化方案。

五、教学策略与方法

1.基于真实项目的探究式学习：以一个具体的、有应用价值的目标产物（例如：番茄红素、白藜芦醇、丁二酸）合成任务驱动整个教学周期。提供背景文献和初始宿主菌株，由学生团队自主完成文献调研和初步设计。

2.分层递进的任务模块：将总项目分解为“生物信息学分析与设计周”、“分子构建与验证周”、“摇瓶水平筛选与优化周”、“发酵罐水平放大与评价周”、“数据分析与报告撰写周”等阶段。每个阶段设置阶段性目标、技术培训和成果汇报。

3.专家角色扮演与顾问制：教师和助教团队扮演“公司技术顾问”或“领域专家”，不提供标准答案，而是在学生团队提出方案后，通过“技术评审会”的形式进行质询和引导，促使其完善方案。定期安排“技术讲座”，深入讲解难点技术原理。

4.数字化工具全程赋能：引入生物信息学软件（如SnapGene，Benchling）、代谢网络分析软件（如COBRA工具箱）、实验数据管理平台（如ELN电子实验记录本）和数据分析软件，培养学生数字化科研习惯。

5.形成性与终结性评价相结合：评价贯穿全过程，包括实验设计的创新性与可行性、实验操作的规范性与效率、阶段性汇报表现、实验记录的质量、最终菌株的性能数据以及项目报告的完整性与深度。

六、教学资源与仪器准备

1.菌株与质粒资源：多种模式微生物的野生型菌株；包含不同抗性标记、子的基础载体；CRISPR-Cas9编辑系统组件（Cas9表达质粒，sgRNAscaffold质粒）；常见的强、中、弱组成型或诱导型启动子库；目标产物合成途径的基因模块。

2.关键仪器设备：PCR仪、凝胶成像系统、核酸蛋白测定仪；电转化仪、生化培养箱、摇床；高效液相色谱仪或气相色谱仪（用于产物定量）；多台并联的1-5L全自动发酵罐系统，配备DO、pH、消泡、温度在线监测与控制单元；可选配：微孔板读数仪（用于高通量生长监测）、自动化液体处理工作站。

3.生物信息学与数据分析软件：提供正版或开源软件的培训与使用权限。

4.安全防护装备：全套生物安全等级1级实验所需个人防护装备，以及用于处理有机溶剂等化学品的专用通风橱和防护设备。

七、教学过程实施（共40学时，分五周进行）

第一周：项目启动与理性设计（8学时）

课时1-2：项目导入与团队组建。教师发布“高效合成番茄红素工程大肠杆菌构建”项目任务书，明确最终性能指标（如目标产量、产率、生产强度）。学生自由组建4-5人研发团队，推选项目经理。各团队进行初步文献调研，了解番茄红素合成途径（MEP途径及异源Crt操纵子）、关键限速步骤及前人改造策略。

课时3-4：生物信息学分析与设计实战。在机房进行。培训学生使用KEGG、BioCyc数据库查询E.coli的MEP途径及基因组信息；使用Primer设计软件设计克隆引物及CRISPRsgRNA；利用代谢模型在线工具（如）初步分析增加异源途径对代谢流的影响。作业：各团队提交初步设计方案，包括：拟敲除/弱化的内源基因列表及理由；拟过表达的内源基因及启动子选择；异源Crt基因的密码子优化策略与组装方案；拟采用的CRISPR编辑策略。

课时5-6：设计方案答辩与修订。举行“项目开题评审会”。每个团队进行10分钟方案陈述。教师与其他团队作为评审团，从代谢流合理性、技术可行性、潜在风险（如代谢负担、毒性）等方面提问。评审会后，各团队根据反馈修订方案，形成最终执行版“分子操作清单”。

课时7-8：实验准备与预演。讲解并演示本周即将使用的关键实验操作（高保真PCR、Gibson组装反应体系配置、化学/电转化感受态制备）。学生清点领取所需引物、模板、酶制剂等，准备实验记录本，预习标准操作程序。

第二周：分子构建与基因编辑验证（10学时）

课时9-12：模块化组装与编辑载体构建。各团队根据设计方案，并行开展多项分子实验：（1）PCR扩增目标基因片段及载体骨架；（2）进行Gibson组装，连接目标基因与表达载体，构建过表达质粒；（3）将针对靶基因的sgRNA序列克隆到编辑质粒中。完成转化、涂板、过夜培养。教师巡回指导，重点纠正无菌操作、体系配置准确性等问题。

课时13-14：阳性克隆筛选与验证。挑取单菌落进行菌落PCR或酶切鉴定。对初步鉴定的阳性克隆进行测序送样。讲解Sanger测序结果的分析与比对方法（使用Chromas，SnapGene等软件）。

课时15-16：CRISPR-Cas9编辑与突变体筛选。将验证正确的编辑质粒（含Cas9和sgRNA）转入含有修复模板（如有）的感受态细胞中，进行编辑操作。编辑后，通过抗性平板筛选、菌落PCR及测序验证编辑效率。讨论编辑失败的可能原因（如sgRNA效率低、修复模板设计不当、转化效率低）。

课时17-18：工程菌株的初步获得与保种。将验证正确的过表达质粒转入编辑好的宿主菌，或直接将编辑好的基因组突变与过表达质粒组合，获得第一代工程菌株。进行甘油管保种，并做好详尽的菌株档案记录（包括基因型、质粒信息、抗性、保种日期等）。

第三周：摇瓶水平筛选与初步评价（10学时）

课时19-20：生长与产物合成初筛。在摇瓶水平，测试不同工程菌株（包括对照菌）在多种培养基条件下的生长情况。学习使用微孔板读数仪快速监测生长曲线。同时，建立并优化HPLC等方法用于番茄红素的提取与定量。重点培训取样时间点的选择、样品前处理规范。

课时21-22：实验设计优化。基于初筛结果，引导学生设计简单的析因实验，考察关键因素（如诱导剂浓度、诱导时机、培养基碳氮比）对产物合成的影响。讲解实验设计的基本原则，区分单因素实验与多因素实验的优劣。

课时23-26：实施优化实验与数据分析。学生团队实施自己设计的优化实验。使用数据处理软件绘制生长曲线、产物合成动力学曲线，计算比速率和得率。进行简单的统计学分析（如t检验，ANOVA），判断各因素影响的显著性。教师引导学生关注生长与生产的“权衡”关系。

课时27-28：中期汇报与迭代设计。举行中期汇报会，各团队汇报第一轮DBTL循环的结果：展示构建成功的菌株基因型验证数据、摇瓶性能数据、优化实验结果。并提出第一轮发现的问题（如生长缓慢、产物积累平台期早现）及下一轮迭代的假设与方案（如调整基因表达强度、引入辅因子再生系统等）。进行团队间互评与教师点评。

第四周：发酵罐水平放大与系统评价（10学时）

课时29-30：发酵罐操作规范与上罐前准备。系统讲解发酵罐的结构、工作原理、校准方法及安全操作规程。每个团队负责一台发酵罐的准备工作：安装与校准pH电极和DO电极；配制培养基并灭菌；准备补料液和酸碱液；设定初始发酵参数（温度、pH、搅拌、通气）。

课时31-34：分批/补料分批发酵过程实施。学生团队进行为期48-72小时的发酵实验。实行轮班制，确保对发酵过程进行24小时不间断监控（可在关键阶段安排）。核心教学点：（1）根据DO变化曲线，判断细胞的呼吸状态，并手动或自动调节搅拌转速与通气量。（2）根据pH变化，判断细胞的代谢模式（如产酸/产碱），并控制补加酸碱。（3）在预定的时间点进行无菌取样，用于测定生物量、底物、产物及可能的副产物浓度。（4）当底物即将耗尽时（通过DO突然上升判断），启动补料程序，实施补料分批培养。教师在此过程中充当“安全员”和“技术顾问”，只在必要时干预。

课时35-36：发酵数据整理与过程分析。发酵结束后，指导学生整理所有离线与在线数据。绘制完整的发酵过程参数曲线图。重点分析：生长阶段、产物合成阶段与底物消耗阶段的对应关系；比生长速率、产物比生成速率等关键动力学参数在发酵过程中的动态变化；比较摇瓶与发酵罐条件下菌株性能的差异，并分析原因（如溶氧水平、环境均一度等）。

第五周：数据整合、报告撰写与项目答辩（2学时准备，汇报另计）

课时37-38：数据深度挖掘与报告撰写指导。引入一个简单的案例，展示如何将发酵数据与可能的转录组数据片段进行关联分析。讲解高水平科技报告（模仿MetabolicEngineering，BiotechnologyandBioengineering等期刊文章格式）的结构与写作规范，包括：摘要、引言、材料方法、结果、讨论、结论、参考文献。要求报告必须包含对实验局限性的分析和对未来工作的建议。

课时39-40：项目结题答辩与综合评价。举行正式的项目结题答辩会。邀请其他课程教师或相关领域研究生作为评委。每个团队进行15分钟汇报和10分钟答辩。评委从科学严谨性、工程创新性、数据完整性、汇报表现及团队协作等方面进行评分。最后进行课程总结，回顾整个DBTL循环，强调系统工程思维在生物技术研发中的核心地位。

八、教学评价与反馈

1.过程性评价（占总评60%）：

1.2.实验设计与方案质量（开题报告）：15%。

2.3.实验操作规范性、记录完整性与团队合作精神（课堂观察与实验记录本检查）：20%。

3.4.阶段性成果与汇报表现（中期汇报）：15%。

4.5.数据分析与迭代优化能力（体现在过程记录和讨论中）：10%。

6.终结性评价（占总评40%）：

1.7.最终项目研究报告：25%。评分标准涵盖格式规范性、逻辑清晰度、数据呈现质量、分析讨论深度、参考文献引用等。

2.8