微生物菌种常规保藏技术规程

制定本规程是为实现微生物菌种资源保藏管理程序的规范化，以有效地保护

微生物资源，更好地实现微生物菌种资源的社会共享。

微生物菌种资源保藏管理规程

1范围

本规程规定了微生物菌种资源保藏的基本原则、要求，菌种资源的收集、整

理、保藏、共享的管理流程。

本规程适用于从事微生物菌种资源保藏的机陶。

2规范性引用文件

卜.列文件中的条款通过本规程的引用而成为本规程的条款。凡是注日期的引

用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本规程，

然而，鼓励根据本规程达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本°凡

是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本规程。

GB19489实验室生物安全通用要求

《病原微生物实验室生物安全管理条例》

《兽医实验室生物安全管理规范》

《中华人民共和国专利法》

《中国医学微生物菌种保藏管理办法》

《全国食用菌菌种暂行管理办法》

3定义

3.1微生物菌种资源microorganismresources

指可培养的有一定科学意义、具有实际或潜在实用价值的古菌、细菌、真菌、

病毒、细胞株等及其相关信息数据。

3.2菌种保藏preservdliouofuulluic

是指将微生物菌种用各种适宜的方法妥善保藏，避免死亡、污染，保持其原

有性状基本稳定。

4基本原则

4.1菌种保藏管理旨在对微生物菌种资源进行保护。保藏机构应采取妥善可

靠的方法保藏菌种，避免菌种死亡、退化、变异或污染；对相应的菌种信息应及

时整理，并归档保存。

4.2菌种保藏管理应符合国家相关法律法规。

4.3菌种保藏管理应符合环境保护要求，不能对周围造成污染和危害。

4.4菌种保臧机构应为社会提供微生物菌种资源的共享服务。

5.要求

5.1保藏机构所俣藏菌种的生物危害程度应与其实验室生物防护水平相适

应，实验室的装备和管理应符合GB19489和《病原微生物实验室生物安全管理

条例》的相关规定。

5.2保藏机构应具备菌种长期保藏、复核鉴定、数据库管理和网络共享的完

备设施。

5.3保藏机构应制定严格的保藏管理制度和标准化操作规程。

5.4保藏机构的工作人员应经过专业培训，具备从事菌种保藏、复核、鉴定

和管理维护能力。

6菌种资源的收集

6.1菌种实物的收集

收集的菌种实物应为纯培养物。菌种可通过以下途径收集，必要时应签署相

关协议：

自行分离

交换

购买

接受委托保藏

接受赠送

6.2菌种信息的收集

6.2.1提供者应提供菌株的研究和鉴定材料，据实填写保藏机构的登记表格,

由保藏机构签收入档。

6.2.2保藏机构应进一步收集和完善菌株的相关信息。

7菌种资源的整理

7.1菌种的纯度检测

具体方法参照《国家自然科技资源平台微生物菌种纯度检测技术规程（试

行）》。

7.2菌种的复核

具体方法参照《国家自然科技资源平台微生物菌种资源复核技术规程（试

行）》o

7.3菌种的编号

将复核后的菌株进行编号。

7.4菌种资源数据整理

1）按照国家自然科技资源平台制定的微生物菌种资源描述规范对菌株数据

进行整理。

2）建立菌株的纸质信息和数字化信息档案并备份。

3）档案应安全存放，注意防潮、防霉、防虫、防火、防磁和防盗。

8菌种资源的保藏

8.1菌种保藏

1）应针对保藏菌株确定适宜的保藏方法。

2）同一菌株应选用两种或两种以上方法进行保藏。

3）只能采用一种保藏方法的菌株或细胞株必须备份并存放于两个以上的保

臧设备中。

4）菌种保藏方法参照相应的标准操作规程。

5）菌种的入库和出库应记录入档，实行双人负责制管理。

6）重要菌种应异地保存备份

7）高致病性病原微生物和专利菌种应由国家指定的保藏机构保藏。

8）菌种保藏设施应确保正常运行，设专人负责管理，定期检修维护。

9）菌种保藏设施应有备用电源，防止断电事故发生。

&2定期复核

保藏机构要定期检查菌种保藏效果，有污染或退化迹象时，要及时分离纯化

复壮。每次检查要有详细记录。

8.3废弃物处置

废弃物的处置参照GB19489的有关规定执行。

9菌种资源的共享

9.1信息共享

9.1.1目录共享

保藏机构应编写菌种目录并定期更新出版，目录的编写参照《国家自然科技

资源平台微生物菌种目录编写规范（试行）》。

9.1.2网络共享

保藏机构应按照国家自然科技资源共享要求，建立菌种资源信息平台。

9.2实物共享

9.2.1微生物资源的共享应严格按照《病原微生物实验室生物安全管理条例》

和《中国医学微生物菌种保藏管理办法》等相关规定执行。

9.2.2专利菌种共享按照《中华人民共和国专利法》的相关规定执行。

9.2.3特殊菌种出口需经有关主管部门批准和许可。

9.2.4发放菌株的名称、编号及使用方信息均应登记.

9.2.5发放菌株的邮寄和包装应符合《国家自然科技资源平台一、二类微生

物菌（毒）种包装、运输和开启技术规程（试行）》和《国家自然科技资源平台

三、四类微生物菌（毒）种包装、运输和开启技术规程（试行）》的有关规定。

9.2.6菌株提供者和使用者需签署生物材料转移协议，明确双方的责任、权

力与义务。

微生物菌种常规保藏技术规程

1范围

本规程规定了微生物菌种常规保藏技术的基本原则和方法。

本规程适用于微生物菌种的常规保藏工作。

2定义

本规程采用下列定义。

2.1

微生物菌种资源microorganismresources

指可培养的有一定科学意义、具有实际或潜在实用价值的古菌、细菌、真菌、

病毒、细胞株等及其相关信息数据。

2.2

菌种保藏culturepreservation

是指将微生物菌种用各种适宜的方法妥善保藏，避免死亡、污染，保持其原

有性状基本稳定。

2.3

定期移植保藏法subculturing

亦称传代培养保藏法，包括斜面培养、穿刺培养、液体培养等。是指将菌种

接种于适宜的培养基中，最适条件下培养，待生长充分后，于4℃一6℃进行保

存并间隔一定时间进行移植培养的菌种保藏方法。

2.4液体石蜡保藏法preservationunderliquidparaffin

亦称矿物油保藏法,定期移植保藏法的辅助方法。是指将菌种接种在适宜的

斜面培养基上，最适条件下培养至菌种长出健壮菌落后注入灭菌的液体石蜡，使

其覆盖整个斜面，再直立放置于4℃—15℃进行保存的一种菌种保臧方法。

2.5

沙土管保藏法sandpreservation

亦称载体保藏法。是指将培养好的微生物细胞或胞子用无菌水制成悬浮液,

注入灭菌的沙土管中混合均匀，或直接将成熟抱子刮下接种于灭菌的沙土管中，

使微生物细胞或抱子吸附在载体上，将管中水分拍干后熔封管口或置干燥器中于

4℃—15c进行保存的一种菌种保藏方法。

3.基本原则

3.1应针对菌种特性选择适宜方法进行保藏。

3.2应保证菌种保藏的安全性，不能对周围环境造成污染和危害。

4方法

4.1定期移植保藏法

见附录A。

4.2液体石蜡保藏法

见附录B。

4.3沙土管保藏法

见附录C。

A.1适用范围

本方法适用于大多数细菌和真菌。

A.2原理

低温条件下保藏不减缓微生物菌种的代谢活动，抑制其繁殖速度，达到减少

菌株突变，延氏菌种保藏时间的目的。

保藏培养基一般含较多有机氮，糖分总量不超过2%,既能满足菌种培养时

生长繁殖的需要，又可防止因产酸过多而影响菌株的保藏。

A.3技术要求

A.3.1不同菌种应根据要求选择合适的培养基。

A.3.2接种时要求无菌操作，避免染菌。

A.3.3保藏期间要定期检查菌种存放的房间、冷库、冰箱等的温度、湿度，

各试管的棉塞有无污染现象，如发现异常应取出该管，重新移植培养后补上空缺。

A.3.4大量菌种同时移植时，各菌株的菌号、所用培养基要进行核对，避免

发生错误.

A.3.5每次移植培养后，应与原保藏菌株和菌株的登记卡片逐个对照，检查

无误后再存放。

A.3.6斜面菌种应保藏相继三代培养物以便对照，防止因意外和污染造成损

失。

A.4方法与步骤

A.4.1培养基制备

A.4.1.1器皿准备

培养基制备过程中所用的一些玻璃器皿，如三角瓶、试管、培养皿、烧杯、

吸管等，根据不同情况洗涤、干燥、包装、灭菌后使用。

A.4.1.2溶解培养基配料

先在烧杯中放适量水，按培养基配方称取各项材料，依次将缓冲化合物、主

要元素、微量元素、维生素等材料加入水中溶解，最后加足水量。

A.4.1.3调pH值

配料溶解后将培养基冷却至室温，根据要求用稀酸或稀碱调pH值。加酸或

碱液时要缓慢、少量、多次搅拌，防止局部过碱或过酸而导致测量不准确和营养

成分被破坏。

A.4.1.4加凝固剂

配制固体培养基时需加凝固剂，如琼脂、明胶等。将凝固剂加入液体培养基

中，加热并不断搅拌至融解，再补足所蒸发水分。

A.4.1.5过滤分装

在二层纱布中间夹入脱脂棉，将配好的培养基趁热过滤并分装，斜面培养基

不宜超过试管高度的四分之一。分装过程中勿使培养基沾污管口，以免弄湿棉塞

造成污染。

A.4.1.6包扎标记

将试管加棉塞，外面包扎一层牛皮纸或铝箔并注明培养基名称及配制日期。

A.4.1.7火菌

根据要求将培养基灭菌。灭菌后摆放斜面时，斜面长度不超过试管管长的二

分之一为宜。

A.4.1.8无菌检查

将灭菌的培养基放入培养箱中作无菌检验。

A.4.2接种

A.4.2.1斜面接种

A.4.2.1.1点接

把菌种点接在斜面中部偏下方处。适用于扩散型生长及绒毛状气生菌丝类霉

菌（如毛霉、根霉等）。

A.4.2.1.2中央划线

从斜面中部自下而上划一直线。适用于细菌和酵母菌等。

A.4.2.1.3稀波状蜿蜒划线法

从斜面底部自下而上划〃之〃字形线。适用于易扩散的细菌，也适用于部分真

菌。

A.4.2.1.4密波状蜿蜒划线法

从斜面底部自下而上划密〃之〃字形线。能充分利用斜面获得大量菌体组胞,

适用于细菌和酵母菌等。

A.4.2.1.5挖块接种法

挖取菌丝体连同少量琼脂培养基，转接到新鲜斜面上。适用灵芝等担子菌类

真菌。

A.4.2.2穿刺接种

用直接种针从原菌种斜面上挑取少量菌苔，从柱状培养基中心自上而下刺入,

直到接近管底（勿穿到管底），然后沿原穿刺途径慢慢抽出接种针。适用于细菌

和酵母菌等。

A.4.2.3液体接种

挑取少量固体斜面菌种或用无菌滴管等吸取原菌液接种于新鲜液体培养基

中。

A.4.3培养

将接种后的培养基放入培养箱中，在适宜的条件下培养至细胞稳定期或得到

成熟泡子。

A.4.4保藏

A.4.4.1保藏温度和时间

培养好的菌种于4℃一6℃保存，根据要求每3—6个月移植一次。对于某些

菌种，如芽裂酵母，阿舒假囊酵母，棉病囊霉等，须1—3个月移植一次。

A.4.4.2保藏湿度

用相对湿度表示，通常为50%—70%。测量仪表采用毛发湿度计或干湿球湿

度计。

A.4.5移植培养

将培养物转接到另一新鲜培养基中，再在适宜条件下培养。

A.4.6菌种复壮

菌种如有退化，应将退化的菌种引入原来的生活环境中令其生长繁殖，通过

纯种分离，在宿主体内生长等方法进行复壮。

附录B

液体石蜡保藏法

B.1适用范围

本方法适用于不能分解液体石蜡的酵母菌、某些细菌（如芽剂杆菌属，醋酸

杆菌属等）和某些丝状真菌（如青霉属，曲霉属等3

B.2原理

液体石蜡保藏法可作为定期移植保藏法的辅助方法。在液体石蜡覆盖下，菌

种的生物代谢受到抑制，细胞老化被推迟。此方法可阻止氧气进入，使好气菌不

能继续生长，也可防止因培养基的水分蒸发而引起的菌体死亡，达到延长菌种保

臧时间的目的。

B.3技术要求

B.3.1菌种培养参照附录A

B.3.2应选用优质化学纯液体石蜡。

B.3.3液体石蜡易燃，在对液体石蜡保藏菌种进行操作时注意防止火灾。

B.3.4保藏场所应保持干燥，防止棉塞污染。

B.3.5保臧期间应定期检查，如培养基露出液面，应及时补充灭菌的液体石

蜡。

4方法与步骤

B.4.1液体石蜡

将液体石蜡分装加棉塞，用牛皮纸包好，0.IMPa灭菌30分钟取出，置40C

恒温箱蒸发水分，经无菌检查后备用。

B.4.2斜面培养物的制备

参照附录A,斜面宜短，不超过试管三分之一为宜。

B.4.3灌注石蜡

无菌条件下将灭菌的液体石蜡注入刚培养好的斜面培养物上，液面高出斜面

顶部1厘米左右，使菌体与空气隔绝。

B.4.4保藏

将注入石蜡油的菌种斜面直立存放于低温(4℃75℃)干燥处，保藏时间为

2-10年不等。

B.4.5恢复培养

恢复培养时，挑取少量菌体转接在适宜的新鲜培养基上，生长繁殖后，再重

新转接一次。

附录C

沙土管保藏法

C.1适用范围

本方法适用于产抱类放线菌、芽抱杆菌、曲霉属、青霉属以及少数酵母如隐

球酵母和红酵母等。不适用于病原性真菌的保臧，特别是不适于以菌丝发育为主

的真菌的保藏。

C.2原理

干燥条件下微生物菌种代谢活动减缓，繁殖速度受到抑制。此方法可减少菌

株突变，延长存活时间。

C.3方法与步骤

C.3.1沙土管制备

将河沙用60目过筛，弃去大颗粒及杂质，再用80目过筛，去掉细沙。用吸

铁石吸去铁质，放入容器中用10%盐酸浸泡，如河沙中有机物较多可用20与盐酸

浸泡.24小时后倒去处酸，用水洗泡数次至中性，将沙子烘干或晒干.另取瘦

红土100目过筛，水洗至