分子诊断技术在重大传染病病原体变异检测中的应用

分子诊断技术在重大传染病病原体变异检测中的应用摘要分枝杆菌与人免疫缺陷病毒变异株的分子检测技术的研究与应用现重大传染病是对人类健康和社会产生严重威胁的一类传染性疾病，如新型冠状病毒感染(coronavirussyndromedisease-19,程度以及传播范围，部分变异株已被世界卫生组织(WorldHealthOrganization,WHO)列为关切变异株(variantsofconcern,VOC)计发布了68个候选耐药基因，几乎涵盖了所有的一、二线抗结核药断进化，因此多种变异株相继出现5]。分子生物学方法是鉴别新发突变以及监测当前流行毒株的主要途径，分(一)基于测序的检测技术在测序产品方面，因美纳、赛默飞和牛津纳米孔3家公司均开发了新型冠状病毒基因组测序产品。例如，因美纳的AmpliSeq新型冠状病毒研究试剂盒对病毒基因组的覆盖度>99%。赛默飞的IonAmpliSeq新型冠状病毒研究试剂盒产品可用于监测新型冠状病毒冠状病毒快速测序提供解决方案，分别与MinION、GridION、PromethION测序平台联用可实现12、480和2000个基因组的测序。测序系统，可在18h内完成新型冠状病毒全基因组测序和分型。(二)快速检测技术基因靶标失效(spikegenetargetfailure,SGTF)、片段分析和interspacedshortpalindromicrepeats/CRISPR-associated发的VirSNiP新型冠状病毒检测试剂奥密克戎变异株突变数量的增加，该公司开发了3种用于检测奥密克和E484A)。一项临床研究对比了4种VirSNiP新型冠状病毒检测产了异常的熔解曲线，无法用于检测⁹]。因此，针对病毒不断变异，检测试剂需不断更新迭代以保证检测结果的可靠。2023年，该公司3.SGTF:S基因69~70位氨基酸缺失引起S基因信号变弱或失效，模式下的敏感度为93.2%,特异度为99.3%[11]。鉴于当前流行的XBB4.片段分析：片段分析法通过毛细管电泳分析扩增产物的长度 (插入或缺失的鉴别)和荧光信号(单碱基突变)双维度组合结果来[12]开发的CoVarScan靶向新型冠状病毒VOC的5个基因缺失区和3个S基因点突变，通过多重组合分析实现了4种变异株的鉴别，其敏感度和特异度分别达到96%和99%,是一种高通量且经济的筛选新突冠状病毒变异株的分子检测技术见表1。表1新型冠状病毒变异株的分子检测技术及代表检测产品检测时长析型毒研究试剂盒(因美纳，RUO)毒研究试剂盒(赛默飞，RUO)津纳米孔技术，RUO)变检测试剂盒(TIBTaqMan新冠病毒突变检测组合(赛默飞，RUO)组合试剂(赛默飞，S:34-94、S:141-166.S:ORFla:3662-3689和ORF8:97-N:27、1452、E484K和N501Y可检测单碱基突位置的限制变位点，检测通量高设备昂贵，技术门槛高，耗时长，检测费用高，不适用产物影响的初筛术门槛和成本相对较高特异性强、灵敏度目前多与扩增技术适用于床旁诊断容，需要分步进行注：SGTF为S基因靶标失效；RUO为仅研究使用；CE-IVD为欧盟认证体外诊断产品，CRISPR/Cas为成簇规律间隔短回文蛋白系统对耐多药结核病/利福平耐药结核病患者进行氟喹诺酮类药物 (fluoroquinolone,FQ)耐药性检测。快速准确的药物敏感性检测 (drugsusceptibilitytesting,DST)对于DR-(一)测序技术1.靶向二代测序(targetednext-generationsequencing, (法国Genoscreen公司),覆盖了18个基因区的24个扩增子的组EMB)、FQ、贝达喹啉和利奈唑胺、氯法齐明、阿米卡星、链霉素 (英国牛津纳米孔技术有限公司),涵盖24个耐药靶标的27个扩增公司),可检测抗结核药物耐药性相关的21个基因，用于检测对EMB的耐药性。tNGS的综合敏感度为94.1%,特异度为98.1%,与表型药PhyResSE、resistanceSniffer或Treesist-3.Sanger测序：我国广州达安基因的注册生产的利福平和异烟526和516位密码子突变，和异烟肼对应的katG基因315位点和inhA(二)基于探针杂交的突变检测技术1.荧光探针PCR-熔解曲线法：2013年，美国赛沛研发的XpertMTB/RIF,以全自动半巢氏实时荧光定量PCR为基础，通过5个分子信标探针与rpoB基因81bp利福平耐药核心区(507~533位密码子)杂交，可在2h内完成MTB或对利福平耐药基因检测，敏感度89%,特异度99%[19]。2017年，XpertMTB/RIFUltra采用了半定量巢式提高了第553位密码子突变检测质量，可更好地区分rpoB突变种类散分子信标探针，可在约90min内同时检测异烟其敏感度为54%~94%,特异度为98%~100%[23]。我国厦门致善生物自 (78.60%~97.01%)、特异度(75.76%~99.55%)和符合率 RIF/INH和Fluoro-Type(FT)MTBDR,是基于探针检测技术的中等复GenoType°MTBDRplus(德国海恩生命科学),通过检测rpoB、katG85.6%~97.0%,二线注射类药物：76.5%~89.0%,广泛耐药结核：术见表2。AmPORE-TBOtest(牛津纳米公司)测多个耐药靶基因耐药靶基因WHO首选推荐，技术门槛低，易部署，检技术门槛高，耗时TBseq@test′(杭州圣庭公司)通用平台可检测其测单一靶基因结核分枝杆菌异烟肼耐药基因突变结核分枝杆菌利福平耐药突变基因检测试剂盒(广州达安基因)探针技术荧光探针曲线法复杂性自动NAAT等复杂自Ultra(赛沛)XpenMTB/XDR(赛沛)“测多个耐药靶基因耐药靶基因技术门槛高，耗时BDMAXMDR-TB(BecobasMTB-RIF/INH(罗氏)FluoroTypeMTBDR(海恩WHO首选推荐，技术门槛低，易部署，检测速度快，价格低通用平台可检测其测单一靶基因荧光探针结核分枝杆菌利福平及异烟肼耐药利福平、异烟肼、PCR-熔解突变检测试剂盒曲线法结核分枝杆菌利福平、异烟肼、链霉素、乙胺丁醇、氟喹诺酮类药物耐药突变检测试剂盒(厦门致善)线性探针技GenoTypeMTBDRplusvlandv2(海术恩生命科学/布鲁克)GenoTypeMTBDRsl,v2(学/布鲁克)药物测多个耐药靶基因耐药靶基因技术门槛高，耗时注："WHO推荐；“我国上市产品；NAAT为核酸扩增；NGS为靶向下一代测序；WGS(一)耐药基因型检测的主要技术平台和金标准。2022年美国赛默飞推出的Applied酶、逆转录酶和整合酶区进行耐药基因型检测。比已停产的ViroSeq试剂盒(可检测HIV-1M组的蛋白酶、逆转录酶和整合酶)。我国获批上市的仅有广州达安基因的HIV-1型耐药基因型检测试剂盒，覆盖常为1000~2000拷贝/ml。相比于商品化试剂盒，实验室自建HIV (200~1000拷贝/ml)。WHO和我国疾控中心参比室均定期开展HIV2.高通量测序法：高通量测序技术可检测丰度低至5%,甚至1%测试剂盒(法国ABL公司)除了可检测HIV蛋白酶、逆转录酶和整合酶区(欧盟CE-IVD)外，还覆盖了融合抑制剂与共受体抑制剂作用检测试剂(科研用途),还开发了覆盖HIV-1的全基因组测序试剂盒///products/hiv-genotyping-drutance/)。基于半导体测序平台的Sentosa*SQHIV-1基因分型耐药检测试剂盒(新加坡)已在多国获批用于临床检测，覆盖了HIV-1M组的蛋白酶、逆转录酶和整合酶，与Sanger法具有较好的一致性 白酶与逆转录酶的HIV耐药检测方法[30],中国疾病预防控制中心还建立了基于因美纳平台覆盖我国主要流行亚型的HIV-1近全长基因组测序方法3。以单分子测序技术为代表的第三代测序技术的超长读长特性解决了二代测序检测的基因片段较短，无法鉴定联合突变的难题。复杂动态变化过程。还有研究建立了基于牛津(二)点突变检测技术术用于HIV的耐药检测，但仅限于科研用途。是应用连接酶杂交突变探针(地高辛)/野生探针(荧光素)与普通探针链接，通过检测不同波段的光谱(450/490nm)来区分突变毒株adaptation,PANDAA)是通过固定探针结合感度和特异度分别达到96.9%和97.5%。基因型耐药检测相关方法总结见表3。测序Sanger型和耐药检测试HIV-1型耐药基因型检金标