荧光定量PCR测定方法性能验证标准操作程序

荧光定量PCR测定方法性能验证标准操作程序1目的对荧光定量PCR测定方法进行性能验证，以保证所采用的相关试剂盒的分析性能能满足临床检测的要求，保证检测结果的准确性。2适用范围适用于荧光定量PCR测定。3职责和权限3.1组长：制定性能验证计划及标准操作规程。3.2技术人员：按照本程序的要求，完成性能验证工作。4工作程序4.1拟验证参数的确定根据试剂盒说明书或行业标准（如CLIA88´）制定拟验证的性能参数。定量测定需要验证的参数包括：精密度（批内、批间）、正确度、线性范围、临床可报告范围、参考区间、抗干扰能力以及人员比对实验。要求检测过程中采取质量控制措施，尽可能保证检测系统处于一个稳定状态。4.2批内精密度试验4.2.1样本来源：高浓度及低浓度的混合新鲜临床标本。4.2.2实验方法：将高值、低值两个样本在同一批次内分别测定20次，同时进行质控品的测定。4.2.3实验资料：将质控结果在控时获得的高低值样本的检测结果以及换算所得的对数值填入下表(见表1)，并计算均值、标准偏差和批内精密度（%）：表1批内精密度试验检测结果记录表序号高值低值结果对数值结果对数值1234567891011121314151617181920SD均值CV%标准<5%<5%结论4.2.4结果判断本项目的批内精密度实验CV<5%(厂商声明值)，则认为验证通过。4.3批间精密度试验4.3.1样本来源：高浓度及低浓度的混合新鲜临床标本。4.3.2实验方法：取高值、低值两个样本，与病人标本一同进行测定，同时进行质控品的测定；或每批次4个，检测5个批次。4.3.3实验资料：在每批次质控结果均在控时获得如下资料(见表2)：表2批间精密度试验检测结果记录表批次高值低值结果对数值结果对数值1234567891011121314151617181920SD均值CV%标准<5%<5%结论4.3.4结果判断本项目的批间精密度实验CV<5%(厂商声明值)，则认为符合要求，可以进行常规检测。4.4正确度验证根据卫生部临检中心室间质评成绩对定量测定进行正确度验证，PT成绩≥80%者为验证通过。或使用有溯源的标准品验证，±0.4lg内为验证通过。4.5线性范围验证实验4.5.1样本来源：已知浓度的病人标本，浓度收集接近线性范围上限。4.5.2实验方法：根据厂方提供的线性范围，将接近线性范围上限的病人血浆用灭菌蒸馏水按10倍梯度稀释为若干个浓度，低浓度应接近线性范围下限，分别将每个稀释度检测2次，计算线性回归系数R。4.5.3稀释方案举例：样本1：60μl血浆与540μl蒸馏水混匀；样本2：60μl样本1与540μl蒸馏水混匀；样本3：60μl样本2与540μl蒸馏水混匀；样本4：60μl样本3与540μl蒸馏水混匀；样本5：60μl样本4与540μl蒸馏水混匀。4.5.4实验资料（见表3）表3线性范围试验数据编号1234567理论值实测值1实测值2检测均值线性回归系数R结论4.5.5结果判断计算所得线性回归系数R≥98.0%之间，认为线性范围验证通过。4.6临床可报告范围验证结合临床要求，该项目线性范围可以满足临床需要，因此线性范围即为可报告范围。4.7参考区间验证实验4.7.1实验方法：样本选入原则为健康体检者中乙肝三系全阴、肝功能、B超等正常者20人，其中男女各10人进行测定，同时进行质控品的测定。4.7.2实验资料：质控结果在控时获得如下资料（见表4）：表4参考范围验证实验结果记录表标本号检测结果标本号检测结果11121231341451561671781891910204.7.3结果判断各样本中HBV-DNA含量应无CT值，即未检测到HBV-DNA（Undet），即为验证通过。4.8抗干扰能力验证实验4.8.1选择经试剂盒检测的HBVDNA低、高值标本各一份，用HBV、HCV、HIV-1全阴性的脂血(TG>10mmol/L)、黄疸(TBIL>200μmol/L)新鲜血浆作为梯度稀释基质，对标本进行10倍、100倍梯度稀释，制成脂血、黄疸标本。之后用滴管搅匀吹打试管内全血，使之轻度溶血，重复操作使之重度溶血，分别检测HBVDNA含量，全部进行复管检测。从而考核标本脂血、黄疸、溶血时对HBVDNA检测结果的影响。表5干扰实验结果记录表样本类型理论浓度LOG理论浓度允许范围测定浓度下限(-0.4)上限(+0.4)定量值定量平均值LOG测定浓度低浓度原始标本用黄疸血清稀释10倍用黄疸血清稀释100倍用脂血血清稀释10倍用脂血血清稀释100倍轻度溶血重度溶血高浓度原始标本用黄疸血清稀释10倍用黄疸血清稀释100倍用脂血血清稀释10倍用脂血血清稀释100倍轻度溶血重度溶血4.8.2结果判断：测得值在允许范围时（理论浓度对数值±0.4），认为脂血、黄疸、溶血标本对HBV-DNA测定无影响。4.9抗污染能力验证实验取10份高值样本（＞107）及10份阴性样本，间隔放置进行自动核酸提取。10份阴性样本中HBV-DNA含量应无CT值，即未检测到HBV-DNA（Undet），即为验证通过。4.10最低检出限验证实验取试剂盒低值标准品(S2)稀释至说明书声明的最低检出限，同一批次内测