新型过氧化亚硝酸根比率荧光探针的制备与应用研究

摘要过氧化亚硝酸根（ONOO-）作为连接氮代谢与氧化应激的核心活性物种之一，它的动态监测对揭示相关疾病的发病机制意义非凡，研究表明，ONOO-的异常累积跟阿尔茨海默病、药物性肝损伤、癌症等多种重大疾病密切相关，在不同的疾病之中借助不同机制发挥功能，针对传统检测技术在复杂生物环境中显现出选择性不足、灵敏度受限等弊端，本研究设计并制作了一种基于罗丹明类（Rhodol）荧光染料的新型比率荧光探针，借助比率型探针的独特优势达成对ONOO-的精准检测。该探针技术凭借其高灵敏度、快速响应与可视化检测的特点，成为近年来的研究热点。其比率型设计策略与特异性识别机制为新型荧光探针的开发提出了新思路，在过氧化亚硝酸根的检测及相关生物医学研究有重要的应用潜力。关键词：荧光探针；过氧化亚硝酸根；性能研究；光谱分析

ABSTRACTAsoneofthekeyreactivespecieslinkingnitrogenmetabolismandoxidativestress,dynamicmonitoringofperoxynitrite(ONOO-)isofgreatsignificanceforrevealingthepathogenesisofrelateddiseases.StudieshaveshownthatabnormalaccumulationofONOO-iscloselyassociatedwithmajordiseasessuchasAlzheimer’sdisease,drug-inducedliverinjury,andcancer,exertingitsfunctionsthroughdistinctmechanismsindifferentpathologicalcontexts.Aimingtoaddressthedrawbacksoftraditionaldetectiontechniques,suchasinsufficientselectivityandlimitedsensitivityincomplexbiologicalenvironments,thisstudydesignsandfabricatesanovelratiometricfluorescentprobebasedonRhodol-derivedfluorescentdyes.TheuniqueadvantagesoftheratiometricprobeenableprecisedetectionofONOO-.Thisprobetechnologyhasemergedasaresearchhotspotinrecentyearsduetoitscharacteristicsofhighsensitivity,rapidresponse,andvisualdetection.Itsratiometricdesignstrategyandspecificrecognitionmechanismprovidenewinsightsforthedevelopmentofnovelfluorescentprobes,demonstratingsignificantapplicationpotentialinthedetectionofperoxynitriteandrelatedbiomedicalresearch.Keywords:fluorescentprobe;peroxynitrite;performancestudy;spectralanalysis

目录TOC\o"1-3"\h\u摘要 [40]。此选择性测试包含了生命系统中的相关干扰物如Met、Arg等物质，结果表明探针在其他物质的存在下可以同样灵敏地检测ONOO-,其过程不受干扰。通过对以上物质响应效果分析，发现过氧化亚硝酸根组与其他组的响应效果差异显著，证明探针对ONOO-的响应具有特异性。探针具有灵敏检测复杂生物体系中的过氧化亚硝酸根的潜力。图3.SEQ图3.\*ARABIC3左图为探针对各种分析物的选择性；右图为探针对各种分析物的抗干扰能力3.4探针在不同条件下的荧光响应曲线研究pH响应曲线与选择性、响应时间、灵敏度共同构成探针实用性能的重要参数。细胞内不同区域pH差异显著，而且生理过程会伴随局部pH变化。ONOO-的生成与pH值密切相关，研究探针在不同pH环境下的响应可准确关联ONOO-浓度与局部环境酸碱状态。结合生物体内不同微环境的pH差异，分析探针在特定pH区间内是否具有稳定的荧光响应。当未添加过氧化亚硝酸根时，探针仅在强酸性（pH<5）条件下大幅上升，在强碱性（pH>9）条件下略有上升。但在跟生理相关联的pH（6.5-7.8）这个区间内，探针的荧光信号一直稳定，符合细胞内微环境检测的实际需求。添加了过氧化亚硝酸根之后，在pH<6和pH>10范围内，荧光强度出现显著升高，该现象与探针识别基团的反应活性有紧密关联：于中性条件下，ONOO-主要以过氧亚硝酸根离子（ONOO-）的形式出现，当处于酸性条件，就容易分解成NO₂和·OH自由基，处于碱性环境时，稳定性增强，亲核性却下降了，此特性跟pH响应曲线相结合，说明在生理条件下探针可以正常检测ONOO-。图3.SEQ图3.\*ARABIC4在不同pH下探针及其响应ONOO-的荧光强度变化3.5探针在细胞成像中的应用研究我们深入研究了所设计的新型比率荧光探针能否有效应用于Hela活细胞中内源性过氧化亚硝酸根（ONOO⁻）的成像检测。之所以选用Hela细胞作为生物测定模型，是因其在生理和病理研究中具有重要地位，并且对多种刺激因素的响应机制相对清晰，便于我们研究内源性ONOO⁻水平变化时探针的性能表现。我们设置了对照组（CTRL）、脂多糖（LPS）+探针组、仅探针组(PROBE)进行实验。如图3.5中PROBE组所示，当Hela细胞只与10µM探针进行孵育后，在绿色通道和红色通道下，细胞仅发出微弱荧光。这清晰地表明，在未受外界特殊刺激的初始状态下，Hela细胞内的内源性ONOO⁻水平较低，探针未产生明显的荧光信号改变。随后，我们设置了不同的实验组进行实验。在LPS+PROBE组中，Hela细胞预先与2µg/mL的LPS进行孵育，以诱导细胞内源性ONOO⁻的产生，随后再与10µM探针进行孵育。分析图中LPS+PROBE组结果显示，绿色通道的荧光强度进一步大幅增强。这明确显示，LPS成功刺激Hela细胞提升了内源性ONOO⁻的水平，同时也充分证明了我们的新型比率荧光探针能够高效且准确地检测到由LPS刺激诱导产生的内源性ONOO⁻。上述实验结果充分表明，我们所设计的新型比率荧光探针能够有效地检测Hela细胞中，因LPS不同刺激所诱导产生的内源性ONOO⁻水平变化。这一成果不仅表明了该探针在Hela活细胞内源性ONOO⁻成像检测方面的优异性能，更为深入研究Hela细胞内ONOO⁻相关的生理病理过程提供了关键工具，有望在癌症等相关疾病的研究中发挥重要作用，助力我们进一步揭示疾病发生发展的机制，为后续的诊断和治疗策略开发提供有力支持。图3.SEQ图3.\*ARABIC5左图为Hela细胞中过氧化亚硝酸根的荧光成像；右图为各组的相对荧光强度

结论本研究针对过氧化亚硝酸根（ONOO⁻）在复杂生物环境检测方面的挑战，设计并制备了一种新型比率荧光探针，采用有机合成、光谱表征及生物活性评价，系统验证了探针的性能优势及应用潜力。研究采用合理方式构建“荧光团-连接基团-识别基团”分子结构，采用比率荧光信号开展自校准检测，有力减少探针浓度波动、背景荧光和环境参数形成的干扰，利用紫外-可见光谱、荧光光谱及细胞成像技术系统性地表征探针性能：在生理环境条件下，探针响应ONOO⁻十分迅速，线性检测区间从0至10μM，检测限低至43nM，明显在性能上优于单波长探针。在较低的过氧化亚硝酸根的浓度范围内和荧光强度具有良好的线性关系。选择性检验表明，探针不受常见活性氧/活性氮种类（NO、H₂O₂、ClO⁻）以及生物分子（氨基酸、硫醇类）的干扰，表现出良好的抗干扰水平，ONOO⁻借助亲核加成反应触发探针的ICT效应，推动荧光团共轭体系拓展，双波长信号的比值明显增强，做到信号的高效放大与精准校准。通过荧光滴定实验表明，探针具备灵敏检测ONOO⁻的能力。本实验聚焦研究的比率型探针利用“特异性识别和比率信号放大”的多重优势，冲破了传统单通道探针的检测瓶颈，打造的新型比率荧光探针既拥有方法学创新又具备实际应用价值，这种设计策略为活性物种检测探针的开发提供了新思路，在化学生物学、医学检测及环境监测范畴具备广阔的发展空间。

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