T-CVMA 311-2025 牛羊精液牛羊猪三种布鲁氏菌三重实时荧光PCR检测方法与分离培养方法

中国兽医协会发布I请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本标准主要起草人：何诚、张学迪、崔跃徽、黄宗洋、王慧敏、陈硕、宋娜杰、熊毅、郑1牛羊精液牛羊猪三种布鲁氏菌三重实时荧光PCR检测方法与分离培养方法包括的试剂和材料、仪器设备、样品采集与处理、操作方法、结果判定和分离培养。NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范4缩略语BHQ：黑洞淬灭基团（BlackHoleQuencheBSL-3：生物安全防护三级实验室（BiosafetyLevelDEPC：焦碳酸二乙酯（DiethylpyrocarbonaDNA：脱氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid）FAM：6-羧基荧光素（6-CarboxyfluoresceiHEX：六氯-6-甲基荧光素（6-HexachlorofluoresceiPBS：磷酸盐缓冲液（PhosphateBPCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）RNA：核糖核苷酸（RibonucleicAciROX：6-羧基-X-罗丹明（6-Carboxy-X-rhodamine）25.1.40.01mol/LPBS溶液（pH7.4）：按照A.2配制。5.1.5商品化荧光PCR试剂盒：含荧光P5.1.6阳性对照：重组质粒，制备过程按附录5.1.8内标溶液：用于过程质量控制的重组质粒，制备过程按附录B。三重荧光PCR扩增用上、下游引物和探针序列6.2高速台式冷冻离心机，可控温至4℃,离心力可达12000g以上。样品的采集、保存与运输按照NY/T5413采用柱式核酸提取试剂盒或用自动化核酸提取仪提取各类样品中的精液核酸DNA。对附录D配制，依次加入体系中的成分，为了避制反应液在冰盒上进行。将配制的荧光PCR反应液充分混匀，按照每管20µL分装于0和HEX4个荧光通道，Cy5对应内标（用于对核酸提取过程及PC9结果判定9.1结果分析条件设定9.2试验成立的条件9.2.39.2.1和9.2.2要求需在同一次试验中同时满足，否则，本次试验无效，需重新进行。9.3结果描述及判定49.3.1结果描述种阳性荧光信号表示三种种属核酸阳性，为三阳性。首先按照表1判定各荧光通道的阳性和阴性结果，可疑结果，需要重新检测，重新检测需要从核酸提取开始，如增加样本取样量或减少溶解核酸的洗脱+---+或-+--+或--+-+或---++或-++-+或-+-++或--+++或-+++----在被检样本的内标（Cy5）通道为阳性的情况下，若被检样品在59.3.4可疑在被检样本的内标（Cy5）通道为阳性的情况下，被检样品若在相应通道38≤Ct值＜40时，且出现特异性扩增曲线，建议对该样品进行重复试验，重复试验结果Ct值＜40且有明显扩增曲线则判轻轻混合倾斜，使被检精液分布在琼脂斜面上，置37℃温箱培养（如果怀疑），常为1~2周，最长为4周）。如有结果描述和判定同上述9.3内容。必要时，参照GB/T18646-2025附录E中的引物和探针序列，通过7溶液配制A.1DEPC水蒸水中，搅拌至完全溶解后，调pH至7.4，加纯化水定容至1L，分装后在121℃灭菌18B.1.1牛种布鲁氏菌部分基因参考序列（GenBankAccessionNo.B.1.2羊种布鲁氏菌IS5基因参考序列（GenBankAccessionB.1.3猪种布鲁氏菌IS5基因参考序列（GenBankAccessionB.1.4内标Type2secretionsystemlipase基因参考序列（GenBankAc利用超微量分光光度计测定阳性及内标重组质粒浓度，并按下面公式将浓度换算成拷贝数，DNA拷贝/μL=[6.02×1023×DNA浓度(ng/μL)×10-9]/(DNA碱基数×660)。作为阳性对照及内标溶液时9Brucellaabortus-FBrucellaabortus-RBrucellaabortus-PROX-TGCCATCCGTGCTGCCATCG-Brucellamelitensis-FBrucellamelitensis-RBrucellamelitensis-PFAM-AGACAGTGCTTCGTCACGCTAGAGCGBrucellasuis-FAAAGGGAGTGGGTTCTAGGBrucellasuis-RBrucellasuis-PHEX-TCTGCATTCAACGCAACC