2024犬细小病毒病诊断技术

GB/T27533—2024

目次

前言

…………………………Ⅲ

引言

…………………………Ⅳ

范围

1………………………1

规范性引用文件

2…………………………1

术语和定义

3………………1

缩略语

4……………………1

生物安全措施

5……………1

临床诊断

6…………………2

样品采集处理与保存

7、……………………3

胶体金免疫层析法

8………………………4

病毒分离鉴定

9……………4

血凝与血凝抑制试验

10(HA/HI)………………………5

11PCR……………………6

荧光

12PCR………………8

综合判定

13…………………9

附录规范性试剂溶液的配制

A()………………………10

附录资料性荧光引物和探针序列

B()PCR、PCR……………………11

附录资料性犬细小病毒反应产物电泳图

C()PCR…………………12

附录资料性犬细小病毒荧光扩增曲线图

D()PCR…………………13

Ⅰ

GB/T27533—2024

前言

本文件按照标准化工作导则第部分标准化文件的结构和起草规则的规定

GB/T1.1—2020《1:》

起草

。

本文件代替犬细小病毒病诊断技术与相比除结构调

GB/T27533—2011《》,GB/T27533—2011,

整和编辑性改动外主要技术变化如下

,:

增加了缩略语见第章

———(4);

增加了生物安全措施见第章

———(5);

增加了流行病学见

———(6.1);

增加了血常规检查见

———(6.3);

增加了胶体金免疫层析法见第章

———(8);

增加了荧光见第章

———PCR(12);

增加了综合判定见第章

———(13)。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利本文件的发布机构不承担识别专利的责任

。。

本文件由中华人民共和国农业农村部提出

。

本文件由全国动物卫生标准化技术委员会归口

(SAC/TC181)。

本文件起草单位青岛农业大学逢时青岛海洋科技有限公司中国动物卫生与流行病学中心

:、()、、

青岛海华生物集团股份有限公司河北北方学院山东省农业科学院青岛市城阳区农业农村服务中心

、、、、

长春西诺生物科技有限公司山东省动物疫病预防与控制中心上海海关动植物与食品检验检疫技术中

、、

心青岛巴特菲科技发展有限公司重庆市动物疫病预防控制中心淄博市张店区畜牧渔业服务中心

、、、。

本文件主要起草人张洪亮单虎马清霞苏红李一飞刘刚张瑞华肖颖朱伟民宋晓明

:、、、、、、、、、、

杨瑞梅孙圣福周芳夏振强徐超林佳旭黄兵于永乐黄娟秦志华栾伟丽李明义李桂梅

、、、、、、、、、、、、、

刘丽蓉李健马凤龙张传美李然栋温建新秦晓冰马晶

、、、、、、、。

本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为

:

年首次发布为

———2011GB/T27533—2011;

本次为第一次修订

———。

Ⅲ

GB/T27533—2024

引言

犬细小病毒病是由犬细小病毒感染引起

(canineparvovirusdisease,CP)(canineparvovirus,CPV)

的犬科和鼬科动物的一种传染病该病以剧烈呕吐出血性肠炎白细胞显著减少以及心肌炎为主要特

。、、

征分为肠炎型和心肌炎型两种类型以上的临床病例为肠炎和心肌炎混合型我国将其列为三类

,,50%。

动物疫病

。

犬细小病毒属于细小病毒科Parvoviridae细小病毒属Parvovirus是一种无包膜单链

(),(),DNA

病毒与猫泛白细胞减少症病毒水貂肠炎病毒等细小病毒的核苷酸同源性超过

。CPV(FPLV)、(MEV)

对不同分离株的基因序列分析发现易通过抗原漂移产生新的突变株有个亚型

98%。,CPV,4:

和能凝集恒河猴仓鼠猪马和猫的红细胞不能凝集人牛

CPV-2、CPV-2a、CPV-2bCPV-2c。CPV、、、,、、

羊兔鼠和鸡红细胞所以血凝特异性也是鉴定该病毒的参考指标之一该病容易与犬瘟热犬冠状病

、、,。、

毒感染等疾病相混淆需要结合临床诊断和实验室检测进行确诊

,。

Ⅳ

GB/T27533—2024

犬细小病毒病诊断技术

1范围

本文件描述了犬细小病毒病的临床诊断样品采集处理与保存以及胶体金免疫层析法病毒分离

、、、

鉴定血凝与血凝抑制试验荧光等方法

、、PCR、PCR。

本文件适用于犬细小病毒病的诊断和监测

。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款其中注日期的引用文

。,

件仅该日期对应的版本适用于本文件不注日期的引用文件其最新版本包括所有的修改单适用于

,;,()

本文件

。

分析实验室用水规格和试验方法

GB/T6682

实验室生物安全通用要求

GB19489

兽医诊断样品采集保存与运输技术规范

NY/T541、

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义

。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件

。

黑洞淬灭剂

BHQ:(blackholequencher)

犬细小病毒病

CP:(canineparvovirusdisease)

细胞病变效应

CPE:(cytopathiceffect)

犬细小病毒

CPV:(canineparvovirus)

循环阈值

Ct:(cyclethreshold)

焦碳酸二乙酯

DEPC:(diethylpyrocarbonate)

改良培养基

DMEM:dulbecco’seagle(dulbecco’smodifiedeaglemedium)

脱氧核糖核苷三磷酸

dNTP:(deoxyribonucleosidetriphosphate)

乙二胺四乙酸

EDTA:(ethylenediaminetetraaceticacid)

羧基荧光素

FAM:6-(6-carboxyfluorescein)

血凝单位

HAU:(hemagglutinationunit)

磷酸盐缓冲盐水

PBS:(phosphatebufferedsaline)

聚合酶链式反应

PCR:(polymerasechainreaction)

5生物安全措施

进行样品采集处理及保存等操作时按照的规定执行本文件中涉及的实验室生物安

、NY/T541。

1

GB/T27533—2024

全操作按照的规定执行

GB19489。

6临床诊断

61流行病学

.

611主要感染犬也可见于狐狼貂等其他犬科动物和鼬科动物不同年龄性别及品种的犬

..CPV,、、。、

均可感染其中月龄月龄的幼犬最易感纯种犬发病率病死率均高于杂交犬

,2~6,、。

612该病传染源主要为发病动物和隐性带毒动物

..。

613主要通过消化道传播分泌物排泄物中含有大量病毒该病一年四季均可发生以冬春

..CPV,、。,、

季多发

。

62临床症状

.

621潜伏期为周周病初食欲减退或废绝表现为迅速消瘦倦卧不起目光呆滞眼窝下陷腹

..1~2,,,,,,

围紧缩机体脱水皮肤干燥皮肤弹性降低

,,,。

622心肌炎型主要表现为呻吟干咳黏膜发绀呼吸极度困难心有杂音心跳加快常在数小时内

..:、,,,,,

死亡

。

623肠炎型首先出现呕吐呕吐出白色泡沫或黄色液体继而腹泻粪便稀薄且恶臭呈喷射状剧烈

..:,;,,

腹泻粪便呈红色混有大量黏液或假膜后期排番茄汁样稀便并有特殊的腥臭味脱水很快休克

,,;,;,。

63血常规检查

.

白细胞总数明显减少多数在9以下少数在9以下当白细胞在9以

,5×10/L,2×10/L,2×10/L

下则预后不良如果继发细菌感染白细胞总数可增高

,。,。

64病理变化

.

641剖检病理变化

..

6411心肌炎型病变主要见于肺脏和心脏肺脏水肿局灶性充血出血肺表面色彩斑驳呈斑块

...:。,、,,

形状心脏高度扩张水肿表面有出血斑点心房和心室内有瘀血块心肌松弛无力无弹性有出血

。、,。,、、

性斑纹

。

6412肠炎型病变主要见于小肠的空肠回肠肠道内有酱油色液体小肠壁变厚浆膜暗红色黏

...:、,,。,

膜坏死脱落绒毛萎缩肠系膜淋巴结充血出血肿胀

、、。、、。

642组织病理变化

..

6421心肌炎型心肌和心内膜有非化脓性坏死灶肌纤维变性坏死受损的心肌细胞中常有嗜酸性

...:,、,

核内包涵体

。

6422肠炎型空肠回肠黏膜上皮细胞变性坏死脱落有些变性或完整的上皮细胞内含有嗜酸性

...:、、、,

核内包涵体绒毛萎缩隐窝肿大充满炎性渗出物肠腺消失残存腺体扩张内含坏死的细胞碎片

。,、。,,。

65结果判定

.

651对于发病动物符合中描述的个及以上的流行病学特征且出现中个及以上的临床

..,6.12,6.22

症状或出现中血常规结果可判为疑似对于病死动物可进一步进行病理学检查观察到中

,6.3,CP;,6.4

描述的任一剖检病理变化或任一组织病理变化可判为疑似

,CP。

652疑似病例应采集相应样品按照第章第章中的实验室方法进行检测

..,9~12。

2

GB/T27533—2024

7样品采集处理与保存

、

71采样器材

.

711器械

..

组织研磨器医用剪刀解剖刀穿刺针医用注射器及真空采血管真空采血管含

、、、、(2mL、5mL)、(

抗凝剂无菌棉签拭子等

EDTA)、。

712容器

..

样品保存管离心管自封袋等

、(1.5mL、10mL)、。

713采样试剂

..

7131按照附录中配制

...0.01mol/LpH7.4PBS,AA.1。

7132青链霉素贮存液按照配制

...,A.2。

714个人防护用品

..

工作服一次性手套等

、。

715采样记录用品

..

采样记录单记号笔防水标签等

、、。

72样品采集与处理

.

721血液样品

..

用一次性采血针采集全血或用含有抗凝剂的真空采血管在动物的前后肢皮下静脉采血

EDTA,、。

非抗凝血待凝固后分离血清抗凝血可离心分离出血浆用于的胶体金免疫层析法血凝与血凝

,。CPV、

抑制试验荧光检测

、PCR、PCR。

722口眼鼻分泌物和粪便样品

..

用无菌棉签拭子取样轻轻刮取双侧眼结膜分泌物或蘸取鼻液口咽分泌物或在直肠末端旋转三

,;、;

圈或取少量粪便样品将上述拭子放入含有其中每中加入青链霉素

。1mLPBS(100mLPBS0.2mL

贮存液的样品保存管中搅拌片刻后掰断拭子尾部拧紧盖子离心后取上清

),,,。3000r/min20min,

液待检用于的胶体金免疫层析法病毒分离鉴定血凝与血凝抑制试验荧光检测

,。CPV、、、PCR、PCR。

723组织样品

..

用无菌剪刀采集小肠等组织剪碎后加入其中每中加入青

2g,10mLPBS(100mLPBS0.2mL

链霉素贮存液充分研磨制成组织悬液离心后取上清液待检用于的

),。3000r/min20min,,。CPV

病毒分离鉴定血凝与血凝抑制试验荧光检测

、、PCR、PCR。

73样品保存

.

采集的样品应在条件下保存用于病毒分离的样品应在内运至实验室不能立即进行检

4℃,48h。

测的样品应保存于冰箱长期保存应置于冰箱

-20℃,-70℃。

3

GB/T27533—2024

8胶体金免疫层析法

81器材与试剂

.

胶体金抗原检测卡

CPV。

82样品处理

.

821血液样品

..

将中采集到的血清或血浆滴滴约与样品稀释液混合置于样品处理管

7.2.11~2(20μL~40μL),

中待检

,。

822口眼鼻分泌物和粪便样品

..

将中采集到的棉签拭子放入样品稀释液中振荡混匀使样品充分溶解静置使大颗

7.2.2,,,10min

粒沉降至试管底部取上层液体待检

,,。

83操作方法

.

831用配套的滴管吸取滴滴约待检样品缓慢滴加至样品孔中当看到红色液

..3~4(60μL~80μL),,

体在试纸条上移动时放慢加样速度整个加样过程控制在内完成

,,1min。

832加样完成后将试纸条平放在桌面上静置后在内判读结果

..,,10min,20min。

84结果判定

.

841对照线显示红色则试验成立结果有效

..(C),,。

842对照线和检测线均显色判为疑似阳性需用采用第章第章中的任一方法

..(C)(T),CPV,9~12

进行确诊

。

843仅有对照线显色判为阴性

..(C),CPV。

9病毒分离鉴定

91器材

.

911冰箱

..(4℃、-20℃、-70℃)。

912二氧化碳培养箱

..(37℃)。

913倒置显微镜

..。

914电子天平精度

..:0.1mg。

915微量可调移液器

..(100μL~1000μL、20μL~200μL、1μL~20μL)。

916细胞培养瓶2或2等

..(25cm75cm)。

917微孔滤器

..0.22μm。

92试剂

.

921试验用水符合的规定

..,GB/T6682。

922培养液按照配制

..DMEM,A.3。

923新生牛血清

..。

924细胞猫肾细胞系

..FK81()。

4

GB/T27533—2024

93操作方法

.

931细胞培养

..

用含新生牛血清的培养液在2细胞培养瓶中培养细胞置于

6mL8%DMEM25cmFK81,37℃、

体积分数二氧化碳培养箱中培养可进行待检样品接种

5%(),。

932样品接种

..

采用同步接种方法取或中处理好的样品上清液经微孔滤器过滤接种

,7.2.27.2.31mL,0.22m,

于细胞置于体积分数二氧化碳培养箱中培养每天在倒置μ显微镜下观察细胞状态

FK81,37℃、5%(),

并记录细胞病变结果连续观察

,3d~5d。

933病毒培养

..

在细胞上培养一般培养后出现细胞变圆拉丝脱落等如果样品初次

CPVFK81,3d~5d,、CPE。

接种细胞培养后无应取细胞培养瓶中的细胞培养液移入新的细胞培养瓶内

FK81,5dCPE,1mL,

第代置于体积分数二氧化碳培养箱中培养每天在倒置显微镜下观察细胞状态并

(2),37℃、5%()5d,

记录细胞病变结果是否出现无的样品培养物应盲传代

,CPE。CPE5。

94病毒鉴定

.

若细胞在初次接种样品或盲传代后出现将细胞培养瓶用封口膜封口后放入冰箱

5CPE,-70℃

中反复冻融两次后取细胞培养液置于离心管中离心后取上清液待

,,10mL,4℃3000r/min20min,

检采用第章第章中的任何一章描述的方法进行鉴定

。10~12,CPV。

95结果判定

.

951初次接种样品或盲传代后出现并经第章第章任一方法检测结果为阳性判为

..5CPE,10~12,,

分离阳性

CPV。

952初次接种样品和盲传代后均未出现或出现但经过第章第章任一方法检

..5CPE,CPE10~12,

测结果为阴性判为分离阴性

,CPV。

10血凝与血凝抑制试验HA/HI

()

101器材

.

1011冰箱

..(4℃、-20℃、-70℃)。

1012恒温培养箱

..(5℃~100℃)。

1013微型混合器

..。

1014孔形微量反应板

..96V。

102试剂

.

1021按照配制

..PBS,A.1。

1022猪红细胞悬液按照配制

..1%,A.4。

1023标准阳性血清

..CPV。

103血凝试验HA

.()

1031在孔形微量反应板上第孔第孔中加入

..96V,1~1225μLPBS。

5

GB/T27533—2024

1032取中处理好的待检样品加入左侧第孔混合均匀后吸出至第孔混合均

..7.225μL1,,25μL2,

匀后吸出至第孔依次倍比稀释至第孔混合均匀后吸出弃掉第孔作为

,25μL3,,11,,25μL,12

对照孔

PBS。

1033每孔加

..25μLPBS。

1034由左至右依次向每孔加入猪红细胞悬液置于微型混合器上振荡使红细胞与待

..25μL1%,10s,

检样品充分混合在条件下静置待对照孔红细胞呈显著纽扣状时可观察

,4℃30min~60min,PBS

结果

。

1035结果判定将孔形微量反应板倾斜观察红细胞有无泪珠状流淌以使红细胞凝集

..:96V,。100%

完全无泪珠状流淌的最高稀释倍数作为该病毒的血凝效价即一个血凝单位判定待检样品的病毒血

(),,

凝效价

。

104血凝抑制试验HI

.()

1041根据中测定的病毒血凝效价配制个血凝单位病毒液若血凝的终点滴度

..10.3.5,4(4HAU)。

为则即即通过稀释获得病毒液

1∶256,4HAU=256/4=64(1∶64),1∶644HAU。

1042在孔形微量反应板上第孔第孔中各加入在第孔加入

..96V,1~1125μLPBS。1250μL

作为红细胞对照

PBS。

1043取阳性血清加入左侧第孔混合均匀后吸出至第孔依此倍比稀释至

..25μLCPV1,,25μL2,

第孔从第孔中吸出弃掉

10,1025μL。

1044第孔第孔中加入中配制的病毒液置于微型混合器上振荡混

..1~1110.4.14HAU25μL,10s,

合均匀在条件下静置第孔作为病毒液对照

,37℃60min。114HAU。

1045由左至右依次向每孔加入猪红细胞悬液置于微型混合器上振荡混合均匀在

..25μL1%,10s,,

条件下静置待第孔病毒液对照孔出现红细胞凝集时可观察

4℃30min~60min,114HAU100%

结果

。

1046结果判定将孔形微量反应板倾斜观察病毒液血凝性是否被阳性血清特

..:96V,4HAUCPV

异性抑制红细胞有无泪珠状流淌当病毒液对照孔红细胞完全凝集对照孔红细胞呈现

,。4HAU,PBS

泪珠状流淌则试验成立

,。

能被阳性血清抑制血凝者判为阳性不能被阳性血清抑制血凝者判为

CPV,CPV;CPV,CPV

阴性

。

11PCR

111器材

.

1111冰箱

..(4℃、-20℃、-70℃)。

1112仪

..PCR。

1113高速冷冻离心机离心速度以上

..(4℃、12000r/min)。

1114稳压稳流电泳仪和水平电泳槽

..。

1115凝胶成像系统

..。

1116微量可调移液器

..(100μL~1000μL、20μL~200μL、1μL~20μL)。

1117无酶离心管与带滤芯吸头

..DNA。

112试剂

.

1121试剂提取试剂也可用商品化提取试剂盒或其他等效提

..DNAisoReagent:DNA,DNA,DNA

取试剂和方法如自动化核酸提取仪和其他配套核酸抽提试剂进行核酸提取

,。

6

GB/T27533—2024

1122无水乙醇

..。

1123水按照配制

..DEPC(0.1%),A.5。

1124相关试剂可选择商品化试剂盒操作步骤按照说明书进行

..PCR:,。

1125Taq酶及倍Taq酶反应缓冲液Taq酶浓度为保存

..10:5U/μL,-20℃。

1126含各保存

..dNTP:dATP、dGTP、dCTP、dTTP10mmol/L,-20℃。

1127电泳缓冲液按照配制

..5×TBE,A.6。

113CPV阴性对照制备

.

用水作为阴性对照

DEPCCPV。

114CPV阳性对照制备

.

用的细胞培养物作为阳性对照

CPVCPV。

115操作方法

.

1151引物设计

..

用于检测的引物序列见附录中

CPVBB.1。

1152DNA提取

..

11521取中处理好的待检样品上清液置于无酶离心管中加入

...7.2500μL1.5mLDNA,500μL

试剂颠倒混匀次次静置约后离心

DNAisoReagent,6~8,10min,12000r/min10min。

11522取上清液至少至新的无酶离心管中每管加入无水乙醇颠

...(500μL)1.5mLDNA,400μL,

倒混匀次次离心

6~8