CN113841202B 用于crispr选择的方法和系统 （瑞泽恩制药公司）

2021.11.10PCT/US2020/0231522020.03.17WO2020/190944EN2020.09.24gRNAlibraries.SCIENTIFICREP本发明描述了用于CRISPR正向选择的方法和系统。CRISPR正向选择使用DNA测序来鉴定2(A)用病毒载体的文库感染cas9阳性细胞的第一培养物，所述文库包含至少3个向导对所述细胞进行测序以获得所述gRNA中的每将所述第二培养物的所述细胞分类为具有指定表型或不具有所选择具有所述指定表型的细胞并且对所选细胞进行测序以获得所述gRNA中的每个的确定选择后读段计数超过所述背景阈值的所选细胞中的每个DNA靶标区域的相应gRNA′′根据在所选细胞中偶然观察到所述基因的n个或更多个gRNA的概率来鉴定所述基因是(A)用病毒载体的文库感染cas9阳性细胞的第一培养物，所述文库包含至少3个向导对所述细胞进行测序以获得所述gRNA中的每将所述第二培养物的所述细胞分类为具有指定表型或不具有所选择具有所述指定表型的细胞并且对所选细胞进行测序以获得所述gRNA中的每个的确定选择后读段计数超过所述背景阈值的所选细胞中的每个DNA靶标区域的相应gRNA3//根据在所选细胞中偶然观察到所述基因的n个或更多个gRNA的概率来鉴定所述基因是4.如权利要求1或2所述的方法，其中所述第一培养物的所述cas-9阳性细胞被修饰为13.如权利要求1或2所述的方法，其中将所述第二培养物的细胞分类为具有所述指定表型或不具有所述指定表型包括将选择机制应用于所述第二/个或更多个gRNA的概率来鉴定所述靶标区域17.如权利要求16所述的方法，其中鉴定所述靶标区域是正向选择的包括确定在所选/21.如权利要求20所述的方法，其中所述失活的cas-9与至少一个转录活化结构域融23.如权利要求22所述的方法，其中调控下游基因或蛋白质包括所述下游基因或蛋白4个或更多个gRNA的概率来将所述靶标区域鉴定为第二基因个或更多个gRNA的概率来将所述靶标区域鉴定个或更多个gRNA的概率来将所述靶标区域鉴定为与所述指定个或更多个gRNA的概率来将所述靶标区域鉴定为表现出保护根据对于DNA的多个靶标区域中的每个，在用包含至少3个向导RNA(gRNA)的文库的载根据对于所述DNA的多个靶标区域中的每个的所述相应gRNA数量，确定读段计数超过所述背景阈值的所述DNA的多个靶标区域中的所有靶标区域中存在于所述第一细胞群中的根据对于所述DNA的多个靶标区域中的每个，在用包含所述至少3根据对于所述DNA的多个靶标区域中的每个的所述相应gRNA数量，确定读段计数超过所述背景阈值的所述DNA的多个靶标区域中的所有靶标区域中存在于所述第二细胞群中的其中计算从y个对象中选择x个对象的方法数；对于包含所关注的序列的靶标区域，根据公式并根据在所选细胞中偶然观察到所述靶标区域的n’个gRNA的概率来确定在所选细胞中偶然观察到所关注的序′′根据在所选细胞中偶然观察到所关注的序列的n个或更多个gRNA的概率来鉴定所关注29.如权利要求28所述的方法，其中所述第一细30.如权利要求29所述的方法，其中根据对于5对于所述DNA的多个靶标区域中的每个，对读段计数超过所述背景阈值的每个gRNA进31.如权利要求30所述的方法，其中根据对于所gRNA数量，确定读段计数超过所述背景阈值的所述DNA的多个靶标区域中的所有靶标区域中存在于所述第一细胞群中的gRNA的总数(N)包括对读段计数超过所述背景阈值的所述第32.如权利要求31所述的方法，其中根据对于所述DN将所述第二细胞群的细胞分类为具有指定表型或不具有所对于所述DNA的多个靶标区域中的每个，对读段计数超过所述背景阈值的每个gRNA进33.如权利要求28-32中任一项所述的方法，其中根据对于所述DNA的多个靶标区域中的每个的相应gRNA数量，确定读段计数超过所述背景阈值的所述DNA的多个靶标区域中的所有靶标区域中存在于所述第二细胞群中的gRNA的总数(N’)包括对读段计数超过所述背景阈值的所述第二细胞群的所选细胞中存在的每个gRN34.如权利要求28-32中任一项所述的方法35.如权利要求28-32中任一项所述的方法，其中对于包含所关注的序列的靶标区域，根据在所选细胞中偶然观察到所述靶标区域的n’个gRNA的概率来确定在所选细胞中偶然//36.如权利要求28-32中任一项所述的方法，/的序列的n个或更多个gRNA的概率来鉴定所关注的序列是正向选择的包括确定在所选细/胞中偶然观察到所关注的序列的n个或更多39.如权利要求29-32中任一项所述的方法，其中所述cas-9阳性细胞包含失活的cas-640.如权利要求39所述的方法，其中所述失活的cas-9与至少一个转录活化结构域融存储处理器可执行指令的存储器，所述处理器可执行指令在用病毒载体的文库感染cas9阳性细胞的第一培养物，所述文库包含至少3个向导RNA对所述细胞进行测序以获得所述gRNA中的每根据所述第一读段计数数据，确定读段计数超过背景阈值的每个DNA靶标区域的相应根据所述第一读段计数数据，确定读段计数超过所述背景阈值的所有靶标区域中的选择具有所述指定表型的细胞并且对所选细胞进行测序以获得所述gRNA中的每个的根据所述第二读段计数数据，确定选择后读段计数超过所述背根据所述第二读段计数数据，确定读段计数超过所述背景阈值的//根据在所选细胞中偶然观察到所述基因的n个或更多个gRNA的概率来鉴定所述基因是43.如权利要求41-42中任一项所述的装置，其中所述第一培养物的所述cas-9阳性细745.如权利要求41-42中任一项所述的装置，其中将所述所述指定表型或不具有所述指定表型包括将选择机制应用于所述第二细胞47.如权利要求41-42中任一项所述的装置，其中选择具有48.如权利要求41-42中任一项所述的装置，其还包括根据/述基因的n个或更多个gRNA的概率来鉴定所述49.如权利要求48所述的装置，其中鉴定所述靶标区域是正向选择的包括确定在所选/52.如权利要求41-42中任一项所述的装置，其中所述cas-9阳性细胞包含失活的cas-53.如权利要求52所述的装置，其中所述失活的cas-9与至少一个转录活化结构域融54.一种用于确定偶然观察到一个或多个向导RNA(gRNA)的概率的非暂时性计算机可用病毒载体的文库感染cas9阳性细胞的第一培养物，所述文库包含至少3个向导RNA对所述细胞进行测序以获得所述gRNA中的每根据所述第一读段计数数据，确定读段计数超过背景阈值的每个DNA靶标区域的相应根据所述第一读段计数数据，确定读段计数超过所述背景阈值的所有靶标区域中的选择具有所述指定表型的细胞并且对所选细胞进行测序以获得所述gRNA中的每个的根据所述第二读段计数数据，确定选择后读段计数超过所述背根据所述第二读段计数数据，确定读段计数超过所述背景阈值的8′′根据在所选细胞中偶然观察到所述基因的n个或更多个gRNA的概率来鉴定所述基因是55.如权利要求54所述的非暂时性计算机可读介质，其中所述第一培养物根据CRISPR56.如权利要求54-55中任一项所述的非暂时57.如权利要求54-55中任一项所述的非暂时性58.如权利要求54-55中任一项所述的非暂时性物的细胞分类为具有所述指定表型或不具有所述指定表型包括将选择机制应用于所述第59.如权利要求58所述的非暂时性计算机可读介质，其中所述选择机制包括以下一者60.如权利要求54-55中任一项所述的非暂时性计定表型的细胞包括根据所述一个或多个选择性标记对61.如权利要求54-55中任一项所述的非暂时性计′细胞中偶然观察到所述基因的n个或更多个gRNA的概率来鉴定所述靶标区域是正向选择62.如权利要求61所述的非暂时性计算机可读介质，其中鉴定所述靶标区域是正向选′择的包括确定在所选细胞中偶然观察到所关注的序列的n个或更多个gRNA的概率满足阈63.如权利要求54-55中任一项所述的非暂时性计算机可读介质，其还包括确定每个64.如权利要求63所述的非暂时性计算机可读介质，其中确定每个gRNA的所述富集分65.如权利要求54-55中任一项所述的非暂时性计算机可读介质，其中所述cas-9阳性66.如权利要求65所述的非暂时性计算机可读介质，其9存储处理器可执行指令的存储器，所述处理器可执行指令在执行时使得所述装置执行如权利要求28-40中[0002]本申请要求2019年3月18日提交的美国临时申请号62/820,106的权益，该临时申[0003]成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)-Cas9技术已经彻底改变了基因组工程。送方法的开发使基因组规模的CRISPR/Cas9敲除文库的产生成为可能。这些文库允许对哺乳动物细胞系进行负向和正向选择筛选。在CRISPR/Cas9敲除筛选中，每个基因都被若干gRNA靶向，并且携带不同基因敲除的突变库可以通过高通量测序来确定。CRISPR活化[0004]全基因组CRISPR/Cas9敲除或基因活化技术是一种有效的基因扰动筛选技术。目[0008]在一个实施方案中，一种方法包括(A)用病毒载体的文库感染cas9阳性细胞的第靶标区域的n’个gRNA的概率，其中计算从y个对象中选择x个对象的方法述DNA的多个靶标区域中的每个的所述相应gRNA数量，确定读段计数超过所述背景阈值的所述DNA的多个靶标区域中的所有靶标区域中存在于所述第一细胞群中的gRNA的总数(N)，相应gRNA数量，确定读段计数超过所述背景阈值的所述DNA的多个靶标区域中的所有靶标对于包含所关注的序列的靶标区域，根据在所选细胞中偶然观察到所述靶标区域的n’个及根据在所选细胞中偶然观察到所关注的序列的n/个或更多个gRNA的概率来鉴定所关注借助于所附权利要求中特别指出的要素和组合[0015]图4显示了一个存储四个假设基因的人工读段计数的示例性数据结构，其中每个[0016]图5显示了一个存储所公开的方法的人工数据和人工结果的示例性数据结构，据[0017]图6显示了涉及大约21,000个基因(G#)[0018]图7显示了在细胞培养的三天(d03)、六天(d06)和十天(d10)的多个平行实验GeckoA和B文库的构成显示为包括特定基因靶向gRNA、特定微RNA靶向gRNA和非靶向gRNA[0020]图9显示了图8所示的实验中的GeckoA文库的读段计数的归一化，归一化基于读使用GeckoA文库gRNA来计算第10天(选择后)筛选的五种Cas蛋白(即，Cas蛋白变体)或者野生读段计数超过背景阈值的每个DNA靶标区域的相应gRNA数量进行求和(Σ)(Σ=n)以及对述病毒载体的文库感染cas9阳性细胞的第二培养物140，将所述第二培养物的所述细胞分类为具有指定表型或不具有指定表型150，选择具有所述指定表型的细胞并且对所选细胞进行测序以获得所述gRNA中的每个的选择后读段计数160，对选择后读段计数超过所述背的DNA的靶标区域，根据公式来计算在所选细胞中偶然观察到所述基因的胞的基因组内的DNA的靶标区域的转录，对所述细胞进行测序以获得所述gRNA中的每个的(Σ=n)以及对读段计数超过所述背景阈值的所有靶标区域中的gRNA总数进行求和(Σ)物的所述细胞分类为具有指定表型或不具有指定表型150，选择具有所述指定表型的细胞并且对所选细胞进行测序以获得所述gRNA中的每个的选择后读段计数160，对选择后读段计数超过所述背景阈值的所选细胞中的每个DNA靶标区域的相应gRNA数量进行求和(Σ)的DNA的靶标区域，根据公式来计算在所选细胞中偶然观察到所述基因的文库可以是敲除文库，包括例如包括一个或多个靶向基因组中的每个基因的gRNA(例如，(GeCKO)文库。参见例如ShalemO等人(2014)Science343:84-7和SanjanaNE等人(2014)选择gRNA来靶向特定信号传导通路中的基因。gRNA文库可以使用范围更广的感染复数[0034]在一个实施方案中，cas阳性细胞可以包含用于切割DNA的靶标区域的cas蛋白或用于调控转录(例如增强或抑制转录)的cas蛋白。用于切割DNA的靶标区域的cas蛋白可以实施方案中公开了包含具有野生型活性的cas-9或失活的cas-9的cas-9阳性细胞。失活的cas-9可以例如与至少一个转录活化结构域融合。一个或多个gRNA可以结合至所关注的基一培养物的cas-9阳性细胞可以被修饰为含有一个或多个选择性标记。选择性标记系统可量增加可以表示调控Tau的基因。已知通路(特别是疾病通路)中的存在任何数量的蛋白质如，被表达)时导致使细胞可视化或将细胞鉴定为含有该标记的属性或表型的生物学特征型黄色荧光蛋白(eYFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、增强型蓝色荧光蛋白(eBFP)、DsRed、素(新霉素)抗性可以用作选择吸纳有携带编码细菌卡那霉素抗性的基因(例如，酶新霉素选可以精确定位多能性或分化为不同细胞类型所需进行测序，以在选择前产生读段计数(第一培养物的细胞)并且在选择后产生读段计数(第感染后10天对第二培养物的所选细胞进行测序。可以使用任何可用的测序技术(诸如NGS)的gRNA之间以及重复序列之间具有一定程度的同质性/一致性。这些现有方法无法处理的gRNA总和数和所有靶标区域中的gRNA总数的步骤表示读段计数处理对读段计数的较大一化来进行归一化。参见Anders,S.和Huber,W.(2010)Differentialexpression阈值的所选细胞中的每个DNA靶标区域的相应的gRNA数(n’)的总和(Σ)(例如图2；203，208)。所述方法还可以包括确定读段计数超过背景阈值的所选细胞的所有靶标区域中的以分析包括读段计数的序列数据以确定每个DNA的靶标区域(例如基因)的选择后“存在之gRNA的单个读段计数与背景阈值进行比较来确定。确定读段计数超过背景阈值的每个DNA不具有指定表型；选择具有指定表型的细胞并且对所述选择的细胞进行测序以获得所述鉴定靶标区域是正向选择的包括确定在所选细胞中偶然观察到所关注的序列的n’个或更开的方法还包括根据在所选细胞中偶然观察到基因的n'个或更多个gRNA的概率来将靶标[0056]在一个示例性实施方案中，所述方法和系统可以在如图3所示和下文所述的计算将操作环境解释为对示例性操作环境中示出的任一部件或其组合有任何依赖计算机或其他设备执行的计算机可执行指令(例如程序模块)的一般背景下进行描述。通个处理器303的各个系统部件耦合到系统存储器312的系统总线313。该系统可以利用并行[0060]系统总线313代表几种可能类型的总线结构中的一种或多种，包括使用各种总线313和本说明书中指定的所有总线也可以通过有线或无线网络连接来实施，并且每个子系储器312通常包含数据诸如数据307和/或程序模块诸如操作系统305和软件306，其可由一个数据库中。此类数据库的实例包括DB2®、MICROSOFT®Access、SQLServer、ORACLE@、和/或MYSQLB、POSTGRESQL&.数据库可以集中或分布据。计算机301可以接收例如在分别地图1和图2的步骤160和207处产生的第二读段计数数[0068]软件306的实现可以存储在某种形式的计算机可读介质上或通过某种形式的计算[0069]软件306可以被构造为执行本文公开的方法的一些或所有步骤。在一个实施方案中，软件306可以被构造为根据对于DNA的多个靶标区域中的每个，在用包含至少3个向导所述DNA的多个靶标区域中的每个所存在的相应gRNA数量(n)，根据对于所述DNA的多个靶标区域中的每个的所述相应gRNA数量，确定读段计数超过所述背景阈值的所述DNA的多个靶标区域中的所有靶标区域中存在于所述第一细胞群中的gRNA的总数(N)，根据对于所述胞群进行的测序，确定读段计数超过所述背景阈值的所述DNA的多个靶标区域中的每个所量，确定读段计数超过所述背景阈值的所述DNA的多个靶标区域中的所有靶标区域中存在细胞中偶然观察到所关注的序列的n/个或更多个gRNA的概率来鉴定所关注的序列是正向[0070]根据对于所述DNA的多个靶标区域中的每个的相应gRNA数量，确定读段计数超过背景阈值的所述DNA的多个靶标区域中的所有靶标区域中存在于第一细胞群中的gRNA的总数(N)可以包括对读段计数超过背景阈值的第一细胞群中存在的每个[0071]根据对于所述DNA的多个靶标区域中的每个的相应gRNA数量确定读段计数超过背景阈值的所述DNA的多个靶标区域中的所有靶标区域中存在于第二细胞群中的gRNA的总数(N’)可以包括对读段计数超过背景阈值的第二细胞群的所选细胞中存在的每个gRNA进行的n’个向导的概率来确定在所选细胞中偶然观察到所关注的序列的n/个或更多个gRNA的[0074]根据在所选细胞中偶然观察到所关注的序列的n/个或更多个gRNA的概率来鉴定所关注的序列是正向选择的可以包括确定在所选细胞中偶然观察到所关注的序列的n/个[0075]软件306还可以被构造为确定每个gRNA的富集分数。确定每个gRNA的富集分数可以包括评估N/N'。[0076]软件306可以被构造为存储以数据307存在的gRNA的读段计数和数量。图4展示了[0080]读段计数超过背景阈值的所选细胞中存在的所有靶标区域中的gRNA总数或N'可4gRNA的数量)并且实验2的细胞群中保留了13,606个gRNA(N')(独特gRNA的数量，而不是[0085]为了鉴定改变异常tau蛋白聚集过程的基因和通路，开发了一个用于使用CRISPR核酸酶(CRISPRn)sgRNA文库进行全基因组筛选的平台，所述筛选用于鉴定调控细胞被tau稳定表达与荧光蛋白CFP或荧光蛋白YFP融合的疾病相关蛋白变体的转基因：tau4RD-CFP/毒载体引入表达Cas9的转基因(SpCas9)来修饰这些tau生物传感器细胞。用杀稻瘟素来选择表达Cas9的克隆转基因细胞系，并且通过克隆连续稀释分离以获得单细胞衍生的克隆。4RD包含与YFP融合的P301S致病性[0090]通过用重组原纤维化tau与lipofectamine试剂混合处理这些tau-YFP细胞来获得以鉴定克隆细胞系，其中tau-YFP聚集体随时间推移在所有细胞中稳定持续生长和多次传条件培养基在大约0.1％的细胞中持续诱导FRET，所述流式细胞术评估产生FRET信号作为[0092]为了揭示作为FRET(+)细胞中富集的sgRNA的tau聚集的修饰基因，用两个人全基因组CRISPRsgRNA文库(GeCKOA和GeCKOB)来转导无聚集体的表达Cas9的tau-CFP/tau-每个CRISPRsgRNA文库靶向5'组成型外显子以进行功能性敲除，每个基因平均覆盖约3个的错配的sgRNA来避免脱靶效应。这些文库涵盖19,050个人类基因和1864个miRNA，以及1000个非靶向对照sgRNA。文库以Tau生物传感器细胞在嘌呤霉素选择下生长，以选择每个细胞整合和表达独特sgRNA的细[0093]在转导后第3天和第6天的细胞传代时收集完整的转导细胞群的样品。在第6天传的DNA分离和PCR扩增允许在每个时间点通过下一代测序(NGS)对sgRNA库在每个样品中使用DESeq算法产生sgRNA读段计数，以发现第10天比第3天丰度更高或第10验p<0.01)。Fc≥1.5表示比率(第10天计数的平均值)/(第3天或第6天计数的平均值)≥应于该基因的sgRNA被视为在一个比较中具有显著性(第10天与第3天或第10天与第6天)；[0098]然而，该第一策略要求每个实验组内的一定读段计数同质性水平可能过于严导的正出现(读段计数>30)而不是精确读段计数来使FRET荧光)根据表型对细胞群中的细胞进行分选。如果Cas9/CRISPR切割细胞的靶标区域每个DNA的靶标区域存在的gRNA的相应的数量，通过将每个gRNA的单个读段计数与背景阈数量，与读段计数表示的存在的gRNA的数量形成对比。对应于基因G1的gRNA的存在之和为为1，因为仅gRNAg7的读段计数超过背景阈值30。读段计数超过背景阈值的细胞群中存在[0104]一旦确定偶然观察到所选细胞(选择后)中的靶标区域的n/个或更多个gRNA的概[0105]偶然观察到所选细胞(选择后)中的靶标区域的n/个或更多个gRNA的概率可以用胞(选择后)中的靶标区域的n/个或更多个gRNA的概率的靶标区域可以被鉴定为正向选择要求同一基因的sgRNA之间以及技术重复之间具有一定程度的同质性/一致性，效果不佳。计数以及其他具有相同表型的sgRNA的存在)，这些方法无法处理同一基因的sgRNA和重复使用来自多个实验的p值来计算检验统计量其中pk是针对第k个实验[0112]CRISPR/Cas9活化和失活诱变被用于使用CRISPRnsgRNA文库(hGeCKO-A和hGeCKO-B)(靶向编码外显子以进行功能敲除)来筛选Tau和α-突触核蛋白原纤维化和增殖[0116]图8显示了来自GeckoA文库感染的样品的DNA读段计数。每个条柱表示病毒感染用gRNA读段计数除以每个样品中的读段计数的总和并除乘以所有样品中的读段计数的总[0122]对读段计数超过背景阈值的每个DNA靶标区域的相应gRNA数量进行求和(Σ)，其具有所述指定表型的细胞并且对所选细胞进行测序以获得所述gRNA中的每个的选择后读[0125]对选择后读段计数超过所述背景阈值的所选细胞中的每个DNA靶标区域的相应[0126]对读段计数超过所述阈值的所选细胞的所有靶标区域中的gRNA总数进行求和[0130]对读段计数超过背景阈值的每个DNA靶标区域的相应gRNA数量进行求和(Σ)，其[0134]选择具有所述指定表型的细胞并且对所选细胞进行测序以获得所述gRNA中的每[0135]对选择后读段计数超过所述背景阈值的所选细胞中的每个DNA靶标区域的相应[0136]对读段计数超过所述阈值的所选细胞的所有靶标区域中的gRNA总数进行求和[0139]实施方案3.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述第一培养物根据[0140]实施方案4.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述第一培养物的所述[0142]实施方案6.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述指定表型是细胞存[0143]实施方案7.如实施方案4所述的方法[0144]实施方案8.如实施方案7所述的方法，其中所述[0145]实施方案9.如实施方案4所述的方法，[0149]实施方案13.如前述实施方案中任一项胞分类为具有所述指定表型或不具有所述指定表型包括将选择机制应用于所述第二细胞[0152]实施方案16.如前述实施方案中任一项偶然观察到所述基因的n/个或更多个gRNA的概率来鉴定所述[0153]实施方案17.如实施方案16所括确定在所选细胞中偶然观察到所关注的序列的n/个或更多个gRNA的概率[0154]实施方案18.如前述实施方案中任一项所述[0155]实施方案19.如实施方案18所述的方法，[0159]实施方案23.如实施方案22所述的方法[0160]实施方案24.如前述实施方案中任一偶然观察到所述基因的n/个或更多个gRNA的概率来将所述靶标区域鉴定为第二基因的修[0161]实施方案25.如前述实施方案中任一项偶然观察到所述基因的n/个或更多个gRNA的概率来将所述靶标[0162]实施方案26.如前述实施方案中任一项偶然观察到所述基因的n/个或更多个gRNA的概率来将所述靶标区域鉴定为与所述指定表[0163]实施方案27.如前述实施方案中任一偶然观察到所述基因的n/个或更多个gRNA的概率来将所述靶标区域鉴定为表现出保护作DNA的多个靶标区域中的每个的所述相应gRNA数量，确定读段计数超过所述背景阈值的所据对于所述DNA的多个靶标区域中的每个，在用包含所述至少3个gRNA的文库的载体感染[0165]根据对于所述DNA的多个靶标区域中的每个的所述相应gRNA数量，确定读段计数超过所述背景阈值的所述DNA的多个靶标区域中的所有靶标区域中存在于所述第二细胞群所关注的序列的n/个或更多个gRNA的概率来鉴定所关注的序列是正[0166]实施方案29.如实施方案28所述的方法，的每个的相应gRNA数量，确定读段计数超过所述背景阈值的所述DNA的多个靶标区域中的所有靶标区域中存在于所述第一细胞群中的gRNA的总数(N)包括对读段计数超过所述背景阈值的所述第一细胞群中存在的每个gRN读段计数超过所述背景阈值的所述DNA的多个靶标区域中的每个所存在的相应gRNA数量[0171]实施方案33.如实施方案28-32中任一项个靶标区域中的每个的相应gRNA数量，确定读段计数超过所述背景阈值的所述DNA的多个靶标区域中的所有靶标区域中存在于所述第二细胞群中的gRNA的总数(N’)包括对读段计数超过所述背景阈值的所述第二细胞群的所选细胞中存在的每个gR的概率包括评估其中计算从y个对象中选择x个对象的方法细胞中偶然观察到所关注的序列的n/个或更观察到所关注的序列的n/个或更多个gRNA的概率来鉴定所关注的序列是正向选择的包括确定在所选细胞中偶然观察到所关注的序列的n/个或更多个gRNA的[0176]实施方案38.如实施方案37所述的方法，[0177]实施方案39.如实施方案28-38中任一项所胞的基因组内的DNA的靶标区域，以及对所述细胞进行测序以获得所述gRNA中的每个的读来计算在所选细胞中偶然观察到所述基因的n/个或更多个g[0180]实施方案42.如实施方案41所述的装置，其中胞分类为具有所述指定表型或不具有所述指定表型包括将选择机制应用于所述第二细胞偶然观察到所述基因的n/个或更多个gRNA的概率来鉴定所述[0187]实施方案49.如实施方案48所述的括确定在所选细胞中偶然观察到所关注的序列的n/个或更多个gRNA的概率[0189]实施方案51.如实施方案50所述的[0190]实施方案52.如实施方案41-51中任一项所[0192]实施方案54.一种用于确定偶然观察到一个或多个向导RNA(gRNA)的概率的非暂所述第一读段计数数据，对读段计数超过背景阈值的每个DNA靶标区域的相应gRNA数量进及选择具有所述指定表型的细胞并且对所选细胞进行测序以获得所述gRNA中的每个的选选细胞中偶然观察到所述基因的n/个或更多个gR[0193]实施方案55.如实施方案54所述的非暂述第一培养物的所述cas-9阳性细胞被修饰为含有一个或所述第二培养物的细胞分类为具有所述指定表型或不具有所述指定表型包括将选择机制[0197]实施方案59.如实施方案58所述的非暂时择具有所述指定表型的细胞包括根据所述一个或多个选择性标记对所述括根据在所选细胞中偶然观察到所述基因的n/个或更多个gRNA的概率来鉴定所述靶标区[0200]实施方案62.如实施方案61所述的非区域是正向选择的包括确定在所选细胞中偶然观察到所关注的序列的n/个或更多个gRNA[0202]实施方案64.如实施方案63所述的非暂时性[0204]实施方案66.如实施方案65所述的非暂时性计算机可读介质，其中所述失活的第一细胞群进行的测序，确定读段计数超过背景阈值的所述DNA的多个靶标区域中的每个量，确定读段计数超过所述背景阈值的所述DNA的多个靶标区域中的所有靶标区域中存在所述DNA的多个靶标区域中的每个的所述相应gRNA数量，确定读段计数超过所述背景阈值的所述DNA的多个靶标区域中的所有靶标区域中存在于所述第二细胞群中的gRNA的总数选细胞中偶然观察到所述靶标区域的n’个gRNA的概率来确定在所选细胞中偶然观察到所的n/个或更多个gRNA的概率来鉴定所关注的序列是正[0206]实施方案68.如实施方案67所述的装置，背景阈值的所述DNA的多个靶标区域中的每个所存在的相应gRNA数量(n)，使得所述装置：[0208]实施方案70.如实施方案69所述的装置个或多个处理器执行时，使得所述装置根据对于所述DNA的多个靶标区域中的每个的相应gRNA数量，确定读段计数超过所述背景阈值的所述DNA的多个靶标区域中的所有靶标区域中存在于所述第一细胞群中的gRNA的总数(N)使得所述装置对读段计数超过所述背景阈值在由所述一个或多个处理器执行时，使得所述装置根据对于所述DNA的多个靶标区域中的段计数超过所述背景阈值的所述DNA的多个靶标区域中的每个所存在的相应gRNA数量在由所述一个或多个处理器执行时，使得所述装置根据对于所述DNA的多个靶标区域中的每个的相应gRNA数量，确定读段计数超过所述背景阈值的所述DNA的多个靶标区域中的所有靶标区域中存在于所述第二细胞群中的gRNA的总数(N’)使得所述装置对读段计数超过所述背景阈值的所述第二细胞群的所选细胞中存在的每个gRN据在所选细胞中偶然观察到所述靶标区域的n’个gRNA的概率来确定在所选细胞中偶然观察到所关注的序列的n/个或更多个gRNA的概序列的n′个或更多个gRNA的概率来鉴定所关注的序列是正向选择的使得所述装置评估确[0214]实施方案76.如实施方案67-76中任一项所述的装置，其还包括处理器可执行指令，所述处理器可执行指令在由所述一个或多个处理器执行时，使得所述装置确定每个[0215]