《骨修复材料体外成骨性能评价方法》编制说明

《骨修复材料体外成骨性能评价方法》编制说明

（征求意见稿）

一、工作简况

1、任务来源

骨修复材料在骨科、口腔种植及创伤修复等领域具有广泛应用，其成骨性能是决定临床

效果的核心指标。目前，骨修复材料的评价主要依赖动物实验，存在周期长、成本高、伦理

争议大且物种差异导致结果外推受限等问题。而传统体外细胞培养模型难以模拟复杂的三维

骨组织微环境，无法全面反映材料的生物学性能。

近年来，随着细胞薄膜（cellsheet）技术的日益成熟，通过将成骨细胞系（MC3T3-E1）

制备成细胞薄膜并层叠形成多层仿生骨组织，经成骨诱导可构建高度模拟天然骨组织的体外

模型。这一模型为骨修复材料的成骨活性与生物相容性评价提供了精准、高效的解决方案，

对材料研发、质量控制和临床应用具有重要价值。

目前，骨修复材料体外成骨性能评价领域缺乏统一的标准化方法，不同实验室采用的评

价体系差异显著，导致研究数据难以横向比较。基于行业现实需求，广东省科学院生物与医

学工程研究所向广东省生物医药产业高质量发展协会提出《骨修复材料体外成骨性能评价方

法》团体标准立项申请，并承担标准起草工作。

2、主要工作过程

1）申请立项阶段

2025年6月，由广东省科学院生物与医学工程研究所向广东省生物医药产业高质量发

展协会提出团体标准编制申请，并于2025年6月10日获准立项。

2）起草阶段

获立项后，针对该标准项目，正式成立团体标准起草工作小组，明确任务要求，制定详

细的技术路线与分工方案。工作组系统收集国内外骨修复材料评价文献，重点分析三维骨组

织体外模型构建技术差异。为验证方法的科学性与重复性，工作组同步开展关键技术实验验

证工作。

基于实验数据与GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起

草规则》，工作组围绕标准制定中的关键技术问题组织多次研讨，对标准框架及核心内容进

行深入论证，最终确立了从体外骨组织模型构建到骨修复材料成骨活性评价全流程技术条款。

由此形成了《骨修复材料体外成骨性能评价方法》团体标准征求意见稿。

3）征求意见阶段

经各起草组同意，2025年7月31日，发送到行业有关单位广泛征求意见。

二、标准编制原则和主要内容

1、标准编制原则

本标准编制遵循以下核心原则，确保方法的科学性、适用性与可实施性：

（1）科学严谨性

严格遵循GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》

要求，规范标准结构和表述。

技术基础标准化：基于成熟的MC3T3-E1培养技术、细胞片叠层技术，明确MC3T3-E1

细胞薄膜制备关键条件、三维体外骨组织模型构建方法等。

评价指标客观量化：选用国际公认的成骨性能标志物（如钙结节定量、成骨基因表达），

避免主观判断。

（2）技术适宜性

适配材料多样性：覆盖不同类型骨修复材料，包括颗粒状和支架状，规定样品前处理方

法（如尺寸标准化）。

模型可推广性：标准方法在组织工程、再生医学领域已有广泛应用和验证，设计兼顾科

研机构与企业实验室条件，避免依赖特殊设备或专利技术。

结果可比性：统一细胞来源要求，选用小鼠成骨前体细胞系（具有成骨诱导后形成成骨

细胞的能力），统一培养体系（培养基成分、培养条件）及阴性/阳性对照设置。

（3）操作可行性

步骤明确可重复：细化从三维体外骨组织模型构建及其与骨修复材料共培养到成骨性能

评价全流程。

2、主要内容的说明

本标准规定了利用三维体外骨组织模型评价多种骨修复材料产品的评估方法。涵盖了骨

修复材料的细胞毒性评价和骨修复材料医疗产品的成骨性能评价，并描述和提供了三维体外

骨组织模型构建、材料细胞毒性及成骨活性评价方法。本标准适用于大部分骨修复材料，包

括颗粒状、支架等形式。

主要技术要求如下：

1.三维体外骨组织模型制备

1.1细胞系

选用小鼠成骨前体细胞系[如来源自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库小鼠胚胎

1

成骨细胞前体细胞MC3T3-E1]，具有成骨诱导后形成成骨细胞的能力。

1.2培养基

完全培养基：含有10v/v%胎牛血清（FBS）的DMEM(Dulbecco'smodifiedeaglemedium)

培养基，内含10v/v%青链霉素，用于常规细胞培养。

成膜培养基：具体成分如下表格，用于细胞成膜培养。

组分含量

DMEM500mL

地塞米松0.1μM

抗坏血酸0.05g/L

Ficoll40025g/L

ITS细胞培养添加物1w/v%

青链霉素10v/v%

FBS1w/v%

1.3制备方法

（1）细胞薄膜培养辅助环制备

利用双组份食品级硅胶制备细胞薄膜培养辅助环。将硅胶双组份按1:1混合均匀，使用

真空泵除去硅胶中的气泡后，将硅胶浇筑于内径为15.5mm，外径为28mm，高度为8mm

的环形模具中，应使硅胶填充至与环形模具边缘平齐，在记录中注明模具的材质。再次使真

空泵除去硅胶中的气泡，70℃的烘箱中交联24h，脱模具，获得细胞薄膜培养辅助环。辅助

环一面平整光滑以保证可以紧贴培养皿。

注1：合适的惰性模具材料可以是聚甲基丙烯酸甲酯或聚四氟乙烯。

（2）三维体外骨组织模型制备

裁剪直径5mm的圆形封口膜，将其贴于35mm细胞培养皿的正中间，再将细胞薄膜

培养辅助环放在培养皿上，保证封口膜在其环形中央位置。

用成膜培养基配制成4×105-8×105细胞/mL细胞悬液，每个辅助环内入0.5mL细胞

悬液，培养4-8天，每2天换液一次，促进细胞成膜。

取下辅助环，然后沿侧壁使用1mL移液枪轻轻吹打细胞薄膜边缘，使其剥离，获得中

间带孔（直径5mm的圆形孔）的细胞薄膜；将剥离的细胞薄膜用5ml移液管转移到35mm

细胞培养皿中，吸干周围的培养基，于37℃、5%的CO2培养箱内放置30min，使细胞薄膜

粘接到培养皿上。

将第二片剥离的细胞薄膜通过移液管转移到第一片之上，铺展并重叠，吸干周围的培养

基，于37℃、5%的CO2培养箱内放置30min，使两片细胞薄膜充分粘接。重复以上操作，

2

堆叠三层中间带孔的细胞薄膜，获得中间带有圆形孔缺损的三层细胞薄膜仿生骨组织，构建

三维体外骨组织模型。

注2：常用的实验室封口膜即可，事先通过紫外线或酒精对封口膜以及辅助环灭菌。

2.测试方法

2.1样品准备

样品应无菌。

a)支架：制成直径约5mm的圆形试样，厚度2mm。

b)颗粒：将材料填入内径5mm，高2mm的环形模具中。在记录中注明模具的材质。应

在填入材料之前将环形模具置于三维体外骨组织模型的中间缺损处，成型后移除。

2.2空白组

三维体外骨组织模型和培养基

2.3阳性对照组

三维体外骨组织模型、培养基和阳性对照材料如羟基磷灰石

2.4阴性对照组

三维体外骨组织模型、培养基和阴性对照材料如纯镁

2.5试验组

三维体外骨组织模型、培养基和试验材料

2.6材料在二维细胞模型和三维体外骨组织模型中细胞毒性测试

2.6.1材料在三维体外骨组织模型中细胞毒性测试

将试验骨修复材料置于三维体外骨组织模型的中间缺损处。为防止材料在加入培养基后

离散，其上覆盖商用胶原膜，加入1-2mL培养基培养。

在12h、24h、48h三个时间点，使用移液器向每样中加入100μLCCK-8溶液，孵育3.5

小时。每样取120μL加入到96孔板中，至少3个复孔。使用酶标仪测量450nm处的吸光度。

2.6.2材料在二维细胞模型中细胞毒性测试

参照ISO10993-5:2009，用完全培养基配制成4×104细胞/mL细胞悬液，接种在96孔板中，

每孔内加入100μL细胞悬液，培养1天使细胞贴壁。

用完全培养基配置1mg/mL材料溶液，每孔加入10μL，相当于0.01mg材料/孔，并保

证初始接种103个细胞对应0.0025mg材料。

设置空白组、阳性对照组、阴性对照组，和试验组，至少3个复孔。

3

在12h、24h、48h三个时间点，使用移液器向板的每个孔中加入10μLCCK-8溶液。

将培养板在培养箱中孵育3.5小时。

2.7材料成骨活性测试

2.7.1成骨诱导

将试验骨修复材料置于三维体外骨组织模型的中间缺损处。为防止材料在加入培养基后

离散，其上覆盖商用胶原膜，加入1-2mL成骨诱导培养基，培养28天，每2天换液1次。

2.7.2茜素红染色

在培养第28天，进行茜素红S染色以及定量。将贴壁混合细胞使用磷酸缓冲盐溶液（PBS）

清洗3次，加入固定液覆盖细胞固定30min。吸去固定液，PBS清洗3次，滴加茜素红S染液，

覆盖样品，于室温下染色30min。吸去茜素红s染液，蒸馏水清洗3次，晾干，显微镜下观察

成骨细胞矿化结节中的钙质染色。

进一步对钙质进行定量，每个培养皿中加入1mL的10%溴代十六烷基吡啶（CPC）摇

床上轻摇1h以结合茜素红，洗脱好的CPC移入EP管中，用10%CPC稀释20倍，用于测

定。酶标仪测定波长562nm吸光度。

2.7.3Westernblot法检测成骨相关蛋白

在培养第14天和28天提取组织总蛋白，通过Westernblot法检测成骨相关蛋白。包括

启动成骨分化的Runt相关转录因子2（Runt-relatedtranscriptionfactor2,Runx2）、调控骨

矿化的成骨细胞特异性转录因子Osterix（OSX）、骨桥蛋白（osteopontin,OPN）、骨钙素

（osteocalcin,OC）。

配制10%分离胶，配制5%浓缩胶。随后用SDS对各组蛋白质进行分离，根据蛋

白浓度计算上样量，一般为20μg，可适量加至40μg。在电泳槽中加入已经配置混合均匀

的RunningBuffer，在1-2个泳道中加入3μLMarker，其余每个泳道加入已制备好的蛋白样

品。首先86V跑出浓缩胶，然后200V电泳至分离出目的条带。转膜完成后，使用5%脱脂

奶粉室温封闭1h。将相应的抗体置于PVDF膜上，室温孵育1-2h或者4℃冰箱过夜。加入

牛奶稀释的二抗室温孵育1-2h。完成后可于显影仪显影。

3.结果评价

3.1材料细胞毒性评价

按式（1）计算细胞存活率：

细胞存活率=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%………………（1）

式中：

4

As:实验组吸光度；

Ac:对照组吸光度；

Ab:空白组吸光度。

3.2材料成骨活性评价

3.2.1矿化结节

按式（2）计算矿化结节：

矿化结节评价=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%………………（2）

式中：

As:实验组吸光度；

Ac:对照组吸光度；

Ab:空白孔吸光度。

3.2.2成骨相关蛋白表达

按式（3）计算成骨相关蛋白表达：

蛋白相对表达量=I目的蛋白/I内参蛋白………………（3）

式中：

I目的蛋白：目的蛋白灰度值（如Runx2、OSX、OPN、OC成骨标志物）

I内参蛋白：内参蛋白灰度值（如GAPDH、β-actin等内参蛋白）

3、解决的主要问题

当前骨修复材料的体外成骨性能评价存在模型缺陷、方法标准化缺失等问题。传统单层

细胞培养无法模拟体内骨组织的三维结构与细胞微环境，导致材料成骨活性（如分化、矿化

能力）评价结果失真；而动物实验周期长、成本高且存在种属差异，难以满足材料快速研发

的需求。此外，行业缺乏统一的体外评价规范，不同机构在关键技术环节（如培养条件、三

维体外骨组织模型构建）及检测方法上存在显著差异，导致数据不可比、产品质量参差不齐，

严重制约技术交流与监管实施。

针对以上问题，本标准基于MC3T3-E1多层细胞薄膜仿生骨组织模型，建立《骨修复材

料体外成骨性能评价方法》标准化评价体系。提出一种基于细胞薄膜技术的体外模型，该模

型无需支架材料即可构建由细胞以及细胞产生的细胞外基质组成的全生物化仿生骨组织,能

模拟骨修复材料植入到体内后与细胞、组织在三维空间中的直接接触与相互作用。结合严格

定义的三维体外骨组织模型构建方法及骨修复材料的细胞毒性与成骨活性评价方法，精准反

映骨修复材料成骨性能。为材料生物相容性、成骨诱导性提供高临床相关性体外预判工具，

缩短研发周期，为注册申报与质控提供核心技术支撑。

5

三、标准中涉及专利的情况

本标准在制定过程中，对可能涉及的专利进行了检索与评估。经确认，标准核心技术内

容关联1件已授权的中国发明专利，具体信息如下：

专利名称：一种骨修复材料体外评价模型

专利申请号：202210711252X

专利权人：广东省科学院生物与医学工程研究所

法律状态：专利权有效

专利许可声明：专利权人广东省科学院生物医学工程研究所已向标准起草组提交《专利

实施许可声明书》，承诺在公平、合理、无歧视原则下，许可任何组织或个人在实施本

标准时使用其专利技术。

四、预期达到的社会效益、对产业发展的作用等情况

1.预期达到的社会效益

本标准通过建立三维骨组织体外模型，将显著减少骨修复材料研发中对动物实验的依赖，

推动科研伦理进步并降低实验成本。此外，该方法可精准模拟骨组织微环境，提供更准确和

可靠的骨材料评价结果，为监管部门提供科学客观的质量评价工具，从源头提升骨修复材料

的安全性与有效性，降低临床植入失败风险，切实保障患者健康权益。同时，标准化的体外

评价流程可大大缩短材料研发周期，降低单次评价成本，大幅提升科研资源利用效率，加速

创新成果向临床转化。

2.对产业发展的作用

本标准将解决行业因评价方法碎片化导致的数据不可比、产品质量参差不齐等核心问题，

为材料生产企业、检测机构及科研院所提供统一的技术标尺。通过规定三维体外骨组织模型

构建、材料细胞毒性及成骨活性评价方法，形成可复制的评价链条，助力企业建立高通量材

料预筛平台，精准优化产品成骨活性配方。此外，还可为二类/三类医疗器械注册审评提供关

键技术支持（替代部分动物试验数据），降低企业研发合规成本，缩短产品上市周期，整体

推动骨修复材料产业向规范化、高效化升级。

五、与国际、国外对比情况

本标准没有采用国际标准。

本标准制定过程中未查到同类国际、国外标准。

六、在标准体系中的位置，与现行相关法律、法规、规章及相关标准，特别是强制性标

准的协调性

本标准为自拟标准，指标和推荐方法的制定原则，与有关的现行法律、法规和强制性标

6

准无冲突，采用标准如下：

GB/T16886.5医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验

GB/T16886.12医疗器械生物学评价第12部分：样品制备与参照样品

YY/T0127.9-2009口腔医疗器械生物学评价第2单元：试验方法细胞毒性试验:琼脂扩

散法及滤膜扩散法

YY/T0511-2009多孔生物陶瓷体内降解和成骨性能评价试验方法

YY/T1616-2018组织工程医疗器械产品生物材料支架的性能和测试指南

YY/T1477.5-2020接触性创面敷料性能评价用标准试验模型第5部分：评价止血性能的

体外模型

YY/T1680-2020脱矿骨材料的成骨诱导功能评价

YY/T1575-2017组织工程医疗器械产品修复和替代骨组织植入物骨形成活性的体内评

价指南

七、重大分歧意见的处理经过和依据

本标准在起草过程中无重大分歧意见。

八、标准性质的建议说明

建议本标准的性质为团体标准。

九、贯彻标准的要求和措施建议

建议本标准批准发布后实施。

十、废止现行相关标准的建议

十二、其它应予说明的事项

《骨修复材料体外成骨性能评价方法》编制说明

（征求意见稿）

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《骨修复材料体外成骨性能评价方法》编制说明

（征求意见稿）

一、工作简况

1、任务来源

骨修复材料在骨科、口腔种植及创伤修复等领域具有广泛应用，其成骨性能是决定临床

效果的核心指标。目前，骨修复材料的评价主要依赖动物实验，存在周期长、成本高、伦理

争议大且物种差异导致结果外推受限等问题。而传统体外细胞培养模型难以模拟复杂的三维

骨组织微环境，无法全面反映材料的生物学性能。

近年来，随着细胞薄膜（cellsheet）技术的日益成熟，通过将成骨细胞系（MC3T3-E1）

制备成细胞薄膜并层叠形成多层仿生骨组织，经成骨诱导可构建高度模拟天然骨组织的体外

模型。这一模型为骨修复材料的成骨活性与生物相容性评价提供了精准、高效的解决方案，

对材料研发、质量控制和临床应用具有重要价值。

目前，骨修复材料体外成骨性能评价领域缺乏统一的标准化方法，不同实验室采用的评

价体系差异显著，导致研究数据难以横向比较。基于行业现实需求，广东省科学院生物与医

学工程研究所向广东省生物医药产业高质量发展协会提出《骨修复材料体外成骨性能评价方

法》团体标准立项申请，并承担标准起草工作。

2、主要工作过程

1）申请立项阶段

2025年6月，由广东省科学院生物与医学工程研究所向广东省生物医药产业高质量发

展协会提出团体标准编制申请，并于2025年6月10日获准立项。

2）起草阶段

获立项后，针对该标准项目，正式成立团体标准起草工作小组，明确任务要求，制定详

细的技术路线与分工方案。工作组系统收集国内外骨修复材料评价文献，重点分析三维骨组

织体外模型构建技术差异。为验证方法的科学性与重复性，工作组同步开展关键技术实验验

证工作。

基于实验数据与GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起

草规则》，工作组围绕标准制定中的关键技术问题组织多次研讨，对标准框架及核心内容进

行深入论证，最终确立了从体外骨组织模型构建到骨修复材料成骨活性评价全流程技术条款。

由此形成了《骨修复材料体外成骨性能评价方法》团体标准征求意见稿。

3）征求意见阶段

经各起草组同意，2025年7月31日，发送到行业有关单位广泛征求意见。

二、标准编制原则和主要内容

1、标准编制原则

本标准编制遵循以下核心原则，确保方法的科学性、适用性与可实施性：

（1）科学严谨性

严格遵循GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》

要求，规范标准结构和表述。

技术基础标准化：基于成熟的MC3T3-E1培养技术、细胞片叠层技术，明确MC3T3-E1

细胞薄膜制备关键条件、三维体外骨组织模型构建方法等。

评价指标客观量化：选用国际公认的成骨性能标志物（如钙结节定量、成骨基因表达），

避免主观判断。

（2）技术适宜性

适配材料多样性：覆盖不同类型骨修复材料，包括颗粒状和支架状，规定样品前处理方

法（如尺寸标准化）。

模型可推广性：标准方法在组织工程、再生医学领域已有广泛应用和验证，设计兼顾科

研机构与企业实验室条件，避免依赖特殊设备或专利技术。

结果可比性：统一细胞来源要求，选用小鼠成骨前体细胞系（具有成骨诱导后形成成骨

细胞的能力），统一培养体系（培养基成分、培养条件）及阴性/阳性对照设置。

（3）操作可行性

步骤明确可重复：细化从三维体外骨组织模型构建及其与骨修复材料共培养到成骨性能

评价全流程。

2、主要内容的说明

本标准规定了利用三维体外骨组织模型评价多种骨修复材料产品的评估方法。涵盖了骨

修复材料的细胞毒性评价和骨修复材料医疗产品的成骨性能评价，并描述和提供了三维体外

骨组织模型构建、材料细胞毒性及成骨活性评价方法。本标准适用于大部分骨修复材料，包

括颗粒状、支架等形式。

主要技术要求如下：

1.三维体外骨组织模型制备

1.1细胞系

选用小鼠成骨前体细胞系[如来源自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库小鼠胚胎

1

成骨细胞前体细胞MC3T3-E1]，具有成骨诱导后形成成骨细胞的能力。

1.2培养基

完全培养基：含有10v/v%胎牛血清（FBS）的DMEM(Dulbecco'smodifiedeaglemedium)

培养基，内含10v/v%青链霉素，用于常规细胞培养。

成膜培养基：具体成分如下表格，用于细胞成膜培养。

组分含量

DMEM500mL

地塞米松0.1μM