小麦田山羊草属杂草抗药性监测技术规程

小麦田山羊草属杂草抗药性监测技术规程范围本文件规定了小麦田山羊草属（Aegilopsspp.）杂草抗药性监测技术规程的基本要求及注意事项。本文件适用于小麦田山羊草属杂草对除草剂的抗药性监测。规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。NY/T1667.3农药登记管理术语第3部分：农药药效。NY/T1155.4农药室内生物测定试验准则除草剂第4部分：活性测定试验茎叶喷雾法。NY/T3852—2021稻田莎草科杂草抗药性监测技术规程。3术语和定义上述引用文件中界定的术语和定义适用于本文件。4试剂与材料4.1监测对象节节麦（AegilopstauschiiCoss.）、圆柱山羊草（AegilopscylindricaHost）等山羊草属杂草。4.2试验药剂除草剂原药或制剂。4.3试剂0.1%吐温-80水溶液、二甲基亚砜或丙酮等。所用试剂均为分析纯。5仪器设备电子天平：感量为0.001g。喷雾设备：压力稳定，带扇形喷头的可定量喷雾装置。温度和光照可控温室：温度范围为15℃~30℃，光照强度不小于30000Lux。6试验步骤6.1杂草种子采集在节节麦或圆柱山羊草疑似抗药性麦田设立采样点，采用倒置“W”九点取样方法，采集成熟的山羊草属杂草种子，每个点采集杂草株数不少于30株，将九点采集种子混合，作为一个种群，记录采集信息（附表A.1）。将采集的种子晾干，并置于阴凉干燥处保存。6.2杂草培养选择无山羊草属杂草种子、无除草剂残留的农田地表土，混合20%~30%的草炭土，混合均匀后装入直径不小于10cm的培养钵；将待测种群及敏感对照的种子，用清水浸泡24小时后，每盆定量均匀撒播在土壤表面，覆土约1cm，采用盆钵底部渗灌方式补充水分，土壤相对湿度保持在60%~70%；置于25℃:15℃（D:N），光周期12h:12h（L:D）条件下培养。6.3整株生物测定法6.3.1茎叶处理法待植株长至2叶期，间苗，每盆保留长势一致的植株，每盆保留植株数量相同。待供试杂草长至2叶1心期，以试验药剂的田间推荐剂量为基准，设计系列剂量梯度的除草剂进行茎叶喷雾处理，药剂处理至少设置5个剂量，设不含除草剂（含有溶剂）的处理作空白对照。每个剂量不少于3次重复。处理后按照6.2培养条件继续培养。6.3.2土壤处理法在播种后发芽前，以试验药剂的田间推荐剂量为基准，设计系列剂量梯度的除草剂进行土壤喷雾处理，药剂处理至少设置5个剂量，设不含除草剂（含有溶剂）的处理作空白对照。每个剂量不少于3次重复。处理后按照6.2培养条件继续培养。6.4靶标基因检测法6.4.1DNA提取用药后，在田间推荐及以上剂量下存活的植株，取杂草幼嫩叶片，约200mg，采用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法或商品化试剂盒提取总DNA。每个抗药性种群随机检测抗药性植株不少于10株，并单株检测。用1%琼脂糖凝胶电泳检测提取的DNA质量是否合格，电泳出现一条清晰明亮的条带，表明DNA较完整，无降解。6.4.2聚合酶链式反应（PCR）如靶标基因序列已有报道，可以采用文献中引物序列，或根据已报道序列自行设计引物，通过PCR反应扩增靶标基因序列。一般2000bp左右的序列设计1~3对引物，扩增循环25~35。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，与DNA分子量标准品比对，判断产物片段大小与预期是否相符，根据条带亮度和有无杂带，判断产物浓度和扩增特异性。6.4.3PCR产物测序PCR产物的电泳检测结果符合预期时，采用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对产物进行回收纯化，纯化后的PCR产物测序，测序引物采用扩增目的片段的引物。7结果调查7.1整株生物测定法施药后21天，调查每个处理的存活植株数、地上部分鲜重或干重。7.2靶标基因检测法从测序公司获得合格的测序结果。8数据统计与分析8.1存活率和抑制率计算方法按公式（1）计算杂草存活率或抑制率。Y式中：Y——存活率、鲜重或干重抑制率，单位为百分率（%）；M0——对照总株数、地上部分鲜重或干重，单位为株或克（g）；Mx——除草剂有效剂量Xgai/hm2处理后存活植株数、地上部分鲜重或干重，单位为株或克（g）。8.2生长抑制中量计算方法按公式（1）计算杂草鲜重或干重抑制率。以杂草鲜重或干重抑制率为指标，按公式（2）或公式（3）计算生长抑制中量。Y=式中：Y——鲜重或干重抑制率，单位为百分率（%）；X——除草剂有效剂量，单位为克每公顷（gai/hm2）；C——Y值下限，单位为百分率（%）；D——Y值上限，单位为百分率（%）；GR50——生长抑制中量，单位为克每公顷（gai/hm2）；b——斜率。Y式中：Y——鲜重或干重抑制率，单位为百分率（%）；X——除草剂有效剂量的对数值；a——截距；b——回归系数。8.3靶标基因序列比对分析方法测序结果首先用软件查看测序峰图，根据测序峰图是否正常、有无杂峰等来判断测序结果是否可用。序列与拟南芥（Arabidopsisthaliana）等模式植物及敏感对照序列进行比对，分析靶标序列突变位点。9抗药性水平的评估9.1抗药性水平计算按公式（4）计算抗药性倍数RI：R式中：RI——抗药性倍数；GR50R——抗药性种群生长抑制中量，单位为克每公顷（gai/hm2）；GR50S——敏感性种群生长抑制中量，单位为克每公顷（gai/hm2）。9.2抗药性水平评估通过公式（1）计算的每个剂量下存活率，可以判断抗药性植株在种群中所占比例；根据计算的RI值评估该种群的抗药性水平，根据表1中抗药性水平分级标准分为敏感、低、中、高抗性。表1杂草抗药性水平的分级标准抗药性水平分级抗性倍数低水平抗性1.0＜RI≤5.0中等水平抗性5.0＜RI≤10.0高水平抗性RI＞10.09.3靶标抗性判断在除草剂推荐剂量处理下能够存活，并且通过靶标基因检测在对应抗药性位点发生突变时，即判断为靶标抗性。_________________________________附录A（资料性）杂草种子采集信息登记表杂草种子采集信息登记表见表A.1。表A.1杂草种子采集信息登记表样品编号：采样人：采集单位：采样日期：年月日采样点详细地址省县乡村农户姓名：电话：杂草名称及数量定位信息经度：纬度：种植模式耕作方式：（打钩）：免耕浅旋深翻轮作模式：除草剂使用背景除草剂使用情况：近5年使用：；用量：ga.i./hm2，次/年；近10年使用：；用量：ga.i./hm2/亩，次/年除草剂药效目前使用除草剂的效果（打钩）：好；一般；差附录B（资料性）山羊草属杂草对甲基二磺隆敏感基线参考值部分山羊草属杂草对甲基二磺隆敏感基线参考值见表B.1。表B.1部分山羊草属杂草对甲基二磺隆的敏感基线参考值杂草名称药剂品种GR50（SE）（ga.i./hm2）节节麦甲基二磺隆2.78（0.98）圆柱山羊草甲基二磺隆6.49（1.78）注：SE为标准误。附录C（资料性）节节麦和圆柱山羊草乙酰乳酸合成酶（ALS）基因序列克隆方法节节麦ALS克隆：下列3对引物可扩增节节麦ALS基因序列片段，第一对引物正向引物为：5′-GGGCGCCGACATCCTCGTC-3′，反向引物为：5′-CAGCCACCACCAACATACAG-3′，扩增片段大小为636bp，第二对引物正向引物为5′-CCAAGGACATCCAACAGCA-3′，反向引物为：5′-CGCCAACTCCTGAATGTTC-3′，扩增片段大小为883bp，第三对引物正向引物为5′-GCACATTGACATTGACCCAG-3′，反向引物为：5′-TCTTATGACAGCACATCCCTA-3′，扩增片段大小为1039bp。也可参照小麦D染色体组ALS基因（TraesCS6D01G268700）设计引物扩增靶标基因序列。PCR反应体系参考如下：10µM的引物各1.0μL，5U/µL的TaqDNA聚合酶0.25μL，提取的待测DNA样品1~2μL，按照产品说明分别加入dNTP混合液和缓冲液，加入无菌蒸馏水至反应体系为25μL。PCR反应条件参考如下：94℃加热10min，使DNA裂解变性；进入反应循环，在每一个循环中，94℃裂解30sec，引物退火温度下退火30sec，72℃延伸1.0min，共35个循环；最后72℃继续延伸10min，使产物延伸完整。上述3对引物的退火温度分别为62℃、55.5℃和56℃。圆柱山羊草ALS克隆：用下列引物扩增圆柱山羊草ALS基因序列，正向引物为：5′-ATGGCCGCCGCCACCTCC-3′，反向引物为：5′-TCAGTACGAGGTCCTGCCATCA-3′，扩增片段大小为1935bp，引物的退火温度为62℃。也可参照小麦D染色体组ALS基因（TraesCS6D01G268700）设计引物扩增靶标基因序列。PCR反应体系和反应条件可以参考节节麦ALS扩增反应。靶标基因检测结果分析：测序结果首先用软件查看测序峰图，根据测序峰图是否正常、有无杂峰等来判断测序结果是否可用。测序的碱基序列翻译成氨基酸