2027届新高考生物精准冲刺复习基因工程的基本工具和操作程序

2027届新高考生物精准冲刺复习基因工程的基本工具与操作程序考点一重组DNA技术的基本工具1.基因工程的概念是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术。DNA分子转基因遗传特性生物类型基因重组1.基因工程的概念是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术。2.基因工程的基本工具限制性内切核酸酶（限制酶）、DNA连接酶、载体DNA分子转基因遗传特性生物类型基因重组一、重组DNA技术的基本工具(1)限制性内切核酸酶(也称“限制酶”)

脱氧核苷酸序列磷酸二酯键黏性末端作用：切割外源DNA，保证自身安全。不切自身DNA：自身DNA分子中不存在该酶识别序列或被修饰。“分子手术刀”第7页限制酶一、重组DNA技术的基本工具

2.DNA连接酶——“分子缝合针”1.(2023·新课标，6)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是A.质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coliDNA连接酶连接B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4DNA连接酶连接C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4DNA连接酶连接D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coliDNA连接酶连接C与DNA有关的几种酶的比较噬菌体受体DNA上限制酶酶切位点标记一、重组DNA技术的基本工具

3.载体——“分子运输车”第11页[选择性必修3P74~75“拓展应用2”拓展]构建基因表达载体时,需要选择合适的限制酶切割含有目的基因的DNA片段和载体。已知限制酶Ⅰ的识别序列和酶切位点是

,限制酶Ⅱ的识别序列和酶切位点是

,根据图示思考:第12页(1)请用图示法写出限制酶Ⅰ和限制酶Ⅱ切割形成黏性末端的过程。提示限制酶Ⅰ:限制酶Ⅱ:

第13页(2)切割图示中的目的基因和质粒应选用哪类限制酶?请说明理由。提示用限制酶Ⅱ切割目的基因,用限制酶Ⅰ切割质粒。限制酶的选择原则(1)不破坏目的基因(2)保留启动子、终止子、复制原点、至少保留一个标记基因(3)确保出现相同黏性末端使用两种不同的限制酶切割目的基因和质粒：可避免目的基因和质粒自身环化和反向连接。1．图示人体正常基因A突变为致病基因a及HindⅢ切割位点。AluⅠ限制酶识别序列及切割位点为，下列相关叙述正确的有（

）A．基因A突变为a是一种碱基增添的突变B．用两种限制酶分别酶切A基因后，形成的末端类型不同C．用两种限制酶分别酶切a基因后，产生的片段大小一致D．产前诊断时，该致病基因可选用HindⅢ限制酶开展酶切鉴定载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。如图所示：标记基因的筛选原理导入受体细胞培养加入氨苄青霉素只有含有载体，并且载体上的抗性基因表达的大肠杆菌才能存活并增殖含有氨苄青霉素抗性基因载体（如质粒）双标记基因法筛选含有目的基因的受体细胞考点二基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序1.目的基因的筛选与获取人工合成目的基因基因文库一、基因工程的基本操作程序(2)利用PCR获取和扩增目的基因引物脱氧核苷酸耐高温温度3复性温度过高，则引物难以与模板链结合，温度过低则易使两条母链配对结合，均无法获得PCR产物。引物：1、概念：引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。2、作用：使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸3、引物设计原则：引物自身或两种引物之间不存在互补序列设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如图)，请分别说明理由。①第1组：_______________________________________________________；②第2组：_______________________________________________________。引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效引物Ⅰ′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效

2．基因表达载体的构建——基因工程的核心

（1）目的：使目的基因_______________________________________，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。

（2）基因表达载体的组成在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代位于基因的上游；是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。位于基因的下游；终止转录。DNA复制的起始位点一、基因工程的基本操作程序提醒

启动子、起始密码子、终止子、终止密码子的区别

（3）基因表达载体构建过程

3．将目的基因导入受体细胞

（1）导入动物细胞

显微注射法：将目的基因注入动物的＿＿＿＿＿中。（2）导入微生物细胞

受精卵Ca2+处理感受态细胞吸收大肠杆菌一、基因工程的基本操作程序

Ca2+转化法：先用Ca2+处理大肠杆菌，使之处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后将重组的基因表达载体导入其中。

3．将目的基因导入受体细胞

（3）导入植物细胞

①花粉管通道法：a.用微量注射器将含

直接注入

中;b.在植物

后一定时间内,剪去柱头,将DNA溶液滴在

,使目的基因通过

进入胚囊。一、基因工程的基本操作程序目的基因的DNA溶液受粉子房花粉管通道花柱切面

3．将目的基因导入受体细胞

（3）导入植物细胞②农杆菌转化法：农杆菌细胞内含有________，当它侵染植物细胞后，Ti质粒上的_____________________________转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的______________上。Ti质粒T-DNA染色体DNA（可转移的DNA）一、基因工程的基本操作程序农杆菌在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物。第36页农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入:第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上,第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上;第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌,第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA导入受体细胞。PCR抗原—抗体杂交一、基因工程的基本操作程序

4．目的基因的检测和鉴定D1.(2023·湖北卷，4)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是(

)A.若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同B.若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因C.若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否D.若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落2．（2025·江西卷）为了获得抗白叶枯病的水稻品种，研究人员构建了含有抗病基因D的重组Ti质粒（如图），通过农杆菌转化法将D基因导入水稻种子诱导的愈伤组织，最终获得抗病植株。下列叙述正确的是（）A．水稻愈伤组织细胞中RNA聚合酶无法识别U6启动子B．在含重组Ti质粒的农杆菌中U6启动子不能驱动卡那霉素抗性基因表达C．农杆菌侵染愈伤组织后所用的筛选培养基中需加入卡那霉素D．愈伤组织再分化获得的含有D基因的幼苗属于抗病植株3．（易错题）γ-氨基丁酸在医药等领域有重要的应用价值。利用L-谷氨酸脱羧酶（GadB）催化L-谷氨酸脱羧是高效生产γ-氨基丁酸的重要途径之一。研究人员采用如图方法将酿酒酵母S的L-谷氨酸脱羧酶基因（gadB）导入生产菌株E.coliA，构建了以L-谷氨酸钠为底物高效生产γ-氨基丁酸的菌株E.coliB。下列叙述正确的是（）A．上图表明，可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadBB．E.coliB发酵生产γ-氨基丁酸时，L-谷氨酸钠的作用是供能C．E.coliA和E.coliB都能高效降解γ-氨基丁酸D．可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒4．（2025·广东卷）低温是限制农作物产量的重要胁迫因子。科学家将寒带植物中的CBFs抗寒基因转移到拟南芥中构建拟南芥耐寒模型，用于植物低温胁迫机制的相关研究。请据图回答问题：（2）设计引物克隆目的基因。如图1所示，应选择引物

对CBFs基因进行克隆。引物的作用是

。（3）根据目的基因和质粒的结构分析，参考图表中限制酶的识别序列，为了后续能将CBFs目的基因正确连接到图2的Ti质粒上，应选用限制酶

和

切割质粒，还应在CBFs目的基因上游引物的

端添加限制酶

的识别序列。（4）将拟南芥叶片浸泡在转基因农杆菌菌液中一段时间进行转化，提取叶片中的DNA，通过PCR、核酸分子杂交技术对CBFs基因是否整合到拟南芥基因组中进行检测，结果如图3所示，该转基因叶片的基因组中可能已整合CBFs基因。结果中显示出小分子非目标条带，产生的最主要原因可能是

。A．引物特异性不佳B．变性温度过低C．复性温度过高D．延伸时间过长5、若要利用基因工程生产人胰岛素，选择大肠杆菌还是酵母菌比较好？酵母菌。酵母菌中有内质网、高尔基体可以对胰岛素加工。6.若一个DNA分子在PCR中经过n轮循环，理论上需要消耗多少个引物？第n轮循环需要消耗多少个引物数？

提示经过n轮循环需要消耗引物数为(2n＋1－2)个，第n轮循环需要消耗的引物数为2n个。7.若要在目的基因两侧加上限制酶的切割位点，应加在引物的端。

5’考点三DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增及电泳鉴定一、DNA的粗提取与鉴定1.实验原理不溶于2mol/L二苯胺第57页2.实验步骤等体积、预冷的体积分数为95%2mol/L的NaCl溶液二苯胺二.DNA片段的扩增及电泳鉴定(1)实验基础可解离相反琼脂糖凝胶电泳大小和构象迁移规律：分子越小，迁移速度越快；相同分子量下，环状DNA比线状DNA迁移快。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。(2)PCR实验操作步骤微量移液器离心管底部PCR仪①成功扩增出DNA片段的判断依据是____________________________________。②如图所示，该片段大小约为________bp。可以在紫外灯下直接观察到DNA条带750①为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。②在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换，避免试剂的污染。③电泳时，DNA的相对分子量越大，迁移速率越慢；DNA的相对分子量越小，迁移速率越快。电泳鉴定时，未出现扩增条带的原因有？①模板DNA被污染②引物特异性不强或形成引物二聚体③复性时温度过低①漏加了PCR反应成分②耐高温的DNA聚合酶失活③PCR程序设置不合理电泳鉴定时，出现非特异性扩增条带的原因有？2．（2025·福建卷）质粒P含有2个EcoRⅠ、1个SacⅠ和1个BamHⅠ的限制酶切割位点。已知BamHⅠ位点位于2个EcoRⅠ位点的正中间，用上述3种酶切割该质粒，酶切产物的凝胶电泳结果如图，其中泳道①条带是未酶切的质粒P，泳道②③④条带为3种单酶切产物，泳道⑤⑥⑦条带为双酶切产物。下列叙述正确的是（）A．DNA分子在该凝胶的迁移方向是从电源正极到负极B．泳道②③条带分别是SacⅠ和EcoRⅠ的单酶切产物C．泳道⑤条带是SacⅠ和EcoRⅠ的双酶切产物D．泳道①②说明未酶切质粒的碱基数小于酶切后质粒的碱基数3．（预测题）（多选）X染色体上的D基因异常可导致人体患病，在男性中发病率为1/3500，某患病男孩（其母亲没有患病）X染色体上的基因D和H内各有一处断裂，断裂点间的染色体片段发生颠倒重接。研究者对患儿和母亲的DNA进行了PCR检测，所用引物和扩增产物电泳结果如图。不考虑其他变异，下列分析错误的是（）注：引物组合S1和S2，R1和R2可分别用于对正常基因D和H序列的扩增检测A．该病患者中男性显著多于女性，女性中携带者的占比为1/3500B．用R1和R2对母亲和患儿DNA进行PCR检测的结果相同C．与正常男性相比，患病男孩X染色体上的基因排列顺序发生改变D．利用S1和S2进行PCR检测，可诊断母亲再次孕育的胎儿是否患该病4．（易错题）某基因表达载体部分结构如图所示，F1