2021 酶免疫检测抗体检测通则

犌犅／犜４０２６５—２０２１

前言

本文件按照ＧＢ／Ｔ１．１—２０２０《标准化工作导则第１部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由全国生化检测标准化技术委员会（ＳＡＣ／ＴＣ３８７）提出并归口。

本文件起草单位：中国计量大学、北京工商大学、中国测试技术研究院生物研究所、华南农业大学。

本文件主要起草人：叶子弘、夏文强、马爱进、张雅芬、冯德建、雷洪涛、崔海峰、吴微、马丽侠。

Ⅰ

书

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酶免疫检测抗体检测通则

１范围

本文件规定了酶免疫检测抗体检测的一般要求、检测过程和结果表述。

本文件适用于酶免疫检测用抗体的检测控制。

本文件不适用于具有标记物的酶免疫检测用抗体的检测控制。

２规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文

件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于

本文件。

ＧＢ／Ｔ６６８２分析实验室用水规格和试验方法

ＧＢ１９４８９实验室生物安全通用要求

ＧＢ／Ｔ２５９１５．１洁净室及相关受控环境第１部分：空气洁净度等级

３术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

３．１

抗体犪狀狋犻犫狅犱狔

免疫球蛋白ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ

机体免疫系统在抗原刺激下，由Ｂ细胞增殖分化为浆细胞后产生的一类能与相应抗原特异性结合

并介导产生体液免疫效应的球蛋白。

３．２

抗原犪狀狋犻犵犲狀

可以诱导生物体产生抗体的物质，能够被相应抗体识别并与之结合。

３．３

种属来源犺狅狊狋

用于免疫制备抗体的动物物种或抗体恒定区的氨基酸序列与待分析抗体最相近的动物物种。

３．４

抗体类型犪狀狋犻犫狅犱狔犻狊狅狋狔狆犲

根据抗体的结构和免疫原性不同，对抗体的分类。

注：抗体重链可分为μ、γ、α、δ、ε五类。抗体轻链可分为κ和λ两类。抗体重链的种类决定了抗体类型，哺乳动物体

内的抗体包括ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ和ＩｇＥ五种类型，分别对应抗体重链μ、γ、α、δ、ε。

３．５

效价狋犻狋犲狉

某种抗体识别特异性抗原所需的最低浓度。

注：抗体效价通常使用检测结果呈阳性时抗体的最高稀释度表示。

１

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３．６

纯度狆狌狉犻狋狔

样品中目标抗体含量占总蛋白含量的百分率。

３．７

亲和力犪犳犳犻狀犻狋狔

抗体与抗原间的结合强度的综合评价指标。

注：包括单克隆抗体亲和力与多克隆抗体亲和力。通常用解离常数犓Ｄ表示。犓Ｄ数值越低表示抗体亲和力越好。

３．８

交叉反应犮狉狅狊狊狉犲犪犮狋犻狅狀

抗体与目标分析物的结构类似物也能产生反应的现象。

４缩略语

下列缩略语适用于本文件。

ＤＭＳＯ：二甲基亚砜（Ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）

ＨＲＰ：辣根过氧化物酶（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）

ＩｇＡ：免疫球蛋白Ａ（ＩｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎＡ）

ＩｇＤ：免疫球蛋白Ｄ（ＩｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎＤ）

ＩｇＥ：免疫球蛋白Ｅ（ＩｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎＥ）

ＩｇＧ：免疫球蛋白Ｇ（ＩｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎＧ）

ＩｇＭ：免疫球蛋白Ｍ（ＩｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎＭ）

ＩｇＹ：免疫球蛋白Ｙ（ＩｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎＹ）

ＴＭＢ：３，３′，５，５′四甲基联苯胺（３，３′，５，５′Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）

５一般要求

５．１检测样品

５．１．１检测样品宜具备说明书或同功能资料。

５．１．２应在洁净环境下，使用洁净、干燥器具取样。样品应具有代表性。蛋白抗原、抗体等不稳定的样

品，宜在低于８℃的低温下尽快完成取样，并于低温保存待用。

５．２实验室

５．２．１生物安全部分应符合ＧＢ１９４８９中的相应要求。

５．２．２洁净区的悬浮粒子浓度应符合ＧＢ／Ｔ２５９１５．１规定的ＩＳＯ６级的要求。

５．２．３在处理废弃样品、试剂和容器之前，应保证试验操作人员和周围环境的安全。为了降低污染物

的毒性，防止有毒物质的泄漏，应根据废弃物的性质，对其进行无害化处理。

５．３试剂材料

５．３．１除非另有说明，在检测中使用的试剂均为生化试剂或更高级别试剂，水为ＧＢ／Ｔ６６８２规定的一

级水。

２

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５．３．２使用的玻璃器具应为一级硬玻璃或经过钝化处理。

５．３．３使用的合成树脂器具应为聚丙烯或其他低吸附材料制作，不添加染料、填充物。

５．３．４使用的酶标板底部应具有亲水表面。

５．４检测指标

５．４．１酶免疫检测用单克隆抗体的检测指标应包括种属来源、抗体类型、纯度、浓度、效价、亲和力、交

叉反应。

５．４．２酶免疫检测用多克隆抗体的检测指标应包括种属来源、浓度、效价、亲和力、交叉反应。

６检测过程

６．１抗体种属来源

宜使用间接酶联免疫吸附法、免疫扩散法、蛋白质免疫印迹法、化学发光免疫测定法或蛋白质质量

肽谱法等方法检测抗体的种属来源。若使用间接酶联免疫吸附法见附录Ａ。

６．２抗体类型

宜使用间接酶联免疫吸附法、免疫扩散法、蛋白质免疫印迹法、化学发光免疫测定法或蛋白质质量

肽谱法等方法检测抗体类型。若使用间接酶联免疫吸附法见附录Ａ。

６．３抗体纯度

宜使用液相色谱法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法或毛细管电泳法等方法检测抗体的纯度。若使用高效

液相色谱法见附录Ｂ。

６．４抗体浓度

宜使用比色法、紫外分光光度法、液相色谱法、酶联免疫吸附法、蛋白质免疫印迹法或化学发光免疫

测定法等方法检测抗体的浓度。若使用高效液相色谱法见附录Ｃ。

６．５抗体效价

宜使用间接酶联免疫吸附法或试管凝集试验等方法检测抗体的效价。若使用间接酶联免疫吸附法

见附录Ｄ。

６．６抗体亲和力

宜使用竞争酶联免疫吸附法、表面等离子体共振法、生物膜层干涉法或等温滴定量热法等方法检测

抗体与目标分析物的亲和力。若使用竞争酶联免疫吸附法见附录Ｅ。

６．７抗体交叉反应

宜使用竞争酶联免疫吸附法、表面等离子体共振法、生物膜层干涉法或等温滴定量热法等方法检测

抗体与目标分析物结构类似物的交叉反应。若使用竞争酶联免疫吸附法见附录Ｆ。

３

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７结果表述

７．１检测结果应包含样品的检测项目、试验样品信息、抽样信息及检测结论。

７．２单克隆抗体的检测结论应包括种属来源、抗体类型、纯度、浓度、效价、亲和力、交叉反应，并注明采

用的检测方法。

７．３多克隆抗体的检测结论应包括种属来源、浓度、效价、亲和力、交叉反应，并注明采用的检测方法。

４

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附录犃

（资料性）

抗体种属来源和抗体类型检测间接酶联免疫吸附法

犃．１原理

该方法使用可以识别不同种属来源和抗体类型的特异性抗体检测待测抗体的种类。根据待检测抗

体的种属来源和抗体类型选择合适的ＨＲＰ标记的特异性抗体若干，用于鉴定的抗体宜至少包括：抗小

鼠ＩｇＧ抗体、抗小鼠ＩｇＭ抗体、抗兔ＩｇＧ抗体、抗大鼠ＩｇＧ抗体、抗山羊ＩｇＧ抗体、抗仓鼠ＩｇＧ抗体、抗

绵羊ＩｇＧ抗体、抗鸡ＩｇＹ抗体。抗原包被浓度可根据实际情况适当修改。

在试验前，将除抗体、抗原母液以外的所有试剂恢复到室温。抗体、抗原母液融化后立即置于冰上。

试剂应轻轻旋转或振荡混匀。取出酶标板并拆除多余的酶标板条块后待用。

犃．２试剂与材料

犃．２．１磷酸盐缓冲液（ｐＨ＝７．２～７．４）：在８００ｍＬ水中加入１．１５ｇ磷酸氢二钠，０．２０ｇ磷酸二氢钾，

０．２０ｇ氯化钾，８．００ｇ氯化钠，溶解后，加水定容至１０００ｍＬ。

犃．２．２碳酸盐缓冲液（ｐＨ＝９．６）：在８００ｍＬ水中加入１．５９ｇ碳酸钠（无水），２．９３ｇ碳酸氢钠，溶解后，

加水定容至１０００ｍＬ。

犃．２．３封闭缓冲液：部分抗体可能与封闭液中的成分结合，影响检测结果。可根据实际情况选择以下

封闭液配方：

———配方１：称取６．００ｇ牛血清白蛋白，加磷酸盐缓冲液（ｐＨ＝７．２～７．４）定容至２００ｍＬ，４℃保存。

———配方２：在１６０ｍＬ水中加入２．００ｇ酪蛋白，１．１０ｇ氢氧化钠，３７℃磁力搅拌至完全溶解。然

后加入０．２３ｇ磷酸氢二钠、０．０４ｇ磷酸二氢钾、０．０４ｇ氯化钾，用盐酸调节ｐＨ值至７．２～７．４，

加水定容至２００ｍＬ，４℃保存。

犃．２．４洗涤缓冲液：在１０００ｍＬ磷酸盐缓冲液（ｐＨ＝７．２～７．４）中加入０．５ｍＬ吐温－２０。

犃．２．５抗体稀释液：在１００ｍＬ封闭缓冲液中加入０．０５ｍＬ吐温－２０，４℃保存。

犃．２．６ＴＭＢ显色工作液：根据以下配方，按照１∶１比例混合ＴＭＢ显色液Ａ与ＴＭＢ显色液Ｂ即成，

现配现用。

———ＴＭＢ储存液：在８０ｍＬＤＭＳＯ中加入１．００ｇＴＭＢ，溶解后，加ＤＭＳＯ定容至１００ｍＬ，－２０℃避

光保存。

———ＴＭＢ显色液Ａ：在４００ｍＬ水中加入０．２０ｇ乙二胺四乙酸二钠，０．９５ｇ柠檬酸，５０ｍＬ甘油，

２０ｍＬＴＭＢ储存液，溶解后，加水定容至５００ｍＬ，４℃避光保存。

———ＴＭＢ显色液Ｂ：在４００ｍＬ水中加入１３．６０ｇ三水合乙酸钠，１．６０ｇ柠檬酸，０．３ｍＬ过氧化氢

（３０％），溶解后，加水定容至５００ｍＬ，４℃避光保存。

犃．２．７反应终止液：在８００ｍＬ水中加入８３．３３ｍＬ浓盐酸，加水定容至１０００ｍＬ。

犃．２．８ＨＲＰ标记的特异性抗体。

犃．２．９酶标板（宜使用表面亲水的高吸附酶标板）。

犃．３操作步骤

犃．３．１包被：将抗原稀释至合适的浓度，一般为１０μｇ／ｍＬ～２０μｇ／ｍＬ，稀释液为碳酸盐缓冲液（ｐＨ＝

９．６）。酶标板每孔加入１００μＬ稀释后的抗原，用合适的塑料制品覆盖酶标板并在４℃下孵育过夜。

犃．３．２清洗：弃去酶标板中的液体，在吸水纸上轻轻拍干。然后每孔加入２００μＬ洗涤缓冲液，室温静

５

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置３ｍｉｎ后弃去酶标板中的液体，并在吸水纸上轻轻拍干，重复３次～５次。或使用微孔板自动洗板机

进行清洗，每次使用３００μＬ洗涤缓冲液，重复５次。

犃．３．３封闭：每孔加入２００μＬ封闭缓冲液，在３７℃恒温培养箱中孵育９０ｍｉｎ。

犃．３．４清洗：重复步骤Ａ．３．２。

犃．３．５待测抗体孵育：将待测抗体按１∶１０００比例稀释，稀释液为抗体稀释液。每孔加入１００μＬ稀释

后的待测抗体样品。在３７℃恒温培养箱中孵育６０ｍｉｎ。

犃．３．６清洗：重复步骤Ａ．３．２。

犃．３．７特异性抗体孵育：根据说明书稀释各种ＨＲＰ标记的识别不同种属来源和抗体类型的抗体，稀释

液为抗体稀释液。每孔加入１００μＬ稀释后的抗体，每种二抗重复３次。每次试验设置空白对照，空白

对照为不含有抗体的抗体稀释液，重复３次。在３７℃恒温培养箱中孵育６０ｍｉｎ。

犃．３．８清洗：重复步骤Ａ．３．２。

犃．３．９显色：每孔加入１００μＬＴＭＢ显色工作液。在３７℃恒温培养箱中避光孵育３０ｍｉｎ。反应结束

后每孔立即加入１００μＬ反应终止液。

犃．３．１０测量：反应终止后３０ｍｉｎ内，在酶标仪上测量并记录样品和空白对照的吸光度。检测波长为

４５０ｎｍ，参比波长为６２０ｎｍ。

犃．４结果分析

犃．４．１试验成立判定：当空白对照的吸光度小于或等于０．２，且最大测量结果的吸光度大于或等于０．８时，

试验成立。反之，应重做试验。

犃．４．２结果分析：按照式（Ａ．１）计算针对不同种属来源和抗体类型的抗体的相对显色强度。

ＯＤ犡－ＯＤＮＣ

犛犡＝…………（Ａ．１）

ＯＤｍａｘ－ＯＤＮＣ

式中：

犛犡———针对某种种属来源和抗体类型的特异性抗体的相对显色强度；

ＯＤ犡———针对某种种属来源和抗体类型的特异性抗体的吸光度测量值；

ＯＤＮＣ———阴性对照的吸光度测量值；

ＯＤｍａｘ———所有测量结果中的最大吸光度。

当仅有一种特异性抗体的相对显色强度为１，且其他的相对显色强度均小于或等于０．４时，可以判

定待测抗体的种属来源和抗体类型为相对显色强度为１的特异性抗体所识别的种属来源和抗体类型。

否则，无法判断待测抗体的种属来源和抗体类型，如有需要，可通过抗体氨基酸测序和序列分析对抗体

的种属来源和抗体类型进行判断。

６

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附录犅

（资料性）

抗体纯度检测高效液相色谱法

犅．１原理

使用高效液相色谱法检测单克隆抗体的纯度时，可通过体积排阻或离子交换等不同原理对样品中

的不同组分进行分离。

犅．２检测方法

犅．２．１待测样品：使用流动相Ａ适当稀释待测抗体。

犅．２．２液相色谱参考条件：

ａ）色谱柱：体积排阻色谱柱，３００ｍｍ×４ｍｍ（内径），填料粒径５μｍ，孔径３００?或性能相当者；

ｂ）柱温：２５℃；

ｃ）流动相Ａ：３００ｍｍｏｌ／Ｌ氯化钠，５０ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸钠盐，ｐＨ＝６．８的水溶液；

ｄ）流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ；

ｅ）进样量：５０μＬ；

ｆ）洗脱程序：１００％流动相Ａ等度洗脱。

犅．２．３紫外分光检测参考条件：

ａ）检测波长：２８０ｎｍ；

ｂ）检测频率：１０Ｈｚ。

犅．３结果分析

分析目标抗体峰及其他峰的峰面积，通过面积归一化法计算抗体的纯度。

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附录犆

（资料性）

抗体浓度检测高效液相色谱法

犆．１原理

利用蛋白Ａ（ＰｒｏｔｅｉｎＡ）、蛋白Ｇ（ＰｒｏｔｅｉｎＧ）等蛋白可以特异性识别并结合抗体Ｆｃ区域的特点，通

过亲和层析检测样品中抗体的浓度。

犆．２检测方法

犆．２．１待测样品：使用流动相Ａ适当稀释待测抗体。

犆．２．２标准样品：使用流动相Ａ将免疫球蛋白标准物质逐级稀释，得到抗体质量浓度为２０ｍｇ／Ｌ、

５０ｍｇ／Ｌ、１００ｍｇ／Ｌ、２００ｍｇ／Ｌ、５００ｍｇ／Ｌ、１０００ｍｇ／Ｌ的系列标准工作液，质量浓度由低到高进行检

测，以峰面积对质量浓度作图，做出标准曲线回归方程。

犆．２．３液相色谱参考条件：

ａ）色谱柱：蛋白Ａ（ＰｒｏｔｅｉｎＡ）亲和层析色谱柱，３５ｍｍ×４ｍｍ（内径），填料粒径１２μｍ或性能

相当者；

ｂ）柱温：２５℃；

ｃ）流动相Ａ：１５０ｍｍｏｌ／Ｌ氯化钠，５０ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸钠盐，ｐＨ＝７．５的水溶液；

ｄ）流动相Ｂ：１５０ｍｍｏｌ／Ｌ氯化钠，５０ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸钠盐，ｐＨ＝２．５的水溶液；

ｅ）流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ；

ｆ）进样量：５０μＬ；

ｇ）梯度洗脱程序见表Ｃ．１。

表犆．１梯度洗脱程序（亲和层析）

时间流动相Ａ流动相Ｂ

ｍｉｎ％％

－３．０１０００

０．０１０００

０．８１０００

１．００１００

３．００１００

犆．２．４紫外分光检测参考条件：

ａ）检测波长：２８０ｎｍ；

ｂ）检测频率：１０Ｈｚ。

犆．３结果分析

使用外标法计算测试液及待测样品中抗体的浓度。样品溶液中抗体的响应值应在标准曲线的线性

范围内，若超过线性范围则应稀释后再进行检测。

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附录犇

（资料性）

抗体效价检测间接酶联免疫吸附法

犇．１原理

使用间接酶联免疫吸附法检测抗体效价。抗体梯度稀释的比例宜为１∶２，抗体最终稀释度可根据

实际情况进行调整。抗原包被浓度可根据实际情况适当修改。

在试验前，将除抗体、抗原母液以外的所有试剂恢复到室温。抗体、抗原母液融化后立即置于冰上。

试剂应轻轻旋转或振荡混匀。取出酶标板并拆除多余的酶标板条块后待用。

犇．２试剂与材料

所需试剂与材料见Ａ．２。

犇．３操作步骤

犇．３．１包被：将抗原稀释至合适的浓度，一般为１０μｇ／ｍＬ～２０μｇ／ｍＬ，稀释液为碳酸盐缓冲液（ｐＨ＝

９．６）。酶标板每孔加入１００μＬ稀释后的抗原，用合适的塑料制品覆盖酶标板并在４℃下孵育过夜。

犇．３．２清洗：弃去酶标板中的液体，在吸水纸上轻轻拍干。然后每孔加入２００μＬ洗涤缓冲液，室温静

置３ｍｉｎ后弃去酶标板中的液体，并在吸水纸上轻轻拍干，重复３次～５次。或使用微孔板自动洗板机

进行清洗，每次使用３００μＬ洗涤缓冲液，重复５次。

犇．３．３封闭：每孔加入２００μＬ封闭缓冲液，在３７℃恒温培养箱中孵育９０ｍｉｎ。

犇．３．４清洗：重复步骤Ｄ．３．２。

犇．３．５一抗孵育：准备一系列倍比稀释的待测抗体，初始的稀释浓度一般为１∶１０００，稀释液为抗体稀

释液。每孔加入１００μＬ稀释后的待测抗体样品，每个浓度重复３次。每次试验设置空白对照，空白对

照为不含有抗体的抗体稀释液，重复６次。在３７℃恒温培养箱中孵育６０ｍｉｎ。

犇．３．６清洗：重复步骤Ｄ．３．２。

犇．３．７二抗孵育：根据二抗说明书稀释ＨＲＰ标记的二抗，稀释液为抗体稀释液。每孔加入１００μＬ稀

释后的二抗。在３７℃恒温培养箱中孵育６０ｍｉｎ。

犇．３．８清洗：重复步骤Ｄ．３．２。

犇．３．９显色：每孔加入１００μＬＴＭＢ显色工作液。在３７℃恒温培养箱中避光孵育３０ｍｉｎ。反应结束

后每孔立即加入１００μＬ反应终止液。

犇．３．１０测量：反应终止后３０ｍｉｎ内，在酶标仪上测量并记录各个孔的吸光度。检测波长为４５０ｎｍ，参

比波长为６２０ｎｍ。

犇．４结果分析

犇．４．１试验成立判定：当空白对照的吸光度小于或等于０．２时，试验成立。反之，应重做试验。

犇．４．２试验结果分析：当空白对照的吸光度小于或等于０．０５时，按照０．０５进行效价分析；当空白对照

的吸光度大于０．０５，并且小于或等于０．２时，按照实际测量结果进行效价分析。

犇．４．３当样品的吸光度大于或等于空白对照的吸光度的２倍时认定为阳性。结果为阳性的待测抗体

的最高稀释度为待测抗体的效价。

９

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附录犈

（资料性）

抗体亲和力检测竞争酶联免疫吸附法

犈．１原理

使用竞争酶联免疫吸附法检测抗体亲和力时，首先让溶液中的抗原与溶液中的抗体充分结合并达

到解离平衡，然后将溶液转移至底部包被有相同抗原的酶标板中。酶标板底部的抗原与溶液中游离的

抗体结合，从而分析溶液中游离抗体的含量，计算抗体与抗原间的解离常数。

分析过程中，酶标板底部抗原与溶液中游离抗体的结合将影响溶液中原有的抗原抗体解离平衡，

干扰检测结果。因此酶标板上包被的抗原量应尽可能低，但同时不影响观测。竞争酶联免疫吸附法检

测抗体亲和力通常分为两步，第一步明确酶标板上包被抗原的合适的量，第二步对亲和力进行分析。

犈．２试剂与材料

所需试剂与材料见Ａ．２。

犈．３操作步骤

犈．３．１选择合适的抗原包被浓度及抗体稀释倍数

犈．３．１．１包被：将抗原稀释至１μｇ／ｍＬ，稀释液为碳酸盐缓冲液（ｐＨ＝９．６）。酶标板每孔加１００μＬ稀

释后的抗原，用合适的塑料制品覆盖酶标板并在４℃下孵育过夜。

犈．３．１．２清洗：弃去酶标板中的液体，在吸水纸上轻轻拍干。然后每孔加入２００μＬ洗涤缓冲液，室温静

置３ｍｉｎ后弃去酶标板中的液体，并在吸水纸上轻轻拍干，重复３次～５次。或使用微孔板自动洗板机

进行清洗，每次使用３００μＬ洗涤缓冲液，重复５次。

犈．３．１．３封闭：每孔加入２００μＬ封闭缓冲液，在３７℃恒温培养箱中孵育９０ｍｉｎ。

犈．３．１．４清洗：重复步骤Ｅ．３．１．２。清洗结束后将部分酶标板条块拆下并安装在第２个架子上，每孔加

入２００μＬ洗涤缓冲液后，４℃储存备用。其余的酶标板条块用于Ｅ．３．１．５。

犈．３．１．５第１块酶标板加样：准备一系列倍比稀释的待测抗体，稀释液为磷酸盐缓冲液（ｐＨ＝７．２～

７．４），初始的稀释度一般为１∶１０００。每孔加入１００μＬ稀释后的待测抗体样品，每个浓度重复３次。

每次试验设置空白对照，空白对照为不含有抗体的磷酸盐缓冲液（ｐＨ＝７．２～７．４），重复３次。在３７℃

恒温培养箱中孵育３０ｍｉｎ。

犈．３．１．６第２块酶标板加样：将第１块酶标板中的液体小心吸出，每个浓度的３次重复混合为１管（略

少于３００μＬ）。取出Ｅ．３．１．４中备用的酶标板条块，将从第１块酶标板吸出的液体加入第２块酶标板

中，每孔加入１００μＬ样品，每个浓度重复２次。在３７℃恒温培养箱中孵育３０ｍｉｎ。

犈．３．１．７第１块酶标板清洗：按照Ｅ．３．１．２清洗第１块酶标板。

犈．３．１．８第１块酶标板二抗孵育：根据说明书稀释ＨＲＰ标记的相应二抗，稀释液为抗体稀释液。每孔

加入１００μＬ稀释后的二抗。在３７℃恒温培养箱中孵育６０ｍｉｎ。

犈．３．１．９酶标板清洗：按照Ｅ．３．１．２清洗第１、２块酶标板。

犈．３．１．１０第２块酶标板二抗孵育：根据说明书稀释ＨＲＰ标记的相应二抗，稀释液为抗体稀释液。每

孔加入１００μＬ稀释后的二抗。在３７℃恒温培养箱中孵育６０ｍｉｎ。

１０

犌犅／犜４０２６５—２０２１

犈．３．１．１１第１块酶标板显色与测量：每孔加入１００μＬＴＭＢ显色工作液。在３７℃恒温培养箱中避光

孵育３０ｍｉｎ。反应结束后立即每孔加入１００μＬ反应终止液。反应结束后３０ｍｉｎ内，在酶标仪上测量

并记录样品和空白对照的吸光度。检测波长为４５０ｎｍ，参比波长为６２０ｎｍ。

犈．３．１．１２第２块酶标板清洗：按照Ｅ．３．１．２清洗第２块酶标板。

犈．３．１．１３第２块酶标板显色与测量：同Ｅ．３．１．１１。

犈．３．１．１４浓度评价：取两块酶标板中处于线性范围内的测量结果，通过线性回归分析抗体稀释度与显

色强度的关系。如果两块酶标板的线性回归的斜率相差１０％以内，说明该包被浓度和试验条件适合进

行抗体亲和力检测，处于线性范围内的抗体最高浓度适合用于抗体亲和力检测。如果第２块酶标板的

显色强度大幅度降低，说明抗原包被浓度过高，应将抗原包被浓度降低至１／５～１／１０后重新进行以上试

验，直至获得合适的包被浓度。

犈．３．２亲和力检测

犈．３．２．１抗原包被：将抗原稀释至Ｅ．３．１中判断合适的浓度，稀释液为碳酸盐缓冲液（ｐＨ＝９．６）。每孔

加入１００μＬ稀释后的抗原，用合适的塑料制品覆盖酶标板并在４℃下孵育过夜。

犈．３．２．２清洗：弃去酶标板中的液体，在吸水纸上轻轻拍干。然后每孔加入２００μＬ洗涤缓冲液，室温静

置３ｍｉｎ后弃去酶标板中的液体，并在吸水纸上轻轻拍干，重复３次～５次。或使用微孔板自动洗板机

进行清洗，每次使用３００μＬ洗涤缓冲液，重复５次。

犈．３．２．３封闭：每孔加入２００μＬ封闭缓冲液，在３７℃恒温培养箱中孵育９０ｍｉｎ。

犈．３．２．４清洗：重复步骤Ｅ．３．２．２，４℃保存备用。

犈．３．２．５样品准备：将待测抗体样品稀释至Ｅ．３．１中判断处于线性范围的最高抗体浓度的２倍，稀释液

为磷酸盐缓冲液（ｐＨ＝７．２～７．４）。准备一系列倍比稀释的抗原，稀释液为磷酸盐缓冲液（ｐＨ＝７．２～

７．４），抗原的初始浓度一般为１μｍｏｌ／Ｌ。

犈．３．２．６抗原抗体结合：分别将２００μＬ稀释后的待测抗体样品与２００μＬ不同浓度的抗原在新的离心

管中混合。每次试验设置空白对照，空白对照为在２００μＬ稀释后的待测抗体样品与２００μＬ磷酸盐缓

冲液（ｐＨ＝７．２～７．４）的混合液。３７℃恒温培养箱中孵育９０ｍｉｎ。

犈．３．２．７加样：将Ｅ．３．２．６中反应结束的混合液转移至Ｅ．３．２．４保存的酶标板中，每孔１００μＬ，重复

３次。在３７℃恒温培养箱中孵育３０ｍｉｎ。

犈．３．２．８清洗：重复步骤Ｅ．３．２．