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文档简介
GB/T44619—2024
目次
前言
·····································································································
Ⅲ
1
范围
··································································································
1
2
规范性引用文件
······················································································
1
3
术语和定义
···························································································
1
4
福寿螺属及主要入侵种类
············································································
2
5
方法原理
······························································································
2
6
器具和试剂
···························································································
2
7
现场检疫
······························································································
3
8
实验室鉴定
···························································································
3
9
结果评定
······························································································
4
10
标本保存
····························································································
5
附录A(资料性)福寿螺属和重要种类基本信息
·····················································
6
附录B(资料性)福寿螺标本制作和保存
····························································
7
附录C(资料性)福寿螺属与圆田螺属基本信息及鉴别特征
·········································
8
附录D(资料性)福寿螺属常见近似种形态特征比较
···············································
12
附录E(资料性)福寿螺分子生物学检测方法
······················································
21
参考文献
································································································
22
Ⅰ
GB/T44619—2024
前言
本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规
定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。
本文件起草单位:中国计量大学、上海海关动植物与食品检验检疫技术中心、中国海关科学技术研
究中心、中国检验检疫科学研究院、广州海关技术中心。
本文件主要起草人:杨倩倩、刘静远、刘若思、俞晓平、徐晗、魏霜、叶子弘、许益鹏、刘光富、
李琛。
Ⅲ
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福寿螺检疫鉴定方法
1范围
本文件描述了福寿螺属及重要种类的检疫鉴定方法。
本文件适用于福寿螺属及重要种类的检疫鉴定。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文
件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用
于本文件。
SN/T3067—2011软体动物常规检疫规范
3术语和定义
SN/T3067—2011界定的以及下列术语和定义适用于本文件。
3.1
壳口aperture
贝壳上用于螺头和腹足出口的开口部位。
3.2
螺层whorl
贝壳的一层层组成,每旋转一周为一个螺层。
3.3
厣operculum
用以封闭壳口、形状与大小与壳口一致的角质或石灰质薄片。
3.4
阴茎
penis
螺的雄性生殖器官。
3.5
阴茎鞘腺penissheathglands
包裹阴茎的围鞘上用于分泌雄性激素的器官。
3.6
外套膜mantle
覆盖软体内脏囊、背缘与内脏团背面的上皮组织相连的膜状物。
3.7
卵块eggclutch
卵生动物产的卵形成的紧密排布的、黏结成钙质化的块状物。
1
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4福寿螺属及主要入侵种类
4.1福寿螺属
福寿螺属(Pomacea)隶属于腹足纲(Gastropoda)、新进腹足目(Caenogastropoda)、瓶螺科
(Ampullariidae)。其中,入侵性福寿螺主要有小管福寿螺(Pomaceacanaliculata)和斑点福寿螺
(Pomaceamaculata)。
福寿螺属的基本信息及小管福寿螺和斑点福寿螺的地理分布、经济危害、生活史、生物学特性、传
播方式等见附录A。
4.2小管福寿螺
拉丁学名:Pomaceacanaliculata(Lamarck)
英文名:channeledapplesnail
拉丁异名:AmpullariacanaliculataLamarck;Ampullariaaustralisd'Orbigny;AmpullariadorbignyanaR.
A.Philippi;AmpullariafigulinaSpix;Ampullariagualtierid'Orbigny;Pomacea(Pomacea)canaliculata(Lamarck);
PomaceacanaliculatachaquensisHyltonScott
4.3斑点福寿螺
拉丁学名:PomaceamaculataPerry
英文名:spottedapplesnail
拉丁异名:AmpullariaamazonicaReeve;AmpullariacastelnaudiiHupé;AmpullariacrosseanaHidalgo;
AmpullariageorgiiWilliams;AmpullariagigasSpix;Ampullariainsularumd'Orbigny
5方法原理
依据福寿螺的生物学特性和传播方式进行现场检疫,收集螺或卵。贝壳、厣、软体解剖形态和分子
特征是实验室鉴定的主要依据。
6器具和试剂
6.1器具
体视显微镜、电子天平、超声波清洗机、离心机、紫外分光光度计、聚合酶链式反应(PCR)仪、
电泳仪、凝胶成像系统、冰箱等仪器设备。放大镜、解剖剪、镊子、大烧杯、玻璃棒、培养皿、软毛
刷、1.5mL离心管、标签、吸水纸、游标卡尺、标本瓶、样品袋、移液枪、0.2mLPCR反应管等
用具。
6.2试剂
10%KOH或10%NaOH溶液、75%乙醇、无水乙醇、动物基因组DNA提取试剂盒、DNA纯化/回
收试剂盒、TaqDNA聚合酶、10×Taq缓冲液、dNTPs(脱氧核糖核苷三磷酸)、MgCl2溶液、引物、
双蒸水(ddH2O)、DNAmarker、6×loadingbuffer、琼脂糖、TAE(三羟甲基氨基甲烷、乙酸、乙
二胺四乙酸)缓冲液等。
除另有规定外,所有试剂均为分析纯。
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7现场检疫
对来自福寿螺发生区(见附录A)的运输工具和货物实施重点查验。仔细检查运输工具、水生植物
植株、繁殖材料及包装物、木质包装箱等是否有螺和卵块附着其上。检查来自福寿螺发生区的水生植物
及运输工具是否附着螺和卵,是否有白色产卵痕迹。一旦发现螺及卵标本,应采集装入样品袋或标本
瓶,做好记录,带回实验室做进一步检验鉴定。
8实验室鉴定
8.1形态学鉴定
8.1.1测量观察和软体解剖
用游标卡尺测量壳长和壳宽、卵粒直径。用放大镜或体视显微镜仔细观察卵和螺的形态特征。
用热激法处理成螺(见附录B),齿舌的制作与保存按照SN/T3067—2011中附录B执行。
8.1.2福寿螺属形态特征
8.1.2.1贝壳
贝壳球形,成螺一般壳高30mm以上。种间及种内壳色多变,黄色、棕色、深棕色、浅绿色、暗绿
色等。壳面较光滑,具细小的生长线,有的具螺旋状暗带。螺旋部短,壳顶圆钝,有5个~6个螺层,
各螺层上部呈肩状,体螺层肩部最明显,无喙,螺层均外凸,螺层在宽度上增长迅速,体螺层极膨大,
一般占壳高的80%以上。内唇上方贴覆于体螺层上,形成薄的胼胝。脐孔大而深。
8.1.2.2厣
厣内凹卵圆形,能紧密地封闭壳口,厣核偏于内侧中部,内表面光滑,与腹足相贴的疤痕卵圆形;
雌雄二型,雄成螺在近外侧中部隆起,外缘向壳口内折翻,雌成螺平滑无翻折。
8.1.2.3生殖系统
雄性生殖器官由精巢、输精管、前列腺囊、前列腺和阴茎等组成;阴茎粗大,长三角形,侧面中央
有一条开放式的纤毛沟。雌性生殖系统具有发达的蛋白腺,分泌卵周液,不同物种呈鲜红、淡粉、淡绿
等不同颜色。
8.1.2.4齿舌
齿舌带状,质较硬,每一横列含有1个中央齿,中央齿中间有一宽大突起,大而尖,倒三角形;中
央齿两侧对称排列1个侧齿和2个缘齿。
8.1.3小管福寿螺形态特征
8.1.3.1贝壳
卵球形,质较薄,色多变,黄色、暗绿色、黄棕色等。中等大小,壳高30mm~50mm,5个~6个
螺层,体螺层占壳高的84%~93%。体螺层肩部圆弧形。壳面较光滑,具有细小的轴向生长线,有的具
暗红色、暗绿色或暗褐色的螺旋状暗带。壳口大,近卵圆形。内唇无染色。
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8.1.3.2厣
中间略厚,边缘薄,厚度不均一,有韧性,深棕色。
8.1.3.3雄性生殖器
阴茎鞘具顶腺和中腺,无基腺。顶腺约占阴茎鞘腹侧末端的1/2,表面褶皱;中腺位于阴茎鞘腹侧
中间,纤毛沟的右侧,卵圆形,表面光滑。
8.1.3.4齿舌
中央齿第一突起宽而短,从基部到顶端呈外凸弧形弯曲。
8.1.4斑点福寿螺形态特征
8.1.4.1贝壳
圆球形,质较厚而坚固,黄棕色,壳高30mm~70mm,偶见70mm以上,有些个体可达170mm。
5个~6个螺层,体螺层占壳高的89%~97%。体螺层肩部角形。壳面较光滑或具有细小的轴向生长
线,有的具暗红色、暗绿色或暗褐色的螺旋状暗带。壳口大,近卵圆形。有的个体内唇染有黄色或红
橙色。
8.1.4.2厣
厚度均一,无韧性,深棕色。
8.1.4.3雄性生殖器
阴茎鞘具顶腺和基腺,无中腺。顶腺约占阴茎鞘腹侧末端的1/2,表面褶皱;基腺位于阴茎鞘腹侧
基部,纤毛沟的偏右侧,表面较光滑。
8.1.4.4齿舌
中央齿第一突起宽而短,从基部到顶端呈内凹弧形弯曲。
8.1.5福寿螺属与近似属及属内近似种间的鉴别
圆田螺属(Cipangopaludina)是福寿螺属的本土近似属,近似属的鉴别特征见附录C。
福寿螺属常见近似种主要有小管福寿螺、斑点福寿螺、隐秘福寿螺(P.occulta),近似种的鉴别特
征见附录D。
8.2分子生物学鉴定
参考附录E的方法提取福寿螺的基因组DNA、扩增线粒体COI序列并进行双向测序。
9结果评定
9.1形态学方法
以成螺外生殖器形态为基本鉴定依据,贝壳、厣和齿舌形态辅助鉴定。符合8.1.3.3或同时符合
8.1.3.1、8.1.3.2、8.1.3.4形态特征的福寿螺鉴定为小管福寿螺;符合8.1.4.3或同时符合8.1.4.1、
8.1.4.2、8.1.4.4形态特征的福寿螺鉴定为斑点福寿螺。
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9.2分子生物学方法
与已知福寿螺的COI基因序列进行比对,并构建邻接法系统发育树,相似度≥93.1%或系统发育树
聚类为一枝的待鉴定样品确定为相应福寿螺种类。
10标本保存
参考附录B制作标本,用于形态鉴定的软体组织保存于75%乙醇溶液,贝壳和厣风干保存,避光、
干燥、防虫蛀、避免挤压。用于分子鉴定的软体组织保存无水乙醇,卵无需浸泡,-20
℃下长期保存。
各类型标本均需记录学名、截获/收集时间、地点、寄主、鉴定人等相关信息,至少妥善保存6个月。
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附录A
(资料性)
福寿螺属和重要种类基本信息
A.1地理分布
福寿螺属原产于南美洲、中美洲及加勒比海地区。小管福寿螺和斑点福寿螺是福寿螺属最具入侵性
的物种。
小管福寿螺原产于阿根廷、乌拉圭、巴拉圭和巴西等,已入侵亚洲的中国(台湾、香港、海南、
广东、广西、云南、贵州、福建、江西、四川、重庆、湖南、湖北、安徽、浙江、江苏、上海、
山东)、日本、韩国、泰国、马来西亚、柬埔寨、印度尼西亚、菲律宾、越南,北美洲的美国(亚利桑
那州、加利福尼亚州、夏威夷),大洋洲的巴布亚新几内亚等。
斑点福寿螺原产于巴西、阿根廷、乌拉圭、巴拉圭、玻利维亚、厄瓜多尔、秘鲁等,已入侵亚洲的
中国(台湾、香港、四川、重庆、浙江、江苏、山东)、日本、泰国、马来西亚、柬埔寨、菲律宾、越
南、新加坡、以色列、巴基斯坦,欧洲的西班牙,北美洲的美国(南部沿海各州,如佛罗里达州、得克
萨斯州、南卡罗来纳州、乔治亚州等)。
A.2经济危害
小管福寿螺和斑点福寿螺寄主植物主要包括水稻(Oryzasativa)、茭白(Zizanialatifolia)、莲藕
(Nelumbonucifera)、芡实(Euryaleferox)、菱角(Trapabispinosa)、慈菇(Sagittariasagittifolia)、
荸荠(Eleocharisdulcis)、莼菜(Braseniaschreberi)、水芹(Oenanthestolonifera)、蕹菜(Lpomoea
aquatica)、芋(Colocasiaesculenta)等水生蔬菜。吞食植物嫩茎叶,捕食淡水无脊椎动物及底栖生物,
并与本土淡水螺竞争资源,鲜红色卵块附着在植物、石壁及建筑物等上,破坏生态景观,作为广州管圆
线虫(Angiostrongyluscantonensis)等多种人畜共患寄生虫的中间宿主,影响寄生虫病的流行范围与传播
强度。
A.3生活史
小管福寿螺和斑点福寿螺雌雄异体、体内受精,螺高30mm~33mm时(3月龄~4月龄)交配后
产卵,初产卵壳胶质,数小时后变硬,卵块鲜红色,一般1周~2周孵化,孵化率为87%~100%,成
螺寿命可达1年~3年。
A.4生物学特性
小管福寿螺和斑点福寿螺具两栖性,既有腮又有肺,附着于植物茎干、石壁等在水面上方7cm~
15cm处产卵。适生温度为25℃~30℃,25℃时存活率最高,低于10℃或高于35℃时逐渐进入冬眠或
夏眠。
A.5传播方式
幼螺和成螺具有一定的主动扩散能力;通过附着在寄主植物及睡莲(Nymphaeaspp.)、再力花
(Thaliadealbata)、香蒲(Typhaorientalis)、水葱(Schoenoplectustabernaemontani)、黄菖蒲(Iris
pseudacorus
)、冷水花(Pileaspp.)等挺水植物随种苗调运或附着于船舶随航运远距离扩散。
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附录B
(资料性)
福寿螺标本制作和保存
B.1形态鉴定标本制作
采用热激法解剖福寿螺。取活体螺置于大烧杯,待腹足及头部伸出或爬行时,将沸水快速倒入烧杯
至2/3处,使用玻璃棒快速搅拌3min~5min;置于培养皿中稍冷却后,用镊子夹住头和腹足部顺着螺
旋方向将软体完整分离出来,雄成螺可将阴茎鞘从外套膜右侧底部翻出。
将软体组织浸泡于75%乙醇溶液中脱水,每24h更换1次溶液,共换2次~3次;使用软毛刷清理
贝壳和厣表面的泥土、藻类等;用流水冲洗贝壳内部,如内部有残留软体组织,使用超声波清洗机清洗
干净并自然风干。
B.2分子鉴定标本制作
成螺:使用解剖剪将软体组织剪碎,浸泡于含有无水乙醇的1.5mL离心管。
幼螺:将贝壳敲碎或打孔后浸泡于无水乙醇。
卵:将卵块置于含有10%KOH或10%NaOH溶液的培养皿中,浸泡3min~5min后分离卵粒,用
灭菌水漂洗数遍并用75%乙醇漂洗2遍后晾干,置于-20
℃冰箱中灭活胚胎。
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附录C
(资料性)
福寿螺属与圆田螺属基本信息及鉴别特征
C.1分类地位
福寿螺属(Pomacea)隶属于隶属于软体动物门(Mollusca)、腹足纲(Gastropoda)、新进腹足目
(Caenogastropoda)、瓶螺科(Ampullariidae);圆田螺属(Cipangopaludina)隶属于软体动物门、
腹足纲、中腹足目(Mesogastropoda)、田螺科(Viviparidae)。
C.2生物学特性
福寿螺属两栖,有腮和肺;卵生,大多数物种水面上方产卵,个别物种水中产卵;取食范围广,以
动植物为食,尤喜食水生维管束植物的嫩茎和幼叶。
圆田螺属水生,仅有腮;卵胎生,体内受精发育,仔螺直接排入水中;以多汁的水生植物叶片、藻
类及泥土中的腐殖质为食。
C.3贝壳
福寿螺属贝壳质地比田螺属较厚,种间及种内壳色多变,黄色、棕色、深棕色、绿色、暗绿色等,
球形,5个~6个螺层,螺旋部低矮,体螺层占壳高80%以上;壳顶圆钝,壳面较光滑,具细小的生长
线,有的具螺旋状暗带;有些个体内唇染色;脐孔大而深。
圆田螺属贝壳黑褐色或褐绿色,宽圆锥形,6个~7个螺层,螺旋部高度大于壳口高度,体螺层约
占壳高68%;壳顶尖锐,壳面光滑,具细密的生长线,一般无螺旋状暗带;内唇无染色,部分或全部遮
盖脐孔,使脐孔呈缝状。
小管福寿螺、斑点福寿螺与中国圆田螺贝壳特征比较见图C.1、图C.2和图C.3。
C.4厣
福寿螺属厣角质或石灰质,厣核偏于内侧中部。
圆田螺属厣角质,厣核靠近内唇中央。
C.5齿舌
福寿螺属齿舌较硬,长而宽;中央齿中间有一宽大突起,大而尖,倒三角形。
圆田螺属齿舌柔软,短而窄;中央齿呈弧形弯曲,中间第一突起宽,短而不突出,方形。
小管福寿螺与斑点福寿螺的齿舌形态见图D.5和图D.10;中国圆田螺齿舌和中央齿形态见图C.4。
C.6软体部分
福寿螺属雌性具有发达的蛋白腺,分泌卵周液,小管福寿螺和斑点福寿螺因富合虾青素而呈鲜红
色;圆田螺属雌性蛋白腺不具有分泌功能,只起输送液体的作用。
福寿螺属雄性阴茎发达,大而呈长三角形;圆田螺属雄性阴茎外形呈鞭状,基部粗,顶端较细。小
管福寿螺、斑点福寿螺和中国圆田螺的雄性生殖系统形态分别见图D.3、图D.8和图C.5。
8
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标引序号说明:
a─正侧面观;
b─横侧面观;
c─背面观;
d─背侧面观。
[来源:叶苗等,2017]
图C.1小管福寿螺贝壳形态
标引序号说明:
e
─正侧面观;
f
─横侧面观;
g─背面观;
h─背侧面观。
[来源:叶苗等,2017]
图C.2斑点福寿螺贝壳形态
9
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标引序号说明:
i─正侧面观;
j─横侧面观;
k─背面观;
l─背侧面观。
[来源:叶苗等,2017]
图C.3中国圆田螺贝壳形态
图C.4中国圆田螺齿舌和中央齿
10
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标引序号说明:
1─精巢;
2─输精管;
3─前列腺;
4─阴茎;
5─雄性生殖孔;
6─眼;
7─阴茎伸缩肌。
[来源:金志良,1978]
图C.5中国圆田螺雄性生殖系统
11
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附录D
(资料性)
福寿螺属常见近似种形态特征比较
D.1小管福寿螺的形态特征见图D.1~图D.5。
[来源:Hayes等,2012]
图D.1小管福寿螺的贝壳
[来源:Hayes等,2012]
图D.2小管福寿螺的厣
12
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标引序号说明:
A
─顶腺;
B
─中腺;
C
─腹基腺;
p
─阴茎;
apsg
─顶端阴茎鞘腺;
mpsg─中间阴茎鞘腺;
msc
─中隔沟;
pb
─阴茎球;
pp
─阴茎囊;
ps
─前列腺;
ct
─栉鳃;
me
─外套膜边缘。
[来源:Hayes等,2012]
图D.3小管福寿螺的雄性生殖系统
13
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[来源:Hayes等,2012]
图D.4小管福寿螺的卵块
[来源:Hayes等,2012]
图D.5小管福寿螺的齿舌和中央齿
D.2斑点福寿螺的形态特征见图D.6~图D.10。
14
GB/T44619—2024
[来源:Hayes等,2012]
图D.6斑点福寿螺的贝壳
[来源:Hayes等,2012]
图D.7斑点福寿螺的厣
15
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标引序号说明:
A
─顶腺;
B
─基腺;
C
─腹基腺;
apsg─顶端阴茎鞘腺体;
bpsg─基部阴茎鞘腺体;
pb
─阴茎球;
pp
─阴茎囊;
ps
─前列腺;
ct
─栉鳃;
me
─外套膜边缘。
[来源:Hayes等,2012]
图D.8斑点福寿螺的雄性生殖系统
16
GB/T44619—2024
[来源:Hayes等,2012]
图D.9斑点福寿螺的卵块
[来源:Hayes等,2012]
图D.10斑点福寿螺的齿舌和中央齿
D.3隐秘福寿螺的形态特征见图D.11~图D.15。
17
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图D.11隐秘福寿螺的贝壳
图D.12隐秘福寿螺的厣
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标引序号说明:
apsg─顶端阴茎鞘腺体;
bpsg─基部阴茎鞘腺体。
图D.13隐秘福寿螺的雄性生殖系统
图D.14隐秘福寿螺的卵
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图D.15隐秘福寿螺的齿舌
D.4小管福寿螺、斑点福寿螺和隐秘福寿螺的形态鉴别特征比较见表D.1。
表D.1三种近似福寿螺物种形态特征比较
项目小管福寿螺斑点福寿螺隐秘福寿螺
贝壳表面平滑较平滑,具细轴线生长线较平滑,具细轴线生长线
体螺肩圆弧形角形角形
内唇无染色染黄色或橙红色染黄色或橙红色
厣有韧性,中间厚,边缘薄不具韧性,均一厚度有韧性,中间厚,边缘薄
齿舌基部外凸内凹内凹
具顶腺和中腺,中腺位于阴具顶腺和中腺,中腺位于阴茎腹
阴茎鞘腺具顶腺和基腺
茎腹侧纤毛沟右侧侧纤毛中间
卵粒数每块十几粒至几百粒每块几百粒至4500粒以上每块十几粒至上千粒
卵平均直径>3.00mm<2.00mm2.00mm~3.00mm
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附录E
(资料性)
福寿螺分子生物学检测方法
E.1基因组DNA提取
取单粒卵、单个幼螺或使用电子天平称取约5mg软体组织,用吸水纸吸干表面,使用动物基因组
DNA提取试剂盒提取DNA。
E.2DNA质量检查
通过紫外分光光度计测定DNA溶液的OD值,DNA纯度为OD260与OD280的比值(OD260指核酸
在260nm的吸光值,OD280指蛋白质在280nm的吸光值)。DNA浓度为50与OD260的乘积,单位为微
克每毫升(
μg/mL)。
当DNA溶液的OD260与OD280比值的范围为1.6≤OD260/OD280≤2.0适用于PCR反应,当
OD260/OD280<1.6或OD260/OD280>2.0时,DNA溶液纯度不够,需使用DNA纯化/回收试剂盒纯化后
才可用于PCR。
E.3COI序列扩增引物
LCO1490:5'﹘GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG﹘3'
HCO2198:5'﹘TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA﹘3'
E.4反应体系
反应体系为25μL:DNA模板1μL,LCO1490(10μmol/L)1μL,HCO2198(10μmol/L)
1μL,10×Taq缓冲液2.5μL,dNTPs(各2.5mmol/L)2μL,MgCl2溶液(25mmol/L)2μL,Taq
DNA聚合酶(5U/μL)0.125μL,ddH2O15.375μL。
E.5PCR扩增条件
使用PCR仪进行扩增反应,设置条件为94℃5min;94℃30s,50℃30s,72℃50s,30~35个循
环;72℃10min;4℃。
E.6电泳
取2μLPCR产物与1μL6×loadingbuffer混合后,使用1%的琼脂糖凝胶在含有TAE缓冲液的电泳
仪中检测,使用DNAMarker分子标量,并设置ddH2O为阴性对照。经凝胶成像系统检测后,将阳性
PCR产物测序。
E.7测序
使用Sanger测序法,利用引物LCO1490和HCO2198进行双向测序。确定所得序列为单峰后,拼接
双向序列并剪切两端引物区,获得核心COI片段。
21
GB/T44619—2024
参考文献
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