流式细胞术的发展和细胞组学新技术游东生

Cell-based71%Biochemical23%Uncertain6%Cell-based40%Biochemical60%Past5yearsInDevelopmentSource:Dr.PriyaKunapuli,SeniorResearchScientist,MerckResearchLaboratories;Dec.2002Keytakeaways:Rapidmovementtocell-basedassaysforcontextualanalysis以细胞为主要研究对象的课题数量变化细胞水平研究的历史、现在和未来暗视野光镜，相差显微镜，微分干涉对比显微镜，偏振光显微镜，荧光显微镜单光子共聚焦显微镜，多光子共聚焦显微镜大体荧光成像系统细胞计数仪18世纪，明视野显微镜发明流式细胞仪分光高度计，荧光高度计，干涉光高度计放射自显影细胞成像定量分析系统???形态学研究工具的发展历程SimpleopticalmicroscopeBasicclinicalscopeResearchgradefluorescencescopeHigh-endautomatedHCSsystemsConfocalscanningsystem32支试管自动上样盘（MCL)Walkaway独立获取样本，减轻操作劳动MCL自动模式.MCL手工模式.单管上样模式.暂停/转动功能可以方便地往试管加入刺激剂或终止剂进行试验

每支试管检测前单独震动混匀，有利于均匀获取细胞自动上样方式FC500MPL24孔0.5–2.5ml每孔容量96标准孔和深孔反应板250ul最小容量40支试管(12x75mm)1ml最小体积可以固定体积上样检测175ul吸样量可以减少高通量工作需要的烦杂的取样过程适合于零成本绝对计数将您的注意力从操作中解放出来，而集中于思路的创新从模拟信号到

先进的数字化信号数字化信号转换对数查表保证最优化的线性和稳定性4次幂转换误差<1%光纤通讯速度快保真性高实时获取数据和分析报告结果20比特的数据，补偿数字化全矩阵正反补偿

离线补偿线性对对数查表VS普通对数放大

从相邻相邻相减到

减法全矩阵

到正反全矩阵数字化补偿方法特别适用于三色以上补偿，准确方便适用于三色以下补偿和提供多色人工修正补偿的机会对于分群明显但补偿不好的文件可以在结果中直接补偿对于稀有标本或复杂实验，发现结果不好时不必进行实验的重新操作而可以用离线补偿进行抢救数据离线补偿后得到的补偿文件应用于LMD文件进行重新补偿离线补偿自动设置后得到的设置文件应用于新样本的获取FC500离线补偿界面从其它系统到Windows系统多种方式的图形重叠点击将结果输出至WORD,PPT文件点击将结果直接以EXCEL结果输出点击将结果直接以PDF格式输出操作平台和结果输出的变化FCS3.0文件包含20比特的原始数据，10比特获取时经过补偿的数据和获取时的方案可以直接以LMD结果文件来获取新的样本分析时不须预先打开方案，而可以直接打开LMD结果文件进行分析可以重新进行补偿LISTMODE文件格式数据量的变化细胞在进入流动室之前已经经过流体力学聚焦形成分散独立的颗粒流动室两边电极产生电流，细胞通过时产生的电阻可以用来计数细胞和体积（大小）

引入全新的细胞参数，如精确细胞大小测定，增加不同的前向角收集角度3664055465784355种主要的激发波长提供了分析包括紫外光在内的灵活的分析方式

特殊光源（特别是UV和大功率激光）的应用大功率紫外激光5%16%25%100%体积增加直径增加直径vs.体积本图所示说明了体积分析对细胞大小的分析的敏感性远远超过前向角散射光分析

ECVFS前向角散射光分析

vs.体积分析QUANTA联合体积分析和荧光分析的优势

其它经典CYTOMETERNormalNucleiMalignantNucleiNPEAnalysisNPEAnalysisNPE=5.8NPE>16.0NPE=核质包装效率Wheredoyouseparateviable/nonviable?体积参数对死活细胞的良好分群Quanta是目前市场上分析精度最高的分析工具，能用的染料最多，并且能同时得到细胞大小的精确信息

4.407565528530.9027.74%1,554129.56.3G2

11.78082353408.46124.64%4,947108.85.9S-Phase

5.901847290295.86257.93%11,633825.4G1ColorCV1Mode1Mean1PctCountsMCVDiameterRegionNameDNAdyesusedontheQuantaInclude:DAPIPropidiumIodideDraq5Hoechst7-AAD体积参数在分析细胞周期中的作用经典的免疫系统细胞分析

INNATEPMNNUETROPHILSEOSINOPHILSBASOPHILSMONOCYTES/MACROPHAGESDENDRITICCELLS:mDC-pDC

NKCELLSNKTCELLS

gdTLYMPHOCYTESCD5+BCELLS

ADAPTIVEBCELLSHELPERT-CELLS Th1 Th2

REGULATORYT-CELLS(Th3)CYTOTOXICT-CELLS两群树突状细胞－MDC/PDC先天免疫细胞分析－NK细胞多色分析离我们越来越近越来越多的细胞缺乏特异性标记，需要越来越多的标记来限定。多色分析的优势是2>1+1,3>2+1,3>>1+1+1,ETC..节省试剂和工作量。如果做非常全面的免疫分型，三色需要20支试管，四色需要12支，而五色只需要6支。越来越多的生命活动研究需要多参数多角度分析，例如凋亡，AICD等。抗原特异性T细胞分析四聚体（tetramer)染色细胞因子分泌试验ELISPOTCytokineSecretionAssay不同厂家的MHC四聚体产品不太一样：贝克曼库尔特公司创造性地构建和表达了MHC分子α3链的区域突变的蛋白（iTAg），能降低其与非特异性T细胞结合，大大提高了特异性。并且将MHC四聚体直接标记荧光，和常用的抗原多肽负载后整体商品化，也有单独的MHC分子（iTAg）单独出售，极大方便了研究者

利于此技术关键问题在四聚体制备，最大的问题不是没有阳性细胞，而是阳性率太高四聚体染色技术BeckmanCoulter已经有的部分产品抗原决定簇分析的科学平台

—iTopiaEpitopeDiscoverySystem在目前主要以数据库为基础的理论性分析抗原决定簇的基础上，iTopia技术平台为研究者研究免疫的发生发展、疫苗的研制和免疫学检测提供了一个科学合理的解决方案分泌细胞因子的细胞的检测和分选DC与TLR分子和T细胞的相互作用DCCaptureAgViaTLRInducedActinRemodelingTLRactivateDCendocytosis-FITC-dextranincubationMatureDCPrimingNaïveTCells贝克曼库尔特公司PLG试剂能测定保存长达5天的陈旧血世界首先专利特殊的克隆号和抗体保存秘方更多的此类抗体即将问世贝克曼库尔特公司BBA试剂

能同时检测10种细胞因子*HumanTh1/Th2CytokineIKitFL2

(ReporterParameter)FL4

(DifferentiatorParameter)CellsBeads

细胞表面标记和样本可溶性蛋白同时检测系统－单种可溶性蛋白FL1FL4FL2FL4FL1SSFL4EVENTSBeadsCells

细胞表面标记和样本可溶性蛋白同时检测系统－多种种可溶性蛋白干细胞中的研究应用

-Hoechst33342sidepopulation干细胞能表达ABCG2泵蛋白，在HOECHST33342染色时能将该染料泵出，因此分析不能被该染料染色的细胞群时可以发现一群不能染色的细胞既是干细胞，因此能够在众多肿瘤细胞中区分出肿瘤干细胞。QUANTA检测SP细胞群EPICSAltra测定SP细胞群流式细胞仪对细胞结构的分析细胞酶活性检测Th1细胞DPPIV活性实时检测与验证神经元细胞融合检测利用DIL,DIO对神经元细胞进行染色观察和流式检测流式细胞术在生物医学研究的新方向细胞多态性分析：受体、抗原折叠、HLA等，包括CXCR4,CCR5,DC-SIGN(与AIDS易感性有关）