2024 饲用微生物制剂中产朊假丝酵母的测定

GB/T45033—2024

目次

前言

·····································································································

Ⅲ

1

范围

··································································································

1

2

规范性引用文件

······················································································

1

3

术语和定义

···························································································

1

4

试剂或材料

···························································································

1

5

仪器和设备

···························································································

1

6

采样

··································································································

1

7

试验步骤

······························································································

2

8

试验数据处理

·························································································

3

附录A（资料性）

培养基

·············································································

5

附录B（规范性）

生理生化试验

······································································

6

附录C（规范性）

分子生物学鉴定

···································································

9

Ⅰ

GB/T45033—2024

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规

定起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC76）提出并归口。

本文件起草单位：山东宝来利来生物工程股份有限公司、安琪酵母股份有限公司、北京大北农科技

集团股份有限公司、浙江科峰生物技术有限公司、唐山拓普生物科技有限公司、益海嘉里（防城港）生

物科技有限公司。

本文件主要起草人：谷巍、单宝龙、徐海燕、谢全喜、辛国芹、汪祥燕、亓秀晔、覃先武、刘雪连、

章亭洲、周雪玲、马立周。

Ⅲ

GB/T45033—2024

饲用微生物制剂中产朊假丝酵母的测定

1范围

本文件描述了饲用微生物制剂中产朊假丝酵母（Candidautilis）菌数的测定方法。

本文件适用于含有产朊假丝酵母饲用微生物制剂的测定。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文

件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用

于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T42959饲料微生物检验采样

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4试剂或材料

除非另有规定，仅使用分析纯试剂。

4.1水：GB/T6682，三级。

4.20.85%灭菌生理盐水：准确称取8.5g氯化钠加入1000mL水中，搅拌至完全溶解，分装后，121℃

灭菌30min，备用。

4.3孟加拉红琼脂培养基：见附录A中A.1。

4.4酵母膏胨葡萄糖（YPD）琼脂培养基：见A.2。

5仪器和设备

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他仪器设备如下。

5.1培养箱：可控精度±1℃。

5.2天平：感量为0.1g。

5.3光学显微镜：400倍～1000倍。

5.4拍击式均质器及无菌均质袋。

5.5旋涡混合器。

5.6无菌培养皿：直径90mm。

5.7聚合酶链式反应（PCR）仪。

6采样

按照GB/T42959执行。

1

GB/T45033—2024

7试验步骤

7.1样品稀释

7.1.1固体、半固体或液体样品：称取25g样品或以无菌吸管吸取25mL样品，置于装有225mL

0.85%灭菌生理盐水（4.2）的500mL无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中或无菌均质袋

（5.4）中，充分振摇或用拍击式均质器拍打1min～2min，制成1∶10样品匀液。

7.1.2取1mL1∶10样品匀液注入含有9mL0.85%灭菌生理盐水（4.2）的试管中，在旋涡混合器

（5.5）中混匀，此液为1∶100的样品匀液。

7.1.3按7.1.2操作，制备10倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用一支1mL无菌吸管或

吸头。

7.1.4将15mL～20mL冷却至46℃～50℃的孟加拉红琼脂培养基（4.3）（可放置于48℃±2℃）倾

注于无菌培养皿（5.6）中，水平放置待琼脂凝固。

7.1.5选择2个～3个适宜稀释度的样品稀释匀液（液体样品可包括原液），吸取0.1mL该样品稀释匀

液于两个培养皿的孟加拉红琼脂上。同时，分别吸取0.1mL0.85%灭菌生理盐水（4.2）加入另两个培

养皿的孟加拉红琼脂上做空白对照。使用无菌涂布棒快速地涂布均匀。

7.2培养

涂布结束后水平放置10min，将平板倒置，置于28℃±1℃培养箱（5.1）中，培养72h±2h。

7.3观察菌落形态

典型产朊假丝酵母菌落平坦，表面湿润，菌落表面中心呈白色（略带浅粉色）或粉红色，边缘

整齐。

7.4菌落计数

选取产朊假丝酵母疑似菌落数在15CFU～150CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。

7.5确证

7.5.1菌种纯化

挑取同一稀释度的5个产朊假丝酵母疑似菌落进行确证试验。将产朊假丝酵母疑似菌落分别划线转

接培养于YPD琼脂培养基（4.4）上，28℃±1℃培养24h，获得单菌落纯培养物。

7.5.2形态观察

挑选7.5.1培养的纯培养物，于400倍光学显微镜（5.3）下观察菌体形态。产朊假丝酵母细胞为椭

圆形，大小为（3.5～4.5）µm×（7.0～13.0）µm，多边出芽。

7.5.3生理生化试验

按附录B规定的生理生化试验进行鉴定。产朊假丝酵母菌种主要生理生化特性应符合表1的要求。

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GB/T45033—2024

表1产朊假丝酵母菌种主要生理生化特性

试验项目结果

D﹘葡萄糖+

蔗糖+

麦芽糖-

糖类发酵

半乳糖-

乳糖-

海藻糖-

D﹘葡萄糖+

D﹘木糖+

纤维二糖+

碳源同化

蔗糖+

松三糖+

D﹘山梨醇+

注：“+”表示阳性反应，“-”表示阴性反应。

7.5.4分子生物学鉴定

如有必要按附录C进行分子生物学鉴定。

8试验数据处理

8.1若只有一个稀释度平板上的菌落数在15CFU～150CFU之间时，计算两个平板菌落数的平均值。

根据菌落计数结果和证实为产朊假丝酵母的菌落数，计算出平板内的菌数，然后乘其稀释倍数即得每克

样中产朊假丝酵母活菌数N，按公式（1）计算。

A×B×f

N=…………（1）

5

式中：

N─每克或每毫升样品中产朊假丝酵母菌落数，单位为菌落形成单位每克（CFU/g）或菌落形成单

位每毫升（CFU/mL）；

A─产朊假丝酵母疑似菌落数的数值，单位为菌落形成单位（CFU）；

B─5个鉴定的菌落中确认为产朊假丝酵母菌落数的数值，单位为菌落形成单位（CFU）；

f─稀释倍数的数值，单位为克（g）或毫升（mL）；

5─选出的产朊假丝酵母疑似菌落的数值，单位为菌落形成单位（CFU）。

8.215CFU～150CFU（2）。

如两个连续稀释度平板上的菌落数均在∑之间时，按公式计算

C×B×f

N=…………（2）

5(n1＋0.1n2)

式中：

N─每克或每毫升样品中产朊假丝酵母菌落数，单位为菌落形成单位每克（CFU/g）或菌落形成

单位每毫升（CFU/mL）；

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GB/T45033—2024

∑

C─适宜稀释度平板产朊假丝酵母疑似菌落数的总和，单位为菌落形成单位（CFU）；

B─5个鉴定的菌落中确认为产朊假丝酵母菌落数的数值，单位为菌落形成单位（CFU）；

f─低稀释倍数的数值，单位为克（g）或毫升（mL）；

5─选出的产朊假丝酵母疑似菌落的数值，单位为菌落形成单位（CFU）；

n1─第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；

n2─第二稀释度（高稀释倍数）平板个数。

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GB/T45033—2024

附录A

（资料性）

培养基

A.1孟加拉红琼脂培养基

A.1.1成分

蛋白胨

5.0g

葡萄糖

10.0g

磷酸二氢钾

1.0g

硫酸镁（无水）

0.5g

孟加拉红

0.033g

琼脂

20.0g

氯霉素

0.1g

蒸馏水

1000mL

A.1.2制法

上述各成分加入水中，加热溶解，用水补足至1000mL，分装后，121℃灭菌15min，避光保存

备用。

A.2YPD琼脂培养基

A.2.1成分

酵母膏

10.0g

蛋白胨

20.0g

葡萄糖

20.0g

琼脂

20.0g

蒸馏水

1000mL

A.2.2制法

上述各成分加入水中，搅拌至完全溶解，用水补足至1000mL，分装后，121℃灭菌15min，

备用。

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GB/T45033—2024

附录B

（规范性）

生理生化试验

B.1糖类发酵

B1.1糖发酵管

B.1.1.1成分

酵母提取物

5.0g

蒸馏水

1000mL

B.1.1.2制法

糖发酵管按上述成分配好后，分装每瓶100mL，115℃高压灭菌30min。另将葡萄糖、蔗糖、乳

糖、半乳糖、麦芽糖和海藻糖分别配成20%(m/m)溶液，过滤除菌。将0.4mL上述各种糖溶液和

3.6mL培养基分别以无菌操作分装于有一个倒置小管的小试管内。

B.1.2试验方法

将7.5.1培养的纯培养物接种于YPD琼脂培养基中，28℃±1℃培养24h，用灭菌水制成细胞悬浮

液，调整A640≈1.0，以每试管0.1mL的量接种于B.1.1.2制备的糖发酵管内，摇匀，28℃±1℃培养

2周，期间观察发酵管内是否有气体积存及其积存量。

B.1.3结果判定

产朊假丝酵母糖类发酵观察结果及释义应符合表B.1的要求。

表B.1产朊假丝酵母糖类发酵观察结果及释义

观察结果释义

+强发酵，7d内气体迅速充满倒置管

L延迟发酵，7d后倒置管才迅速充满气体

W弱发酵，倒置管内有气体，但直到最后也未充满

－不发酵，倒置管内无气体积存

V同一种内有的菌株发酵，有的不发酵或弱发酵

B.2碳源同化

B.2.1酵母氮源基础（YNB）培养基

B.2.1.1成分

硫酸铵

5.0g

L﹘组氨酸盐酸盐

0.01g

LD﹘蛋氨酸

0.02g

LD﹘色氨酸

0.02g

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GB/T45033—2024

生物素

0.000002g

泛酸钙

0.0004g

叶酸

0.000002g

肌醇

0.002g

烟酸

0.0004g

对氨基苯甲酸

0.0002g

盐酸吡哆醇

0.0004g

核黄素

0.0002g

盐酸硫胺素

0.0004g

硼酸

0.0005g

硫酸铜

0.00004g

碘化钾

0.0001g

氯化铁

0.0002g

硫酸锰

0.0004g

钼酸钠

0.0002g

硫酸锌

0.0004g

磷酸二氢钾

1.0g

硫酸镁

0.5g

氯化钠

0.1g

氯化钙

0.1g

B.2.1.2制法

将上述各成分研磨混合均匀，备用。

B.2.2碳源同化管

B.2.2.1成分

酵母氮源基础（YNB）培养基

6.7g

D﹘葡萄糖（碳源）

5.0g

蒸馏水

100mL

B.2.2.2制法

D﹘葡萄糖同化母液按上述各成分配好后，过滤除菌备用。分别取3.6mL灭菌水和0.4mLD﹘葡萄糖

同化母液以无菌操作分装于小试管内。

其他各种碳源需与5.0gD﹘葡萄糖含有等摩尔浓度的碳。

B.2.3试验方法

将7.5.1培养的纯培养物接种于YPD琼脂培养基中，28℃±1℃培养24h，用灭菌水制成细胞悬浮

液，调整A640≈1.0，以每试管50µL的量接种于B.2.2制备的碳源同化管内，摇匀，28℃±1℃培养

1周、2周和4周。取一片白色卡片，其上用墨汁或黑色墨水划上约0.75mm宽的直线，将同化管贴在该

卡片上，透过培养液观察卡片上的黑线。

B.2.4结果判定

产朊假丝酵母碳源同化观察结果及释义应符合表B.2的要求，产朊假丝酵母碳源同化结果及释义应

符合表B.3的要求。

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表B.2产朊假丝酵母碳源同化观察结果及释义

观察结果释义

+++透过试管完全看不见黑线

++可见黑线但呈一发散的模糊现条

+黑线可见但边缘模糊

-黑线清晰可见且边缘不模糊

表B.3产朊假丝酵母碳源同化结果及释义

同化结果释义

+强同化，2周内为++或+++

L延滞同化，2周后迅速变为++或+++

S缓慢同化，2周后缓慢变为++或+++

W弱同化，记录为+

-不同化

（+）少数情况可同化

V有些菌株同化反应为+，有些菌株同化反应为-

+/W可同化或弱同化，所有菌株都可生长，有些生长较弱

W/-弱同化或不同化

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GB/T45033—2024

附录C

（规范性）