饲料中免疫球蛋白IgG的测定 高效液相色谱法编制说明

国家标准

《饲料中免疫球蛋白IgG的测定

一高效液相色谱法》

编制说明

一、工作简况

（一）任务来源

根据中华人民共和国国家标准公告2023年第17号文下达《饲料中免

疫球蛋白IgG的测定——高效液相色谱法》标准修订任务，项目承担单位

为国粮武汉科学研究设计院有限公司和山东新希望六和集团有限公司。本

标准由全国饲料工业标准化技术委员会提出并归口。

（二）标准制订背景

免疫球蛋白（immunoglobulin,IgG）是一种7S、分子质量160000u

的蛋白质，是一类具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白，它普遍

存在于哺乳动物的血液、组织液及外分泌液中，在动物体的营养代谢和生

理调节方面具有重要的作用，是动物体内免疫系统关键的组成物质之一。

免疫球蛋白是由动物体内的B细胞分泌产生具有抗原特异性的免疫功

能。它能结合病原微生物的表面抗原，形成抗原-抗体复合物并介导相关免

疫反应，从而发挥保护作用。当动物再次遇到相同的病原微生物侵袭时，

免疫球蛋白能够快速产生，加速病原微生物的清除，从而提供更有效的免

疫保护。同时免疫球蛋白在消化道中能够选择性吸收而非特异地吸收抗

原。这使得免疫球蛋白能够有效地抵抗病原微生物的入侵和侵袭，保护动

物免受感染。

免疫球蛋白的应用范围特别广泛，可以提高畜产品的质量，增加其蛋

白质含量和营养价值；可用于预防和治疗多种动物疾病，增强动物对疾病

的免疫力，提高动物的抵抗能力；还可以减少动物对抗生素的依赖，有助

于减少抗生素在畜牧业生产中的使用，降低抗生素残留对人体健康和环境

的影响，促进畜牧业的可持续发展；同时可以利用免疫球蛋白的特异性识

别功能，开发出更安全、更有效的疫苗。

免疫球蛋白作为一种新型的免疫强化剂：已作为功效成分添加于动物

饲料中，最主要的生物学特征就是与相应的抗原特异性结合，还有激活补

体，促吞噬作用等功能和特征。免疫球蛋白在动物体内具有重要的免疫和

生理调节作用，是动物体内免疫系统最为关键的组成物质之一。对于增强

免疫力、调节动物体的生理功能和某些特定物质的代谢均有一定的效果。

免疫球蛋白（IgG）目前主要由喷雾干燥血浆蛋白粉提供，在饲料中添

加量为3〜1（）%。对改善养殖动物和降低抗生素使用具有明显效果。喷雾干

燥血浆蛋白粉免疫球蛋白（IgG）变化较大，从10〜23%不等；鸡蛋粉免

疫球蛋白（IgG）含量一搬为3%左右。

（三）主耍工作过程

1.标准申请和立项

本单位于2022年5月向全国饲料工业标准化技术委员会提出标准修订

申请，于2023年12月获得立项。

2.成立标准编制小组

2024年1月，国粮武汉科学研究设计院有限公司和山东新希望六和集

团有限公司接到国家标准修订任务后，为确保项目的顺利实施，成立标准

起草小组，同时对标准起草工作进行分工，明确各自任务和职责，制定工

作计划，落实人员与任务分工见表lo

表1标准主要起草人员和任务分工

人员职称任务分工

2

王博媛工程师项目主持人，负责项目的全面工作

杨青

高级畜牧师检测方法研究、样品检测、方法验证

（新希望六和）

刘小敏高级工程师项目技术负责，方法验证工作

陈析羽助理工程师检测方法研究、样品检测、标准文本和编制说明编写

邵瑞工程师检测方法研究、样品检测、方法验证

3.查询国内外相关标准和文献资料

2024年1月〜2月，本标准编制组成员查询和收集了国内外相关标准

和文献资料，确立了标准修订的指导思想，形成了报告和标准草案，并修

订了初步的实验方案。

4.标准修订技术路线和和修订原则

2024年2月，国粮武汉科学研究设计院有限公司召开了标准开题论证

会，会上标准编制组介绍了对国内外相关分析方法的研究，标准修订的技

术路线和技术难点，以及拟开展的主要工作等内容。与会专家认为标准安

排合理并对具体技术路线提出建议，标准编制组经过充分交流，完善了标

准具体工作方案。

5.样品收集、方法学研究和实际样品检测

3

2024年1月~2024年2月，在查询、收集国内外相关标准、文献和技

术资料的基础上，在参照国际和国外先进标准的基础上，结合目前的实际

情况，初步确定了标准的修订和相应的试验方法，形成了标准草案。之

后，

2024年2月〜2024年6月，工作组对标准草案进行了多次讨论研究，同时

对标准中采用的试验方法进行了研究与方法验证工作，积累了研究数据。

6.编写编制说明和征求意见稿

2024年5月~2024年6月，对方法研究过程中出现的问题和困难，标

准工作组进行了认真研究分析，并得以解决:完善了方法的准确性和可靠

性，在此基础上完成了标准文本、编制说明形成征求意见稿。

7.定向征求意见、公开征求意见和验证

2024年12月，发送“征求意见稿”的单位（专家）数份，收到“征求意

见稿”后，回函的单位（专家）数份，收到“征求意见稿后”回函并有建议或

意见的单位（专家）数份，没有回函的单位（专家）。提对专家意见进

行汇总，提出建议条，采纳条，不采纳条,部分采纳条。根据专家意见

对征求意见稿进行进一步修订。标准编制小组开展定向征求意见、3家检

测机构标准验证工作。

4

二、标准编制原则和主要技术内容确定的依据

(一)标准编制原则

按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构

和起草规则》、GB/T20001.4-2015《标准编制规则第4部分：试验方法标

准》的规定和要求编写标准全文。查阅了国内外相关标准，结合现行标准

实施情况，以保证标准的先进性和衔接性。编制依据如下：

(1)遵循国家颁布的相关法律法规；

(2)有关国家或行业标准；

(3)国内外有关标准和参考文献；(4)标准编制小组调研和实测

的样品检测数据。

标准制定结合国内外检测技术发展趋势和我国饲料行业发展现状，力求

做到技术上先进、经济上合理，确保标准方法的准确性、可靠性和通用

性。

(二)修订内容的说明

本次修订除按照GB/T1.1-2020和GB/T20001.4-2015对标准进行编

辑性修改外，主要针对GB/T21033-2007存在的问题，结合饲料行业实际

样品检测情况进行。主要修订包括，适用范围增加宠物饲料；明确流动相

5

A配制（见5.2,见2007版的4.3）；明确流动相B配制（见5.3,见2007

版的4.4）;详见表2。

6

表2标准主要技术内容修订说明

No.章条编号原标准修订后修订原因

',本文件按照

GBfT1.1-2020......按照GB"1.1-2020

1前言"本标准……”

的要求重新整理。

-------GB/T21O33-2OO7-

本文件适用于配合饲料、浓缩饲料、本文件适用于配合饲料、浓缩饲料、宠物饲由于宠物饲料的市场

含

料、含IgG饲料原料（包括血浆蛋白粉等）中需求量增加，因此将

21范围

IgG伺料原料（包括血浆蛋白粉等）中免疫适用范围中增加宠物

免疫球蛋白IgG含量的测定。球蛋白IgG含量的测定。胃料这一项。

5.2流动相A:称取磷酸二氢钾3.4g和磷酸氢

4.3流动相A:pH6.5,0.05mol/L磷酸二伸4.6g,月水溶解并定容至1000inL,混将流动相A配置的称

35试剂和材料

盐缓冲溶液。匀。样量等步骤详细化。

调节溶液pH6.5.

45试剂和材4.3流动相B：pH2.5,0.05mol/L日5.3流动相B:称取日氨酸3.8g,加入300mL将流动相B配置的称

料氨酸盐酸缓冲溶液。样量等步骤详细化.

水,搅拌并滴加3.0mL盐酸，溶解后定容至

1000mL,混匀。调节溶液pH2.5.

6试样制备按照GB/T20195的要

求重新整理样品制备

按GB/T14699饲料采样方法采样，选7样品

方法

取饲*懈品至少500g,四分法缩减至按GB/T20195制备样品，至少200g,粉碎使

7样品

5少100g,磨碎，通过0.28um孔筛，其全部通过1.0mm孔径的分析筛，充分混

匀，

混匀，装入畜闭容器中，避光低温保

存装入磨口瓶中，保存，备用。

备用。

2

7.1称取一定量试样（精确至

8.1称取一定量试样（精确至0.0001g）,配合

0.0001g）,配合饲料、浓缩饲料时，称处理样品过程中，添

饲料、浓缩饲料和宠物饲料时，称取试样2~

68.1试样处理取试样2~5g；血浆蛋白粉称取试样加正己烷，去除样品

10g；血浆蛋白粉称取试样0.1g；鸡蛋粉称取

0.1g；鸡蛋粉称取试样0.5g.于茄形瓶试样0.5go于茄形瓶中，加入正己烷1mL,中的油脂。

准确加入25.0mL流动相A（5.2\

中，准确加入250mL流动相A（4.3）.

78.23定性无以保留时间定性，试样溶液中IgG保留时间应增加定性分析

与标准系列溶液（浓度相当）中IgG的保留时

间一致，其相对偏差在±2.5%之内.

8.2.4定量以IgG的浓度为横坐标，色谱峰面积（响应

值）为纵坐标，绘制标准曲线，其相关系数应

不低于0.99.试样溶液中IgG的浓度应在标准

曲线的线性范围内.如超出范围，应将试样溶

8无增加定量分析

液用流动相A（5.2）稀释后，重新测定（或重

新试验1单点校准定量时.试样溶液中IgG的

浓

度与标准溶液浓度相差不超过30%.

8结果计算

9试验数据处理

8.1试样中【gG含量按公式（1）计算：

试样中IgG的含量以质量分数w计，数值以毫

数据处理更为详细

9试验数据处0>=-------------------------------iV克每千克（mg/kg）表示。多点校准按公式

9化，分为单点校准和

理

（1）计算；单点校准按公式（2）计算：多点校准两种方法。

cVst100（1）

sintV,V,1000

幅-------V（1）

式（1）中：m1000

3——试样中IgG含量，g/IOOg；式（1）中：

c―标准工作液（A.2.3）中IgG的P—从标准曲线查得的试样溶液lg（i的质量

浓度，mg/mL；浓度，单位为微克每亳升（mg/mL）；

P厂标准工作液峰面积值；V~提取溶液的体积，单位为亳升（mL）；

的一标准工作液进样体积，uL；m—试样质量，单位为克（g1

Psi一试样峰解只值；

w___________A,V（2）

W-试样进样体积,Hl.；4,m1000式（2）

V-试样体积，mL；中：

—称取试样的质量，g.A—试样溶液中IgG色谱峰面积；

尔一标准溶液中IgG的峰面积；ps一■标

准溶液中IgG的质量浓度,单位为微克每毫升

（mg/mL）；

V-试样提取溶液的体积，单位为亳升

（mL）；

5

，〃—试样质量，单位为克（g1

增加IgG标准溶液

10附录A无IgG标准溶液液相色谱图液相色谱图作为参

考。

6

（三）标准主要技术内容确定的依据

1.标准适用范围的说明

本文件适用于配合饲料、浓缩饲料、宠物饲料、含IgG饲料原料（包括血

浆蛋白粉等）中免疫球蛋白IgG含量的测定。

2.方法原理

根据高效亲和色谱的原理，在磷酸盐缓冲液条件下免疫球蛋白IgG与配基

连接，在pH2.5的盐酸甘氨酸条件下洗脱免疫球蛋白IgGo

3.试剂和材料

（1）试剂

磷酸二氢钾：上海国药；磷酸氢二钾：上海国药；甘氨酸：上海国药；盐

酸：上海国药。

（2）仪器和设备

电子天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；高效液相色谱仪：日

本日立，D-7000;粉碎机：郑州科丰仪器设备有限公司，FW100;离心机：湘

仪，TG16-WS；pH计：赛默飞世尔科技（中国）有限公司，MODEL868；匀

浆机：北京瑞百利商贸有限公司，SC-350Co

4.方法主要参数及试验条件的确定

(1)样品前处理方法的确定

①制备与保存

按GB/T20195制备试样。取样品至少200g,粉碎使其全部通过0.425

mm孔径的分析筛充分混匀，装入密闭容器中，备用。

②样品的前处理

配合饲料、浓缩饲料和宠物饲料，称取试样2〜5g(精确至0.0001g\

血浆蛋白粉称取试样().1g(精确至O.OOOlg\浓缩乳清蛋白粉称取试样().5

g(精确至0.0001g)于茄形瓶中，加入正己烷1mL,准确加入25.0mL流

动相A(pH6.5、().05mol/L磷酸盐缓冲液)，用匀浆机匀浆5min,取溶液

10mL于离心管中，以3500r/min离心10min,过0.45um微孔滤膜备用。

本次修改文本，在前处理过程中，增加加入正己烷1mL的步骤，加入正

己烷的目的在于除去饲料样品中的油脂。本文选取猪浓缩饲料和猫粮料分别加

入1mL正己烷和不加正己烷，进行对比实验测量免疫球蛋白IgG的含量，实

验发现加入正己烷的待测液较不加入正己烷的待测液更为澄清，说明正己烷有

效的去除了饲料中的油脂，其免疫球蛋白IgG的结果如表3所示，猫粮中加入

正己烷和不加入正己烷的免疫球蛋白IgG测定的色谱图如图

2

1-2O

表3样品前处理添加正己烷和不添加正己烷的IgG值

IgG值(%或mg/kg)

样品名称前处理相对偏差

12平均

加正己烷不3.563.543.550.28

猪浓缩饲料(％)3.613.533.571.12

加正己烷

加正己烷不68.6768.4868.580.14

猫粮(mg/kg)67.9868.6968.340.52

加正己烷

图2猫粮中免疫球蛋白IgG的测定图谱(不加正己烷)

由上可知，在免疫球蛋白IgG测定前处理过程中，在饲料样品中加入正己

烷，能使待测液更为澄清，有效的去除饲料中的油脂，且对免疫球蛋白

3

IgG结果没有影响，因此，在前处理过程中处理油脂较为丰富的饲料样品时，

可加入正己烷去除油脂。

（2）分离条件的研究

本方法采用pH6.5、（）.05mol/L磷酸盐缓冲液为流动相A,pH2.5、

0.05mol/L甘氨酸盐酸缓冲液为流动相B,色谱柱采用PharmaciaHI-Trap

ProteinG柱，1mL。将梯度洗脱流动相流速由0.4mL/min提高到0.5

mL/mino经过多次实际饲料样品的测定表明，梯度洗脱流动相流速由0.4

mL/min提高到0.5mUmin时，不仅能取得较好的分离效果（见图3）,而且

IgG的保留时间控制在15分钟左右，较为理想。

BecentionTi»e(Bln)

图30.5mL/min流速下IgG测定色谱图

（3）紫外检测波长的确定

为得到最高的检测灵敏度，我们使用二极管阵列检测器对IgG色谱峰处进

行紫外波段扫描采集三维光谱图（图4）,从图4中可看出，IgG在

4

28()nm处有较大吸收，因此将紫外检测波长确定为28()nm。

图4IgG色谱峰紫外波段扫描图

(4)色谱条件的确定

具体的色谱条件如下：

a)色谱柱：PharmaciaHI-TrapProteinGft,1mL；

b)流动相:A相为pH6.5,0.05mol/L磷酸盐缓冲液,B相为pH2.5,

0.05mol/L甘氨酸盐酸缓冲液，梯度洗脱条件见表4;

c)梯度洗脱条件：梯度洗脱程序见表4,先用5倍柱体积的重蒸储水或

去离子水洗柱，再用10倍柱体积流动相A平衡柱，按洗脱程序进行洗

脱；e)进样量：20；

d)流速：0.5mL/min;

f)紫外检测波长：280nm。

表4梯度洗脱程序

时间(min)流速(mL/min)流动相A(%)流动相B(%)

5

00.51000

4.50.51000

5.50.50100

15.00.50100

18.50.51000

26.00.51000

在上述确定的液相色谱条件下，分别取标准系列工作溶液和试样溶液

上机测定。以保留时间定性，以IgG标准溶液的浓度为横坐标，色谱峰面

积(响应值)为纵坐标，绘制标准曲线。IgG标准溶液的液相色谱图参见

图5o

图5IgG标准溶液色谱图(c=1.0mg/mL)

(5)方法学验证

①方法的线性范围

配制标准工作曲线溶液，浓度为10.0(ig/mL、50.0|ig/mL、100pg/mL、

200pg/mL、500pg/mL和1000(ig/mL,色谱峰面积为纵坐标，标准溶液的浓

度为横坐标绘制标准曲线(如图6),求回归方程和相关系数(如表6),相关

6

系数R-0.999,由此可知该化合物在10.0pg/mL〜1000gg/mL的浓度范围内

呈良好的线性关系。

表5IgG系列标准溶液浓度和峰面积

标准溶液浓度（Rg/mL）峰面积

10.07462

50.028876

10059620

200112486

500262262

1000556075

表6IgG线性范围、线性方程及相关系数（R2）

化合物线性范围（pg/mL）线性方程R2

烟酰胺10.0-1000y=549.42x+808.860.999

18G标准溶液浓度pig/mL

图6IgG标准溶液曲线

7

②方法检出限与定量限

选取空白虾饲料添加标准溶液5.0mg/kg,按建立的方法处理样品，最终

确定检出限为5.0mg/kg,定量限为5.0mg/kg。虾料样品空白、定量限浓度添

加样品(5.0mg/kg)的色谱图见图7-8,IgG标准溶液最低检出浓度(10.0

Hg/mL)如图9所示。

图7虾饲料样品空白色谱图

0.W0

0.015

24661012141610202224262830

ionTis*(mnl

图8虾饲料样品添加定量限浓度(5.0mg/kg)色谱图

8

图9IgG标准溶液最低检出浓度(10.0gg/mL)色谱图

③方法回收率选取空白虾饲料、乳猪配合饲料、观赏鱼饲料、猫粮、猫用风味

剂和犬用风味剂，制成添加水平为5.0mg/kg、10.()mg/kg、25.0mg/kg的样

品，空白饲料样品每个浓度水平平行测定6个，计算方法回收率。方法回收率

数据见表7。结果表明，在添加量为1〜5倍定量限水平添加时，免疫球蛋白

IgG的回收率为90.29%~99.08%,相对标准偏差RSD均小于7.98%。部分

样品添加回收图谱见图10-13o

表7空白样品添加回收率

平均回

添加水平添加回收率(%)RSD

收率

样品名称

(mg/kg)I23456(%)(%)

乳猪配合饲5.085.2598.6289.2487.6992.2188.7290.295.17

95.14

料10.096.2594.1287.1690.1888.2591.854.16

25.093.1398.12106.3288.5397.10103.5097.796.68

5.096.1486.1589.1493.4794.6896.7892.734.54

观赏鱼饲料10.096.2485.6792.1497.5889.14101.5493.726.23

25.085.3889.3293.45106.3293.5298.1194.347.72

5.086.4293.4290.2194.5689.9498.3192.144.52

虾料10.090.2387.8692.3498.56102.3397.3494.785.82

25.089.23103.2393.4594.2190.23105.3295.957.04

5.093.2591.4489.3588.1495.2192.7991.702.85

7.11

猫粮料10.092.2289.6290.8187.55105.9496.3893.75

25.0105.5191.6093.1397.6788.0993.6194.926.35

9

5.093.2489.3384.5690.4392.4490.4490.073.40

猫用风味剂10.0103.4589.9993.41104.5286.4090.2194.677.98

25.094.3998.45103.4490.3398.3392.1196.185.02

5.096.2494.9186.5292.9886.17106.5293.897.98

狗粮料10.0103.2287.4890.5596.5398.2289.4494.246.44

25.097.1093.42102.9894.8390.89102.5196.965.07

5.087.5398.5182.3686.5495.8193.4690.706.83

狗用风味剂10.0102.3394.3297.4388.4392.34104.2296.516.25

25.098.2494.11102.3396.55105.8197.4799.084.29

图10乳猪配合饲料添加回收图谱

图11观赏鱼饲料添加回收图谱

10

图12虾饲料添加回收图谱

④方法精密度

将12种饲料平行测定6次，完成重复性试验和不同方法测定结果的比

较，结果见表8o由表8可知，12种饲料的相对标准差（RSD）为1.53%~

4.50%,处于较低的水平，表明方法的重复性较好。考虑到实际检测中两次测

定的极端情况，取每组的绝对差值最大的两次试验计算绝对差值/算术平均

值，所得值为3.82%~11.66%。部分样品免疫球蛋白IgG测定图谱见图

14-20o

表8样品精密度实验

____________________________IgG值（.或mg/kg）_____________________________RSD（绝对偏

123456平均值%)差(%)

干燥ft!浆粉（%）29.3228.9829.5630.3628.3529.8729.412.386.83

干燥血浆压片（％）25.8425.1226.4526.3525.4225.1925.732.255.17

浓缩乳清蛋白（％）4.564.965.()14.674.985.134.894.5011.66

加州妒配合饲料（mg/kg）35.3535.6736.6834.3436.4834.6535.532.665.71

观赏鱼饲料（mg/kg）64.3762.9763.7565.6563.2462.9463.821.644.25

虾料(mg/kg)43.1142.5444.6143.2442.4544.3743.392.104.98

II

猫粮料（mg/kg）48.6746.6549.5647.8648.5649.5548.482.286.00

猫用风味剂（mg/kg）102.33101.1399.54100.34101.55100.64100.930.972.76

狗粮料（mg/kg）57.2355.0256.3557.6358.3256.4456.832.035.81

狗用风味剂（mg/kg）83.6784.5682.6583.7885.5784.9684.201.243.47

乳猪配合饲料（%）0.8210.8190.8020.8240.8140.8060.8141.072.70

猪浓缩饲料（％）3.563.543.673.463.653.853.623.7410.77

样品名称

图15干燥血浆压片中免疫球蛋白IgG的测定图谱

图16浓缩乳清蛋白中免疫球蛋白IgG的测定图谱

24681012141618202224262(30

RetOonTix(wnn

图17加州妒配合饲料中免疫球蛋白IgG的测定图谱

RetentionTiane(min)

图18观赏鱼中免疫球蛋白IgG的测定图谱