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HBVDNA定量检测

上海交通大学医学院刘湘帆讲师PCR基因的原理

一、PCR技术的发展及原理1971年，Kleppe等人首次在文章中准确、客观地阐述了PCR方法。1985年，美国PE-Cetus公司的KaryMullis等人发明PCR技术。PCR原理PCR技术的本质是体外核酸扩增，加热使双链DNA解开螺旋，在退火温度条件下引物同模板DNA杂交，在TaqDNA聚合酶，dNTPs，Mg2+和合适pH缓冲液存在条件下延伸引物，重复“变性→退火→引物延伸”过程至25-40个循环，呈指数级扩大待测样本中的核酸拷贝数。PCR的基本原理PCR基因扩增仪的工作原理PCR基因扩增仪的工作原理PCR基因扩增仪工作关键是温度控制

技术在PCR反应体系中加入特异性的荧光染料或探针，荧光信号的变化真实地反映了体系中模板的增加，通过检测荧光信号，从而实时监测整个PCR反应过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。荧光实时定量PCR（real-timequantitativePCR,RQ-PCR）荧光定量PCR（fluorescencequantitativePCR,FQ-PCR），又称实时PCR，是目前较精确的进行定量检测PCR的方法FQ-PCR通过荧光信号对PCR过程中产物量进行实时监测，精确计算出PCR的初始模板量荧光定量PCR是融合了PCR高灵敏性、DNA杂交高特异性和光谱分析的精确性，直接检测扩增过程中双链DNA荧光信号的变化以获得定量的结果。系统内装置有半导体PCR、卤钨灯光源激发荧光信号、光栅分光、超低温光电耦合器（CCD）摄象机收集荧光信号、计算机软件分析系统等。荧光定量PCR检测的是样本的初始浓度，而准确测定初始浓度需要在对数期进行。荧光定量PCR在每一次循环后对进行实时监控，因此能最准确反映出对数期。确定准确的初始浓度。软件系统可以进行参数设定、保存数据和报告结果，并将结果自动保存在计算机中。相同模板进行96次扩增的扩增曲线图。

①荧光定量技术要求在低浓度坏境。因为荧光检测定量原理是在忽略分子间相互作用的情况下建立的。如果分子浓度高了，影响作用很复杂，而PCR扩增产物是高浓度的，因此重复性变差也很容易理解。②由于扩增末期，扩增效率可能因为大量的靶序列而产生不可控的影响。

Ct值，C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。Ct值分析实际上就是低浓度的荧光值分析。由于是低浓度，影响因素小，所以具有良好的重现性。研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。荧光信号的检测方法：1、DNA结合染料技术2、水解探针技术（TaqManprobe）技术3、杂交探针技术4、分子信标ThebiggestdisadvantageofSYBRisthatitbindstoanydsDNA;thespecificproduct,non-specificproductsandprimerdimersaredetectedequallywell.

TheLightCyclerInstrumentallowsmeltingcurveanalysisOncethemeltingpointoftheproducthasbeendeterminedtheLightCyclerInstrument'sflexibleprogrammingallowstheusertoacquirefluorescenceabovethemeltingtemperatureoftheprimerdimers,butbelowthemeltingtemperatureoftheproduct.

缺点：存在非特异性产物，可以与非特异性产物，甚至引物二聚体结合发出荧光。可以使用熔点曲线分析进行鉴别，明显提高诊断的特异性。（F1通道）2、TaqMan水解探针技术杂交探针技术对PCR产物定量又称荧光共振能量转移，FRET需要一对引物和一对探针，探针A的3`端为荧光染料供体；探针B的5`端作为荧光染料受体。2个探针首尾相连，仅差一个碱基。检测在退火时进行。AdvantagesoftheLightCyclerSystemWatchamplificationasitoccurs:real-time,on-linefluorescenceallowsyoutoseetheresultsofeverycycleassoonasPCRproceedsSavetime:extremelyrapidPCR,20minutesfor30cyclesVerifyampliconspecificity:meltingcurveanalysisprovidesdifferentiationbetweenamplificationproductsDetectmutations:changesinthemeltingcurveanalysiscanbeusedtoidentifymutationsMinimizecontamination:amplificationanddetectionareperformedinthesameclosedtube荧光定量PCR技术的优点1）定量准确，实时监控2）敏感性和特异性高3）简单快速，30个循环20几分钟就能够完成。4）污染可能性小5）不需要常规的产物后期复杂处理，直接观测结果6）可以进行点突变分析，根据熔点曲线的不同直接分析点突变的情况。Figure3.Mutationdetectionbymeltingcurveanalysis.Toppanel:meltingcurvesofamplifiedgenefragmentsfromwild-typeandmutantindividuals.Bottompanel:negativefirstderivativesofthemeltingcurvesshowingtheuniquemeltingpeakofeachgenotype.Thegenefragmentamplifiedfromtheheterozygousindividualexhibitsameltingcurvewithboththewild-typeandmutantpeaks(redplot).

HBV的定量检测标本：病人血清200μl检测：HBV