体外药物代谢酶和转运体介导的药物相互作用研究技术指导原则(试行)

体外药物代谢酶和转运体介导的药物相互作用研究技术指导原则(试行)一、前言药物相互作用（Drug-DrugInteraction,DDI）是指两种或两种以上药物同时或先后使用时，药物的吸收、分布、代谢、排泄过程发生改变，导致药物疗效异常或不良反应风险升高的现象。其中代谢酶和转运体介导的DDI占临床DDI事件的70%以上，是新药研发阶段必须系统评估的核心内容。本指导原则基于国际药品监管机构通用技术要求及国内新药研发实际，明确体外DDI研究的适用范围、试验设计、数据评价及转化应用标准，为创新药、改良型新药及仿制药的DDI评估提供可落地的技术指引，降低临床阶段DDI风险，保障用药安全。本指导原则适用于化学小分子新药、中药有效成分制剂、具有药代动力学改变特征的改良型新药的体外DDI研究，生物制品若存在小分子代谢产物或与小分子药物联合使用风险，可参照执行。二、体外研究总体原则2.1研究时机体外DDI研究应贯穿新药研发全流程：候选化合物筛选阶段：完成核心代谢酶表型、主要代谢酶抑制/诱导潜力初筛，排除DDI风险过高的候选分子；临床前研究阶段：完成全面的代谢酶、转运体介导的DDI体外评估，明确作用靶点、作用类型、效应强度，为临床试验设计提供依据；临床研究阶段：针对体外发现的高风险DDI，结合体内药代数据开展验证，更新说明书风险提示。2.2受试物要求受试物纯度应≥95%，明确杂质组成及含量，避免杂质干扰试验结果；若研究活性代谢产物，应单独制备符合纯度要求的代谢产物样品；阳性对照药应选择已知的靶点特异性抑制剂/诱导剂，每批次试验同步开展阳性对照验证，阳性对照的效应值应处于历史参考范围±20%以内，否则试验数据无效；溶媒选择应避免影响酶或转运体活性：有机溶剂（DMSO、甲醇等）终浓度应≤0.5%（v/v），若需更高浓度需验证该浓度下酶/转运体活性保留率≥90%，并在试验报告中明确说明。2.3试验体系要求所有体外试验体系需经过验证：明确酶活性、转运体表达水平、孵育条件的线性范围，保证试验结果的批间变异系数≤15%，批内变异系数≤10%。三、细胞色素P450酶介导的DDI体外研究细胞色素P450（CYP）酶是介导药物I相代谢的核心酶系，其中CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4/5占临床药物代谢的90%以上，是体外研究的核心靶点。3.1CYP酶抑制研究3.1.1可逆抑制试验试验体系：优先选择人肝微粒体（HumanLiverMicrosome,HLM），蛋白浓度优选0.1-0.5mg/mL，孵育时间处于代谢线性范围内（底物转化率≤10%），pH控制在7.4±0.1，孵育温度37±0.5℃。探针底物选择：应采用特异性探针，具体要求如下：CYP亚型推荐探针底物底物浓度范围代谢产物检测下限CYP1A2非那西丁10-50μM（Km≈40μM）1nMCYP2B6安非他酮50-200μM（Km≈80μM）2nMCYP2C8紫杉醇5-20μM（Km≈10μM）0.5nMCYP2C9双氯芬酸1-10μM（Km≈5μM）0.2nMCYP2C19奥美拉唑5-20μM（Km≈10μM）1nMCYP2D6右美沙芬1-5μM（Km≈2μM）0.2nMCYP3A4/5咪达唑仑/睾酮1-10μM（Km≈3-5μM）0.1nM数据处理：采用非线性回归法计算半数抑制浓度（IC50），若IC50<1μM判定为强抑制，1μM≤IC50<10μM判定为中等抑制，IC50≥10μM判定为弱抑制或无抑制。同时采用R1=[I]/IC50（[I]为临床最大暴露下的血药游离浓度）进行风险预判：R1≥1提示存在临床DDI风险，需开展时间依赖性抑制研究；R1<0.1可暂不开展后续CYP抑制相关研究。3.1.2时间依赖性抑制（TDI）试验试验设计：采用“两步孵育法”：第一步将受试物（3-6个浓度梯度）与HLM在有无NADPH条件下预孵育0、10、30、60min，第二步加入探针底物、补充NADPH后孵育，测定残余酶活性。参数计算：计算失活速率常数（kobs），并拟合得到半数失活浓度（KI）和最大失活速率（kinact）。风险预判采用R2=kobs/0.000476（肝脏首过消除速率常数），若R2≥1或kinact/KI≥11mL/μmol/min，提示存在临床TDI风险，需进一步开展体内DDI研究。注意事项：若预孵育无NADPH时也出现酶活性下降，需排除受试物对酶的非特异性结合或沉淀效应，可添加0.1%-1%的牛血清白蛋白（BSA）验证。3.2CYP酶诱导研究试验体系：优先选择原代人肝细胞（至少来源于3个不同供体，排除CYP亚型基因多态性纯合突变供体），培养72h细胞汇合度≥80%后给药。若无法获得原代肝细胞，可采用经过验证的HepaRG细胞系，不得使用永生化肝癌细胞系（如HepG2）。诱导剂浓度设置：受试物设置至少3个浓度梯度，最高浓度为临床Cmax的10倍或细胞毒性浓度的1/2（CC50的1/2，采用CCK-8或LDH法测定细胞毒性），连续给药72h，每24h更换含药培养基。阳性对照要求：每个亚型对应特异性诱导剂，CYP1A2用20μM奥美拉唑，CYP2B6用1000μM苯巴比妥，CYP3A4用10μM利福平，阳性对照组的酶活性诱导倍数应≥2倍（与溶剂对照相比），否则试验无效。检测指标：优先采用LC-MS/MS测定探针底物的代谢活性，同时可结合qPCR测定mRNA表达水平（mRNA诱导倍数≥2倍且具有浓度依赖性时，需进一步验证酶活性变化）。风险评价：若受试物组酶活性诱导倍数≥溶剂对照的2倍，且EC50≤10×Cmax，判定为具有临床诱导风险。对于CYP3A4诱导，若同时存在孕烷X受体（PXR）激活试验阳性结果，可进一步确认诱导效应。3.3CYP酶表型研究明确受试物的主要代谢酶亚型，若某一亚型介导的代谢占总清除率的25%以上，需评估该亚型的基因多态性对药代动力学的影响，以及该亚型抑制剂/诱导剂与受试物的DDI风险。试验方法：采用化学抑制法（使用各亚型特异性抑制剂，抑制率≥80%为该亚型介导代谢）、重组酶法（10种以上重组CYP亚型分别孵育，测定代谢转化率）、相关性分析（10个以上不同供体HLM的亚型活性与受试物代谢速率的相关性，r≥0.7为显著相关），三种方法中至少两种结果一致方可确认代谢亚型。四、非CYP代谢酶介导的DDI体外研究非CYP酶包括UDP-葡萄糖醛酸转移酶（UGT）、黄素单加氧酶（FMO）、酯酶、硫酸转移酶（SULT）等，若受试物主要经非CYP酶代谢，或存在对非CYP酶的抑制/诱导风险，需开展对应研究。4.1UGT酶研究重点评估UGT1A1、UGT1A3、UGT1A4、UGT1A6、UGT1A9、UGT2B7、UGT2B15亚型：抑制试验采用人肝微粒体或重组UGT酶，孵育体系需添加2mMUDP-葡糖醛酸，探针底物分别为SN-38（UGT1A1）、丙咪嗪（UGT1A4）、齐多夫定（UGT2B7），IC50计算与CYP酶一致，R1≥0.1提示存在临床风险。诱导试验采用原代人肝细胞，诱导靶点包括UGT1A1、UGT1A9、UGT2B7，阳性对照用利福平，诱导倍数≥2倍判定为具有诱导风险。4.2其他非CYP酶研究FMO：若受试物代谢产物为N-氧化物或S-氧化物，需开展FMO表型研究，采用热失活法（45℃孵育5minFMO活性丧失90%以上，CYP活性保留≥80%）区分FMO与CYP介导的代谢。酯酶：若受试物存在酯键水解代谢，需评估人血浆、肝微粒体、肠道微粒体中的酯酶水解速率，以及酯酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸）对水解的影响。单胺氧化酶（MAO）：针对中枢神经系统药物，需评估对MAO-A、MAO-B的抑制作用，采用重组MAO酶，探针底物为5-羟色胺（MAO-A）、苄胺（MAO-B），IC50<1μM提示存在高血压危象等严重不良反应风险。五、转运体介导的DDI体外研究转运体介导药物的跨膜转运，影响药物的吸收、分布、排泄，是DDI的重要介导因素。本指导原则要求评估的转运体包括摄取型（OATP1B1、OATP1B3、OAT1、OAT3、OCT2、PEPT1/2）和外排型（P-gp、BCRP、MRP2、MRP3、MRP4、BSEP）两大类。5.1转运体底物鉴定若受试物的生物利用度<10%、胆汁排泄率≥30%、肾脏排泄中主动分泌占比≥20%、脑组织暴露量与血药浓度比值<0.1或>2，需开展转运体底物鉴定：试验体系：采用过表达单个转运体的CHO、MDCK或HEK293细胞系，同时设置空载体转染的阴性对照细胞。评价标准：受试物在转运体过表达细胞中的摄取量/转运量是阴性对照的2倍以上，且可被该转运体的特异性抑制剂抑制≥50%，判定为该转运体的底物。特殊要求：针对口服吸收药物，需开展Caco-2细胞双向转运试验，若表观渗透系数Papp（A→B）<1×10⁻⁶cm/s，且外排率ER=Papp（B→A）/Papp（A→B）≥2，需进一步鉴定是否为P-gp、BCRP或PEPT1的底物。5.2转运体抑制试验浓度设置：受试物设置6个浓度梯度，最高浓度为临床肠道内容物浓度（口服药物）或100×Cmax（静脉药物），每个浓度3个复孔。阳性对照要求：每个转运体对应特异性抑制剂，具体如下：转运体特异性抑制剂抑制剂浓度抑制率要求P-gp维拉帕米、依克立达10μM≥80%BCRPKo1431μM≥80%OATP1B1利福平、环孢素A10μM≥70%OAT1/3丙磺舒100μM≥70%OCT2西咪替丁100μM≥70%BSEP酮康唑10μM≥50%肠道转运体（P-gp、BCRP、PEPT1）：R=[Igut]/IC50，[Igut]为口服给药后肠道内最大药物浓度（=给药剂量/250mL），R≥10提示存在临床DDI风险；肝脏摄取转运体（OATP1B1/1B3）：R=[I]max,u/IC50，[I]max,u为门静脉血药游离浓度，R≥0.1提示存在风险；肾脏转运体（OAT1/3、OCT2）：R=[I]max,u/IC50，R≥0.1提示存在风险；胆盐外排泵（BSEP）：若IC50<10μM，提示存在胆汁淤积性肝损伤风险，需开展体内胆汁排泄研究。5.3转运体诱导研究目前转运体诱导的体外研究方法尚不成熟，若体外CYP3A4诱导阳性，需同步评估P-gp、BCRP、OATP1B1的诱导效应，采用原代人肝细胞给药72h后，通过Westernblot测定转运体蛋白表达水平，或采用转运试验测定功能变化，蛋白表达上调≥2倍判定为具有诱导风险。六、代谢酶与转运体的联合作用研究若受试物同时是某代谢酶和转运体的底物，需评估两者的协同DDI效应：1.肝脏清除的协同作用：对于OATP1B1底物且主要经CYP3A4代谢的药物，需评估OATP1B1抑制剂对肝脏摄取的影响，以及CYP3A4抑制剂对肝内代谢的影响，采用生理药代动力学（PBPK）模型模拟两者联合抑制的效应；2.肠道吸收的协同作用：对于口服药物，若同时是P-gp和CYP3A4的底物，需采用Caco-2细胞与肠道微粒体共孵育模型，评估P-gp外排与肠道CYP3A4代谢的协同效应，若两者联合作用导致生物利用度变化≥2倍，需开展临床DDI研究；3.跨器官协同作用：对于经肾脏OAT3摄取、UGT1A9代谢、MRP4排泄的药物，需评估三种蛋白的联合作用风险，避免低估DDI效应。七、体外数据的体内转化与风险评估7.1DDI风险分级根据体外研究结果将DDI风险分为三级：低风险：所有体外试验R值<0.1，无明确的代谢酶/转运体抑制或诱导效应，无需开展临床DDI研究，说明书中明确“无显著药物相互作用风险”；中风险：体外试验0.1≤R值<1，或存在弱抑制/诱导效应，需采用PBPK模型模拟体内DDI效应，若模拟的药时曲线下面积（AUC）变化<1.25倍，可豁免临床研究，否则需开展针对性临床DDI试验；高风险：体外试验R值≥1，或存在时间依赖性抑制、强诱导效应，必须开展临床DDI研究，明确相互作用程度，说明书中添加禁忌、剂量调整等风险提示。7.2PBPK模型应用要求用于DDI预测的PBPK模型需经过验证：输入参数包括受试物的理化性质（logP、pKa、溶解度）、体外药代参数（代谢酶Km、Vmax、转运体Km、IC50）、临床前体内药代参数（生物利用度、清除率、分布容积），模型模拟的单药药代参数与临床实测值的偏差应≤2倍，方可用于DDI预测。7.3特殊人群风险考量体外研究评估为中高风险的DDI，需额外考虑肝功能不全、肾功能不全、老年人、儿童等特殊人群的药代特征：如UGT1A1抑制剂与伊立替康联合使用时，UGT1A1*28/*28基因型人群的中性粒细胞减少风险升高3倍，需在说明书中明确基因型相关的风险提示。八、研究报告撰写要求体外DDI研究报告需包含以下内容，确保数据可追溯、可重复：1.受试物信息：名称、批号、纯度、溶解度、配制方法、储存条件；2.试验材料来源：人肝微粒体供体信息、细胞系来源、探针底物/抑制剂批号、纯度；3.试验方法：孵育体系组成、浓度设置、取样时间、样品处理方法、分析方法学验证数据（专属性、线性、