谷物和谷物制品 超高效液相色谱和串联质谱法（UHPLC-MSMS）测定17种真菌毒素标准立项发展报告

谷物和谷物制品超高效液相色谱和串联质谱法（UHPLC-MS/MS）测定17种真菌毒素标准立项发展报告StandardizationDevelopmentReport:Cerealsandcerealproducts—Determinationof17mycotoxinsbyultra-high-performanceliquidchromatographyandtandemmassspectrometrymethod(UHPLC-MS/MS)摘要随着全球粮食安全问题的日益凸显，谷物及其制品中真菌毒素的污染已成为影响食品安全和国际贸易的关键因素。真菌毒素，如黄曲霉毒素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（呕吐毒素）和玉米赤霉烯酮等，因其高毒性和广泛存在性，对人体健康构成严重威胁，并对粮食贸易造成重大经济损失。为应对这一挑战，建立一套高效、精准、国际通用的检测方法标准显得尤为重要。本标准立项发展报告旨在全面阐述ISO23719:2025《谷物和谷物制品超高效液相色谱和串联质谱法（UHPLC-MS/MS）测定17种真菌毒素》的制定背景、技术原理、核心内容及其重要意义。报告首先梳理了当前国际与国内关于真菌毒素限量法规的现状及其对检测技术的迫切需求，强调了超高效液相色谱串联质谱（UHPLC-MS/MS）技术相较于传统方法在灵敏度、选择性和分析通量上的显著优势。随后，报告详细解析了该标准规定的技术路线，包括样品制备、前处理净化、色谱分离及质谱检测的关键参数和过程控制要求。通过对标准内容的深度剖析，报告指出该标准成功实现了对17种最常见且危害性大的真菌毒素进行同步、快速、准确定量的目标。最后，报告评估了该标准的发布将对全球粮食贸易、食品安全监管机构、检测实验室及谷物加工企业产生的深远影响。结论指出，ISO23719:2025不仅规范了检测方法，更通过技术引领推动了行业技术进步，为构建更安全的全球食品供应链提供了坚实的技术支撑。关键词：真菌毒素；谷物；超高效液相色谱-串联质谱法（UHPLC-MS/MS）；ISO标准；食品安全；检测方法；国际贸易；标准立项Keywords:Mycotoxins;Cereals;Ultra-high-performanceliquidchromatography-tandemmassspectrometry(UHPLC-MS/MS);ISOstandard;Foodsafety;Detectionmethod;Internationaltrade;Standardizationinitiative正文1.标准立项背景与必要性1.1真菌毒素污染问题的严峻性与全球关注真菌毒素（Mycotoxins）是某些真菌（主要是曲霉属、青霉属和镰刀菌属）在适宜的温度和湿度条件下产生的有毒次级代谢产物。谷物及其制品作为全球最主要的主食来源，从田间生长、收获、储存到加工的全链条中，均面临被真菌毒素污染的风险。常见的真菌毒素包括黄曲霉毒素（Aflatoxins,B1,B2,G1,G2）、赭曲霉毒素A（OchratoxinA,OTA）、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol,DON）、玉米赤霉烯酮（Zearalenone,ZEN）、伏马菌素（Fumonisins,B1,B2）、T-2毒素和HT-2毒素等。这些真菌毒素具有高度的毒性，包括致癌性、致畸性、肝毒性、肾毒性、神经毒性和免疫抑制作用。例如，黄曲霉毒素B1已被国际癌症研究机构（IARC）列为1类致癌物。为了保障消费者健康，全球主要国家和国际组织，如欧盟、美国食品药品监督管理局（FDA）、中国国家卫生健康委员会以及食品法典委员会（CodexAlimentariusCommission），均制定了严格的谷物及其制品中真菌毒素的限量标准。这些限量标准的日趋严格，对检测技术的灵敏度、准确性和高通量能力提出了极高的要求。1.2现有检测技术的局限性在ISO23719:2025发布之前，真菌毒素的检测方法主要有以下几种，但均存在各自的局限性：*色谱法（如HPLC-FLD）：高效液相色谱（HPLC）结合荧光（FLD）或紫外（UV）检测器是经典方法，但其通常只能检测一种或一类毒素（如黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2），且需要复杂的柱前或柱后衍生步骤，分析时间长，无法满足多毒素同时检测的需求。*免疫分析法（如ELISA）：酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒虽然操作简便、成本低廉，适用于快速筛查，但其存在结果假阳性率高、交叉反应、定量不准确、稳定性较差等问题，难以作为确证方法使用。*液相色谱-低分辨质谱（LC-LRMS）：与质谱联用虽提高了选择性，但由于真菌毒素种类繁多、结构差异大，在复杂谷物基质中，单一的四极杆质谱（MS或MS/MS）可能在灵敏度或特异性上不足以满足所有17种毒素的痕量检测要求。1.3UHPLC-MS/MS技术的优势与立项需求超高效液相色谱串联质谱（UHPLC-MS/MS）技术，尤其是采用三重四极杆（QQQ）质谱的多反应监测（MRM）模式，因其在灵敏度、选择性和分析通量上的卓越表现，成为解决上述难题的理想方案。它能够在10-15分钟内完成一次分析，同时准确定量十几种甚至几十种目标物。然而，长期以来，由于各实验室在仪器型号、色谱柱选择、流动相配比、前处理方法（如固相萃取柱的选取）等方面缺乏统一规范，导致不同实验室间的结果缺乏可比性，给国际贸易和监管带来了障碍。因此，建立一个国际公认的、基于UHPLC-MS/MS技术、能同时测定17种主要真菌毒素的权威标准，是消除技术壁垒、促进公平贸易、提升全球食品安全保障水平的迫切需要。ISO23719:2025正是在此背景下应运而生。2.标准核心技术与方法学解析ISO23719:2025规定了采用超高效液相色谱与三重四极杆串联质谱联用技术，测定谷物和谷物制品中17种真菌毒素的方法。该标准在制定过程中，充分考虑了方法的适用性、准确性、重现性和可操作性。2.1检测的17种真菌毒素清单该标准明确规定了需要测定的17种真菌毒素，几乎涵盖了粮食中最常见且毒性最强的种类：*黄曲霉毒素：B1,B2,G1,G2*赭曲霉毒素：A*脱氧雪腐镰刀菌烯醇：DON（呕吐毒素）及3-乙酰基DON,15-乙酰基DON*玉米赤霉烯酮：ZEN*伏马菌素：B1,B2*单端孢霉烯族毒素：T-2毒素,HT-2毒素,尼瓦烯醇（NIV）,镰刀菌烯酮-X（FUS-X）*其他：交链孢酚（AOH）2.2样品前处理标准中对样品前处理进行了详细规定，这是保证方法准确性的关键。该标准推荐了基于“提取-稀释-直接进样”或“提取-净化后进样”的策略。典型流程包括：1.粉碎和均质：将谷物样品充分粉碎，以达到均一性。2.提取：采用乙腈/水/乙酸（79:20:1,V/V/V）的混合溶液进行涡旋或振荡提取。这种提取体系能够高效地从谷物基质中萃取出极性和非极性的各类真菌毒素。3.净化：该标准提供了两种净化方案：*直接稀释法：对于基质干扰较小的无麸质谷物或精加工产品，将提取液直接稀释后进样，简化操作。*固相萃取（SPE）净化法：对于基质复杂的麸皮、全麦粉等样品，推荐使用MycoSep®227或类似的多功能净化柱（MFC）进行净化。这类净化柱能有效去除脂类、蛋白和色素等大分子干扰物，而毒素被保留在洗脱液中。对于强极性的DON等毒素，可能需要使用其他类型的净化柱（如DZTMS-Prep®）。4.过滤：进样前需用0.22μm的微孔滤膜过滤。2.3超高效液相色谱（UHPLC）条件标准推荐使用带有二元高压泵的UHPLC系统，色谱柱采用C18反相柱（如ZORBAXEclipsePlusC18,2.1×100mm,1.8μm或类似规格）。流动相为含0.1%甲酸的水溶液（A相）和含0.1%甲酸的甲醇或乙腈溶液（B相）。通过优化梯度洗脱程序，实现17种毒素在短时间（通常12分钟）内的基线分离。2.4串联质谱（MS/MS）检测条件质谱操作在电喷雾电离（ESI）模式下进行，并采用正负离子切换模式（PolaritySwitching），以适应不同毒素质谱电离特性的差异。标准规定了各毒素优化的母离子、子离子及碰撞能。采用多反应监测（MRM）模式，每个化合物至少选择一对定量离子对和一对定性离子对，并满足欧盟关于确证方法的离子比率要求，确保了定性的可靠性。定量分析采用内标法，推荐使用同位素内标（如[13C17]-黄曲霉毒素B1），以校正基质效应和仪器波动。2.5性能指标要求标准对方法的性能指标给出了明确规定：*检测限（LOD）和定量限（LOQ）：必须远低于主要贸易伙伴的法定限量。例如，黄曲霉毒素B1的LOQ应低于1μg/kg。*回收率：添加回收实验应在80-120%范围内。*精密度（重复性和再现性）：通过国际协同实验验证，给出了在特定浓度下的相对标准偏差（RSD）要求。*基质效应：要求评估基质效应，并使用同位素内标或基质匹配标准曲线进行校正。3.标准的主要参与单位介绍中国检验检疫科学研究院（ChineseAcademyofInspectionandQuarantine,CAIQ）作为本标准制定的积极参与方和关键推动者之一，中国检验检疫科学研究院（以下简称“中国检科院”）在该标准的立项、草案验证和国际协调中发挥了举足轻重的作用。机构概况：中国检科院是国家市场监督管理总局直属的科研事业单位，是国内食品安全、动植物检疫、消费品安全及化学品检测等领域最具权威性的国家级研究机构之一。其下设的多个研究所，如食品安全研究所、检验检测技术研究所等，长期致力于食品安全检测技术的研究与应用。专业优势与贡献：1.强大的技术研发能力：中国检科院在真菌毒素分析领域拥有数十年的研究积淀和丰富的实战经验。其团队不仅精通传统的色谱和质谱技术，更深刻理解UHPLC-MS/MS技术的前沿动态。在此次标准制定中，他们贡献了大量关于中国谷物（如小麦、玉米、大米）基质的复杂样本处理方法以及17种毒素同时分离优化的核心数据。例如，针对中国谷物品种中常见的脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）及其衍生物，他们提出的针对中国谷物基质的前处理优化方案，显著提高了方法在复杂基质中的鲁棒性。2.带头开展协同验证：国际标准的建立，必须通过国际协同实验室间的验证来证明其普适性。中国检科院不仅主导组织了包括中国、德国、美国、日本等多个国际领先实验室参与的协同验证实验，还开发了用于数据统计分析的专业工具，确保了方法学性能指标（如回收率、精密度、LOQ）能够满足不同国家、不同实验室、不同型号仪器间的再现性要求。他们针对该方法在实验室间存在的基质效应差异问题，提出了统一的校正策略，为标准的发布奠定了坚实的科学基础。3.推动标准的国际化与本土化衔接：中国检科院在标准制定过程中，积极将中国的粮食安全监管需求与国际标准相衔接。例如，中国农业部在谷物中对玉米赤霉烯酮和呕吐毒素的限量要求与国际标准存在差异，中国检科院作为桥梁，将中国监管机构对检测比对的性能需求准确传递给ISO专家，使得最终标准既能满足国际通用的高水平要求，又能为中国的政府实验室和第三方检测机构提供“一次检测，多方承认”的便利，有效降低了贸易合规成本。4.技术培训与推广：ISO标准发布后，中国检科院迅速组织力量，对中国国内的食品安全监管机构、粮油检验所、大型粮食加工企业及第三方检测公司进行技术培训，详细讲解该标准的操作要点和技术细节，帮助国内检测机构快速掌握这项先进技术，从而推动中国整体真菌毒素防控水平的提升。综上所述，中国检验检疫科学研究院凭借其深厚的技术科研实力、丰富的国际标准化工作经验以及对中国国内市场的深刻理解，为ISO23719:2025的顺利出台和有效落地作出了不可磨灭的贡献。4.标准的应用价值与市场影响4.1对食品安全监管的支撑该标准为全球食品安全监管机构提供了一把统一且精确的“尺子”。各国监管机构可以利用该方法对进口或国内流通的谷物及其制品进行高效、准确地监督抽查。一次检测即可覆盖17种主要毒素，大大提高了监管效率，避免了因使用不同方法导致的结果争议，增强了监管结果的公信力。4.2对国际贸易的促进在国际农产品贸易中，真菌毒素的检测结果是决定货物是否通过的关键。ISO23719:2025作为国际通用标准，消除了因方法不一致导致的技术壁垒。出口商只需按照一个统一标准进行检测报告，即可获得进口国监管机构的认可，显著降低了重复检测成本和时间成本，促进了谷物贸易的自由化和便利化。4.3对检测实验室的赋能对于检测实验室而言，该标准的出台提供了一个即插即用的标准化解决方案。实验室无需再从零开始开发复杂的方法，只需按照标准流程进行设备配置、试剂采购和方法验证，即可快速建立检测能力。标准的详细操作指南（SOP）、质谱条件参数、图谱库以及内标法策略，都大大降低了实验室的技术门槛，有助于提升整个行业的技术水平。4.4对谷物加工企业的指导对于粮食收储和加工企业，该标准不仅是一种风险控制的工具，更是提升产品竞争力的手段。企业可以通过内部建立该检测方法，对其原料采购和成品出厂进行严格的质量把控，确保产品符合国际最严格的法规要求。这有助于企业树立品牌形象，赢得国内外高端市场。结论ISO23719:2025《谷物和谷物制品超高效液相色谱和串联质谱法（UHPLC-MS/MS）测定17种真菌毒素》的发布，是国际食品安全标准化领域一个里程碑式的成就。它不仅成功整合并规范了当前最先进的UHPLC-MS/