菌种扩大培养技术

《菌种扩大培养技术》教学内容一、种子扩大培养的目的二、种子扩大培养一般流程三、实验室菌种培养技术四、生产车间菌种培养技术五、影响种子培养的因素六、啤酒工业中的种子扩大培养技术七、酱油工业中厚层通风制曲技术一、菌种扩大培养的目的种子扩大培养是指将保存在沙土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面，活化后再经过扁瓶或摇瓶以及种子罐逐级扩大培养，从而获得一定数量和质量的纯种的过程，所得的纯种培养物称为种子。（一）关于菌种扩大培养种子扩大培养的目的就是为每次发酵罐的投料生产提供数量足够的、活力旺盛的种子。（二）菌种扩大培养的目的二、种子扩大培养一般流程保藏斜面斜面活化三角瓶培养种子罐培养发酵罐（一）一般流程斜面三角瓶培养10m3种子罐培养100m3发酵罐发酵二级扩大培养流程（二）设计流程需考虑的因素斜面三角瓶培养10m3种子罐培养100m3发酵罐发酵斜面三角瓶培养8m3种子罐培养80m3种子罐培养800m3发酵罐发酵与发酵规模有关例如：谷氨酸发酵例如：谷氨酸发酵斜面三角瓶培养30m3种子罐培养300m3发酵罐发酵斜面三角瓶培养3m3种子罐培养30m3种子罐培养300m3发酵罐发酵与生产操作有关谷氨酸菌斜面三角瓶培养30m3种子罐培养300m3发酵罐发酵赖氨酸菌斜面三角瓶培养3m3种子罐培养30m3种子罐培养300m3发酵罐发酵例如：谷氨酸发酵与赖氨酸发酵与菌种特性有关（三）种子扩大培养的阶段实验室种子制备阶段生产车间种子制备阶段实验室种子制备阶段一般包括斜面种子的培养、实验室内进行的固体或液体培养基的种子扩大培养。在无菌操作条件下，将试管斜面接种到摇瓶中，经恒温振荡培养形成大量菌体的过程，称为摇瓶培养。一级种子培养设备一级种子培养设备一级种子培养设备一级种子培养设备为什么要振荡培养？（1）菌体与底物充分接触（2）增加溶氧振荡培养需控制哪些要素？（1）温度（2）pH（3）振幅（4）频率（5）装液量摇瓶培养条件因菌种不同而异，对于好氧性微生物菌种，振幅、振荡频率、装液量以及瓶口覆盖的纱布等对氧气的溶解程度均有较大影响，应加以严格控制。摇瓶培养成熟后，可存放于4℃冰箱内备用，保存时间不超过一天。三、实验室菌种培养技术（一）斜面菌种的培养斜面培养基组成：

葡萄糖0.1%,蛋白胨1.0%，牛肉膏1.0%，氯化钠0.5%，琼脂2.0~2.5%，pH7.0~7.2，121℃灭菌20min。（传代和保藏斜面不加葡萄糖）斜面培养条件：谷氨酸斜面菌种一般在30~32℃培养18~24h。每批斜面菌种培养完成后，要仔细观察菌苔生长情况、菌苔的颜色和边缘等特征，确认正常后存入冰箱备用。（二）一级种子培养摇瓶培养基组成：葡萄糖25g/L，尿素5g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，磷酸二氢钾1.2g/L，玉米浆25~35g/L（根据玉米降质量指标增减用量），硫酸亚铁、硫酸锰各2ppm，调节pH7.0，每个1000mL三角瓶分装培养基200mL，121℃灭菌20min。（培养基成分可因菌种不同酌情增减。）摇瓶培养条件：冷却后接入斜面菌种，置于冲程8.0cm左右、频率100次/min左右的往复式摇床上恒温32~33℃振荡培养8~10小时。衡量摇瓶培养结束的指标是什么？根本指标菌体浓度个/mL表观指标pH变化尿素分解与被利用培养基与培养条件相对稳定pH变化有一定规律可以确定培养程度下摇床时机（一般情况）pH6.8~7.0残糖在10g/L左右下摇床后取样检测，确认正常、无污染后，在无菌条件下进行并瓶操作，即每10~12个1000mL三角瓶的一级种子液并入到1个灭好菌的3000mL种子瓶中，存入4℃冰箱备用。谷氨酸一级种子质量要求是什么？种龄：9~10h

pH值：6.8~7.0光密度：净增OD650值0.5以上（581比色计650nm）残糖：1.0g/L左右

无菌检查：（-）噬菌体检查：无镜检：菌体生长均匀、粗壮，排列整齐，革兰氏阳性反应。四、生产车间菌种培养技术在以种子罐进行种子扩大培养流程中，种子罐级数根据菌种生长特性、菌体繁殖速度以及所采用发酵罐的容积而定。例如：在青霉素发酵生产中，将孢子悬浮液接入一级种子罐，于27℃培养40h，孢子发芽，长出短菌丝，然后移接至新鲜培养基的第二级种子罐，于27℃培养10~24h，菌丝迅速繁殖并获得粗壮菌体，方可作为种子接入发酵罐，整个过程采用了二级种子罐的扩大培养。在种子扩大培养中，越接近发酵罐的培养级数，其培养基组成越接近发酵培养基，以有利于种子接入发酵罐后尽快适应发酵培养基。根据种子罐培养基的量而决定培养基灭菌操作方式，采用实消或连消，灭菌后降温至培养温度，等待接种。（一）实验室种子如何接入种子罐？种子罐接种时，实验室制备的孢子一般采用打开接种口接入，而摇瓶菌丝体种子一般采用微孔压差法接入。接种操作在火焰保护下进行。并瓶操作一级种子接入种子罐接种时，在火焰范围内将一级种子瓶的软管套在种子罐的接种管上，一级种子瓶与种子罐连通后，通过急剧排除种子罐内空气，使一级种子瓶与种子罐之间产生气压差，而将一级种子液压进种子罐。●培养过程中，主要控制温度、pH、通入的无菌空气量等条件，并定时取样进行化验和镜检，如检验残糖和显微镜观察细胞的形态等。●培养成熟的种子液，经取样检验正常后，方可移接下一级。（二）谷氨酸二级种子培养1.培养基组成实例一：葡萄糖25g/L，MgSO4·7H2O0.7g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，糖蜜125g/L，玉米浆250g/L，纯生物素18.8μg/L，尿素5g/L，硫酸亚铁、硫酸锰各2ppm，调节pH7.0，实消，121℃保温10min。实例二：葡萄糖45g/L，MgSO4·7H2O0.7g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，糖蜜125g/L，玉米浆250g/L，纯生物素18.8μg/L，硫酸亚铁、硫酸锰各2ppm，实消，

121℃保温10min，实消前不需调节pH，实消降温后用液氨调节至pH7.0。2.培养条件接种量0.03~0.5%培养温度32~34℃种子罐有夹套或盘管或列管等装置。采用循环冷却水进行降温。搅拌转速150~200r/min根据种子罐容积和搅拌叶径而定，通常容积大的种子罐设计搅拌速度会小一些。通气比0.15~0.44vvmvvm

：1m3液体1min通入空气的体积。通气比根据种子罐容积、搅拌器叶径、搅拌转速等条件决定，即取决于种子罐氧气传递速率。培养过程中通气比控制曲线♫一般来说，氧气传递速率大的种子罐通气比小一些。♫同时，在种子培养过程中随着菌体耗气量的增大，需不断增大通气量。培养时间根据生产中采用的培养工艺与培养基营养成分及浓度而定。3.培养过程pH的变化若采用尿素作为培养基氮源的培养工艺，初始pH一般为7.0左右，随着菌体生长，脲酶不断分解尿素产生NH3，pH值会出现上升；当pH值达到高峰值以后，又会随氮源被消耗而逐步下降。pH的高峰值取决于尿素用量，故尿素用量不能过高。通常控制pH的高峰值在pH8.0以下。在培养时间为8~9h时，pH值一般可下降至7.0左右，此时应结束培养。如果是采用流加液氨作为氮源的工艺，初始pH为7.0左右，在培养过程中通过流加液氨来维持pH7.0~7.2，同时供给菌体生长所需的氮源。此时种子培养时间实质取决于溶氧。4.培养过程OD的变化实例一与实例二的培养结果，说明了什么问题？5.二级种子接入发酵罐的操作五、影响种子培养的因素①培养基②种龄与接种量③温度④pH⑤通气与搅拌⑥泡沫⑦污染杂菌或噬菌体六、啤酒工业中的种子扩大培养技术1、实验室扩大培养（1）液体试管培养

将10mL麦汁装入富氏瓶内，灭菌备用。用接种针将酵母斜面菌种接入富氏瓶内，置于25~27℃培养箱中培养2~3天，培养过程中定时摇动，使沉淀的酵母重新分布到培养基中。（2）巴氏瓶培养将250~500mL麦汁装入500~1000mL的巴氏瓶中，加热煮沸，使瓶内蒸汽从侧管喷出，30min后，吸去弯管内的冷凝水，塞上棉塞，冷却后备用。巴氏瓶可用三角瓶或平底烧瓶代替。在无菌操作条件下，将培养成熟的富氏瓶或试管酵母液由侧管接入巴氏瓶中，置于23~25℃培养箱中培养2天，每天观察培养情况。（3）卡氏罐培养

卡氏罐容量一般为10~20L，加入5~10L麦汁后，先拔去侧管的玻璃塞，加热煮沸，使蒸汽从侧管和弯管喷出，30min后停止加热，塞上玻璃塞，吸去弯管内的冷凝水。然后，添加1L无菌水，以补充蒸发的水分。冷却后，备用。将1~2瓶巴氏瓶的酵母液接入卡氏罐，摇匀，置于18~20℃培养箱中培养3~5天，即可进行用于进一步的扩大培养。2、生产车间扩大培养

（1）汉生罐培养用无菌空气将卡氏罐中的酵母液压入汉生罐，通入无菌空气5~10min，于13~15℃下培养36~48h，在此期间每隔数小时通风10min。当汉生罐的培养液进入旺盛发酵期时，在搅拌的条件下将85%左右的酵母液移接至下一级培养罐中，仍保留15%左右酵母液作为下次扩大培养的种子。对于留下来的种子液，可加入经灭菌、冷却的麦汁，待起发后，冷却至2~4℃，罐内压力保持为0.02~0.03MPa，备用。（2）酵母扩大培养罐培养

将汉生罐酵母液接入酵母扩大培养罐，并加入14~16℃的麦汁400~500L，待发酵旺盛期再追加12~15℃的麦汁2000