CN116008523B 防荧光信号串扰的数字elisa检测方法 （格物致和生物科技(北京)有限公司）

司WO2024067667A1,2024.04本发明特别涉及一种防荧光信号串扰的数且通过亲和反应形成“磁珠-待测靶标分子-酶”列芯片中；将荧光底物转移到微孔阵列芯片中；列中的含有磁珠的微孔的数量以及微孔阵列中靶标分子被磁珠捕获并进一步与酶结合的几率，2步骤7、基于所述微孔阵列中的含有所述磁珠的微孔的数量以及所述微孔阵列中的荧3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述氟油在25℃下的粘滞系数在1cSt至6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述硅油在25℃下的粘滞系数在10cSt至34[0003]一类采用高灵敏度的光学仪器来检测单分子信号，代表性的产品有默克公司的[0005]Quanterix公司的SimoaTM(Single-moleculeArray)系统则采用类似数字PCR(PolymeraseChainReaction，聚合酶链式反应)的数字ELISA(EnzymeLinked[0007]为了解决现有技术中的上述问题，本发明提供了一种防荧光信号串扰的数字ELISA检测方法，降低反应体系的荧光信号背景，并且降低反应检测单元内的荧光信号扩5[0015]步骤7、基于所述微孔阵列中的含有所述磁珠的微孔的数量以及所述微孔阵列中[0016]本发明的一个实施例中，所述隔离液为氟油，所述氟油在25℃下的粘滞系数在[0017]本发明的一个实施例中，所述氟油在25℃下的粘滞系数在1cSt至5000cSt的范围[0018]本发明的一个实施例中，所述氟油在25℃下的粘滞系数为11.4cSt、451cSt或[0019]本发明的一个实施例中，所述隔离液为硅油，所述硅油在25℃下的粘滞系数在0是所述样本中的所述待测靶标分子成有所述复合物的所述样本转移到所述微孔阵列芯片的所述流体腔室以及所述微孔阵列6一个或多个视野的荧光图像所确定的阳性反应检测单元的数量以及作为常数的待测靶标[0035]图1是根据本发明的一个实施例的防荧光信号串扰的数字ELISA检测方法的原理[0036]图2是根据本发明的一个实施例的防荧光信号串扰的数字ELISA检测方法的流程4B是从图3B示出的荧光图像中提取并计算出的某一[0040]图6A1-图6B2是采用不同隔离液隔离后阳性微孔荧光值以及串扰微孔荧光值随时[0043]在本申请中使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本申7[0044]图1是根据本发明的一个实施例的防荧光信号串扰的数字ELISA检测方法的原理明能够至少基于样本中的磁珠的数量来绝对定量样本中的待测本中的磁珠的数量与样本中的待测靶标分子的数量的比值大于等于5，从而使得待测靶标双抗夹心反应连接有#-半乳糖苷酶，并且荧光底物可以为不发射荧光的试卤灵-#-半乳糖89所处的微孔的荧光信号低于阈值。可以将微孔阵列中的荧光信号高于阈值的微孔判读为1基于一个或多个视野的荧光图像来确定微孔阵列中的荧光信号高于阈值的[0066]在步骤7(S7)处，基于微孔阵列中的含有磁珠的微孔的数量以及微孔阵列中的荧0是样本中的待测靶标分子的数量，N0是样本中的磁珠的数的数量，并且p是待测靶标分子被磁珠捕获并进一步与酶结合的几率(如果操作均一性高，中的含有磁珠的微孔(反应检测单元)的数量N为12.1万，基于一个或多个视野的荧光图像所确定的微孔阵列中的荧光信号高于阈值的微孔(阳性反应检测单元)的数量M为5000，并且待测靶标分子被磁珠捕获并进一步与酶结合的几率p为80则样本中的待测靶标分子的数量M0采用以下公式MO=-Noln(1-/p计算为39753，并且待测靶标分子的浓度c采用以下公式c＝M0m/V计算为13.9f[0072]根据上面的描述，在根据本发明的一个实施例的防荧光信号串扰的数字ELISA检的磁珠(1,000,000个)与特定体积(100μL)链霉亲和素-β-半乳糖苷酶(100fM,1pM,10pM)进再分别按照两步加样法和一步加样法的技术方案进行微孔阵列[0076]如下面的表1所示，一步加样法中的阴性微孔信号(即，背景信号或背景)抬升明件从图3A示出的荧光图像中提取并计算出的某一列微孔的荧光信号，并且图4B是采用ImageJ软件从图3B示出的荧光图像中提取并计算出的某一列微孔的磁珠(1,000,000个)与100fM链霉亲和素-β-半乳糖苷酶进行反应，反应缓冲溶液为1×[0083]如下面的表2所示，低粘滞系数的编号_#1氟油(在25℃下的粘滞系数为0.出现了明显的染料扩散现象，而高粘滞系数的编号_#2氟油(在25℃下的粘滞系数为11.4cSt)、编号_#3氟油(在25℃下的粘滞系数为451cSt)和编号_#4氟油(在25℃下的粘滞(在25℃下的粘滞系数为6.6cSt)均出现了明显的染料扩散现象，而高粘滞系数的编号_#7硅油(在25℃下的粘滞系数为350cSt)未出现明显的染料扩散现象。粘滞系数cSt@25℃10.77211.43452.366.67当隔离液为硅油时，硅油在25℃下的粘滞系数在10cSt至12500cSt的范围内，优选地在[0090]另外，图6A1和图6A2是采用编号_#1的隔离液隔离后阳性微孔荧光值以及串扰微孔荧光值随时间的变化示意图，并且图6B1和图6B2是采用编号_#3的隔离液隔离后阳性微荧光值上升很快。而从图6B1和图6B2可以看出，在采用高粘滞系数的编号_#3隔离液隔离