CN116179593B 绞股蓝毛状根遗传转化体系的建立方法 （广西中医药大学）_第1页
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A,2023.06.06A,2023.10.10A,2024.02.20A,2023.05.30gypenosidebiosynthesis.BBiology.2024,第24卷1-14.本发明公开了一种绞股蓝毛状根遗传转化共培养过程中产生菌斑的外植体用含有抑菌剂含有筛选抗生素的6,7-V固体筛选培养基培养，为绞股蓝的基因功能研究及利用生物技术手段提高绞股蓝药效活性成分的含量提供了技术支2素的LB液体培养基中，28～30℃,180～220r/min振荡培养至菌液浓度达到OD＝0.8-3[0002]绞股蓝Gynostemmapentaphyllum(Thunb.)Makino为葫芦科绞股蓝属草质攀援植合成与调控方面具有独特的优势。例如利用在人参毛状根中过表达法尼基焦磷酸合酶[0008]2)发根农杆菌侵染液的制备：将含有目的基因的表达载体质粒转化至发根农杆4[0015]优选的是，步骤1)中，在无菌绞股蓝叶片上[0018]b)在无菌操作台中，用接种环挑取步骤a)转化后的发根农杆菌，划线到含40~[0020]d)按照0.8％-1％的接种量，取步骤c)培养的[0021]e)步骤d)培养的菌液在8000r/min离心5min后倒掉上清液收集菌体；MS液体培养5[0052]选择发根农根菌MSU440(链霉素抗性)、发根农根菌Ar.Qual(链霉素和氯霉素抗6[0065]将在共培养过程中形成菌斑的外植体用无菌水(含有300～400mg/L羧苄青霉素和渐的降低抗生素的浓度直至外植体周围的菌斑完[0069]侵染后培养20d统计不同发根农杆菌侵染叶片和茎段诱导的发根数，根据毛状根采用绞股蓝的茎段作为外植体诱导发根的概率极低，5个发根农杆菌菌株均能诱导出发根7[0079](一)以绞股蓝基因组中转录因子GpbHLH4的CDS序列为参照设计特异引物[0085]通过两轮PCR反应将attB位点添加到GpbHLH4的CDS序列两侧，使片段两端带上83'。[0092]将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳并回收大小约为1200bp的目的条带。于冰上配制[0097]利用Gateway技术的同源重组方式将GpbHLH4的CDS序列组装到pK7WG2D过表达载体上(载体图普如图3所示)。于冰上配制LR重组反应体系：含目的片段的中间载体2O成功得到含目的基因的表达载体质粒pK7WG29[0107]步骤三、挑取单个菌落，接种到1.5mLLB液体培养基中(含50mg/L壮观霉素)，[0116]将在共培养过程中形成菌斑的外植体用无菌水(含有300～400mg/L羧苄青霉素和[0125]PCR检测结果表明：3个诱导发根系中均能够检测到rolB和rolC基因，效率为子碰撞能量6eV，碎片离子碰撞能量20～50eV，质量扫描范围m/z100～2000，扫描时间[0133]采用正离子多反应监测(MRM)定量模式，将对照品和总皂苷样品溶液进行定性分达GpbHLH4的根系中绞股蓝皂苷合成路径关键酶基因的表达水平显著提高。同时，过表达

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