ISO 251842026 分子生物标志物分析-核苷酸测序-验证的下一代序列(VNG)标准立项发展报告

分子生物标志物分析-核苷酸测序-验证的下一代序列(VNG)标准立项发展报告StandardizationDevelopmentReport:MolecularBiomarkerAnalysis—NucleotideSequencing—VerifiedNextGenerationSequences(VNGS)摘要随着精准医学、生物安全及合成生物学等领域的蓬勃发展，基于高通量测序技术的分子生物标志物分析已成为生命科学研究和应用的核心工具。然而，测序数据的复杂性、平台差异及分析流程的多样性，导致测序结果的准确性、可比性和可重复性面临严峻挑战。为解决这一行业痛点，国际标准化组织（ISO）制定了ISO25184:2026《分子生物标志物分析-核苷酸测序-验证的下一代序列(VNG)》标准。本标准首次在国际层面定义了“验证的下一代序列(VNGS)”这一关键术语，并系统规范了从原始测序数据到最终可信序列的验证流程、质量标准及报告要求。报告深入剖析了标准立项的行业背景、技术动因及国际标准化治理框架，详细阐述了标准的核心技术内容，包括VNGS的定义、数据质量控制指标、验证算法性能要求以及结果报告格式。主要结论表明，ISO25184:2026的发布填补了高通量测序数据分析与验证领域的国际标准空白，解决了数据互操作性的根本难题。作为行业基础性标准，它将极大促进测序数据在不同实验室、不同平台间的可比性，支撑生物医药研发、临床诊断、法医鉴定及农业育种等领域的合规应用，加速从科研到临床的转化进程。本报告旨在为该标准的推广实施、行业宣贯及后续标准制修订工作提供权威参考。关键词：分子生物标志物；核苷酸测序；验证的下一代序列(VNGS)；高通量测序；数据验证；国际标准；质量指标Keywords:MolecularBiomarker;NucleotideSequencing;VerifiedNextGenerationSequences(VNGS);High-ThroughputSequencing;DataValidation;InternationalStandard;QualityMetrics一、引言在当代生命科学与生物技术领域，DNA测序技术已经从基础研究工具演变为驱动精准医疗、作物遗传改良、微生物组学分析以及公共卫生监测等众多应用场景的关键引擎，特别是以NGS（下一代测序，NextGenerationSequencing）和TGS（三代测序，ThirdGenerationSequencing）为代表的高通量测序技术，其通量、速度和成本优势使其能够在一次运行中实现全基因组、全外显子组或靶向基因组的深度测序。这种能力使得科学家能够以前所未有的精度检测基因突变、鉴定病原微生物、追踪遗传变异及分析RNA表达谱。分子生物标志物，如特定基因的突变、融合基因、拷贝数变异或甲基化模式，是生物过程、病理状态或对治疗干预响应的客观指示物。其在疾病诊断、预后判断、用药指导、药物研发及疾病监测中发挥着不可替代的作用，而精准地检测和量化这些生物标志物，高度依赖于可靠、准确且可重复的测序数据分析结果。然而，高通量测序技术的广泛应用带来了数据管理和解释层面的巨大挑战。其数据分析流程通常涉及碱基识别、序列比对、变异检测、注释及过滤等多个环节，每一个环节均可能引入误差或偏差。不同测序平台（如Illumina,IonTorrent,PacBio,OxfordNanopore）的化学原理、错误模式和读长特征截然不同，而各类生物信息学分析工具的算法又各具优势和不足，导致即使对同一样本进行分析，不同实验室、不同流程所获得的测序结果也可能存在显著差异。这种数据的不一致性严重制约了测序结果在不同研究项目间的比较、大型Meta分析的实施、临床检测的互认以及监管审批的标准化。国际标准化组织（ISO）长期致力于制定和发布各领域的技术标准，以促进国际贸易、技术交流和质量保障。面对高通量测序领域缺乏统一数据验证标准的困境，ISO技术委员会ISO/TC276(生物技术)专门成立了相关工作组，经过多轮专家研讨与意见征集，最终于2026年4月正式发布了ISO25184:2026《分子生物标志物分析-核苷酸测序-验证的下一代序列(VNG)》。这是全球首个针对测序数据最终验证及序列确定过程提出的国际标准，标志着该领域从数据生产向数据确定性标准化迈出了历史性的一步。二、标准立项背景与技术动因2.1行业面临的“数据谷”困境高通量测序虽然产生了海量数据，但“原始测序数据”与“可被生物学或医学解释的可靠变异”之间存在一个巨大的“数据谷”（DataValley）。如何确认一个测序reads（读段）或一个变异call（调用）是真实的、非技术性假阳性，是当前行业最大痛点之一。常见问题包括：*测序错误：由测序试剂或仪器自身引入的碱基误判，尤其在均聚物区域（PolymerRegions）和低复杂度区域尤为突出。*比对错误：特别是当序列含有重复序列、同源序列或结构变异时，reads的错配、多匹配会导致错误的变异推断。*嵌合体序列：在文库构建或扩增过程中，不同来源的DNA片段连接而成的虚假序列，在宏基因组和肿瘤异质性研究中非常棘手。*序列编辑问题：RNA编辑、体细胞突变、线粒体异质性与测序或扩增引起的伪突变之间的区分高度依赖于验证程序。这些因素叠加，导致直接基于单个或少数reads的变异检测结果往往不可靠。必须有系统化的验证机制，从多个维度（包括读段深度、质量分数、支持reads的多样性、方法学复现等）综合判断后才能输出一个“被验证的”可信序列或变异。2.2标准化需求呼之欲出在标准发布前，尽管已有各种行业指南或实验室内部规程，但不同机构对“验证”的定义、所需数据量、验证方法的选择（如利用Sanger测序验证或数字PCR验证）乃至阳性判断阈值均不统一。例如，肿瘤液体活检的ctDNA（循环肿瘤DNA）分析通常要求变异等位基因频率（VAF）大于0.1%且双侧双端测序深度达到数千甚至上万，但这种标准并不适用于微生物全基因组组装，后者的“验证”更多依赖浅层测序装配的一致性度量和环化验证。无统一标准直接导致了：1.可重复性危机：大量标志物结果无法在独立实验室复现，损害了科学发现的可信度。2.临床转化壁垒：监管机构（如FDA、EMA）难以基于非标准化的数据评估一项测序检测的临床有效性和实用性，影响了IVD（体外诊断）产品的注册进程。3.数据互操作性差：不同数据库、不同社区间的数据交换困难，阻碍了利用公共数据资源进行的大规模联合研究和知识发现。以分子生物标志物为核心，制定一项关于“验证的下一代序列”的ISO标准，正是为了解决上述系统性障碍，建立全球统一的技术语言与质量基准。三、ISO25184:2026标准核心内容解读ISO25184:2026标准的核心关注点并不仅仅是测序的整个工作流程，而是聚焦于如何从经过初步处理和分析的序列数据中，确定一套“验证的”序列集合，这一过程被称为“VNGS确认”。标准是在“起点”和“终点”之间搭建了一座坚实的桥梁。3.1术语定义：区分原始数据、比对结果和VNGS标准的核心是正式定义了“VerifiedNextGenerationSequences(VNGS)”。该术语特指通过一个预先定义的、系统化的、多证据来源的验证规程后，被认为具有高度真实性和生物学意义的核苷酸序列片段、单体型或变异集合。这区别于普通的感觉灵敏的原始测序片段或生物信息学软件直接输出的初级鉴定结果。*初级测序读段（RawRead）：测序仪直接输出的碱基和对应的质量分数序列。*比对后的可能性序列：经过比对算法映射到参考基因组上的读段集合(AlignedReads)，但其中可能仍包含由比对错误或重复导致的假阳性。*VNGS：经过并满足如“两条以上独立reads支持”（针对变异）或“组装连续性指标达到一定阈值”（针对全长片段）等预设规则后的可信序列。VNGS可以是一个明确的单体序列，也可以是一个区分出等位基因的差异性序列。3.2验证流程的核心框架标准规定了VNGS的生成必须满足以下几个关键步骤：1.输入数据要求：强调用于验证的序列数据必须来自具有明确标准操作程序（SOP）和适当质量控制（如文库QC、测序上机QC）的实验流程。2.序列层面验证要求：*覆盖度与深度：指定了对于不同应用场景（生殖系变异、肿瘤体细胞变异、微生物基因组组装），最低的序列覆盖深度阈值和支持reads数量，例如：对于生殖系SNP（单核苷酸多态性）验证，可能要求>20X深度且至少2条正负链均支持的reads。*碱基质量分数：要求用于验证的reads的每个碱基的质量值（Q-score）必须超过特定阈值，通常Q≥30（准确率99.9%）。*一致性比率：规定了在特定区域中，所有支持VNGS的读段必须高度一致；在可变剪接或混合突变的情况下，必须明确说明是混合群体。3.变异级别验证要求：*变异调用：呼吁避免使用仅依赖于单一算法的变异检测程序。标准建议使用多种不同原理的算法结合（例如GATK与VarScan2和Mutect2联合判读），并通过贝叶斯模型或投票机制统一结果。*背景错误库：要求建立一个平台/批次特定的背景错误模型（ErrorProfile），以更智能地消除测序或扩增中反复出现的系统误差，将非真实生物学信号剔除。4.验证报告和输出格式：标准定义了VNGS输出的报告内容，必须包含被验证序列的具体坐标、替换的碱基、质量评分（如一个VNGS_Score）、支持验证的算法证据、背景错误去除标记以及软件版本、参数设置等元数据。这确保了用户能追溯每一个VNGS的生成过程。3.3对不同测序平台的适配性标准充分考虑了NGS和长读长测序（LRS）平台的特殊性。对于短读长NGS，VNGS验证主要依赖深度覆盖和多样本/多算法的交叉验证。而对于长读长测序（如PacBioHiFi和ONTQ20+），其单条reads准确率已达到Q20以上，这类数据的“验证”模式则更偏向于利用其长读长特点直接跨越重复区域进行单分子验证，即通过单一长reads自身的一致性来验证结构准确性。标准明确区分了对这两种模式的要求，体现了其前瞻性和包容性。四、核心参与单位介绍本标准的制定过程凝聚了全球顶尖科研机构、标准认证组织及大型跨国生物技术公司的智慧。其中，美国国家标准与技术研究院（NIST）扮演了至关重要的角色。美国国家标准与技术研究院(NIST)NIST隶属于美国商务部，是美国历史最悠久的物理科学实验室之一，也是全球最具公信力的标准研究与认证机构之一。其使命是“通过推进测量科学、标准和技术，以促进创新、提升产业竞争力并改善生活质量。”在生物技术标准领域，尤其是基因组学测量与标准方面，NIST处于无可争议的领导地位。在ISO25184:2026的制定过程中，NIST的核心贡献体现在以下几个方面：1.提供基准物质与参考数据：NIST开发并发布了多个用于校准和验证测序流程的基因组参考物质，如著名的NA12878（一个经过广泛深度测序和手工审查的基因组DNA样本），已成为全球验证新测序或分析流程的黄金标准。这些参考物质的详细测序数据和公认的阳性/阴性变异集，为定义“什么是可信的VNGS”提供了物理和数学依据。标准中关于验证要求的许多具体阈值（如深度的要求）很大程度上受益于NIST对这些物质大量复现性研究的数据支持。2.提出核心验证框架：NIST基因组测量小组的科学家率先提出了用于区分技术假阳性与真实生物学变异的计量学方法，例如利用多个独立测序平台和多种化学试剂组合来产生一个“虚拟数字PCR”效果，以此验证一个变异是否为真实。这种以“统计确认”和“多平台正交验证”为核心的思路，被直接导入到了VNGS的概念中。3.促进数据格式的互操作：NIST长期推动开发标准化的基因组数据格式和元数据规范，如GA4GH（全球基因组学与健康联盟）标准的一部分。在本标准中，它们将VNGS的输出报告与GA4GH的VCF格式基础进行了对接，确保了VNGS可以无缝接入现有的生物信息学管道。NIST还主导制定了“Sequence-AwareMetadata”标准，这些对ISO25184全面落地至关重要。4.参与文本拟定与同行评审：多位NIST资深科学家作为ISOTC276的美国和全球专家，主导了草案的起草、技术参数的论证以及终稿的修订。他们以严谨的科学态度，坚持标准必须建立在可重复的实验数据和第三方验证基础上，避免了标准可能陷入过于理论化、脱离实际操作的困境，确保了标准的科学性、实用性和权威性。可以说，NIST的本土化测量科学传统、对参考物质的供给以及对大量高通量测序验证实验的开展，为ISO25184:2026标准提供了最坚实的物理基础和逻辑架构。五、结论与展望ISO25184:2026《分子生物标志物分析-核苷酸测序-验证的下一代序列(VNG)》标准的正式发布，是全球高通量测序标准化进程中的一座重要里程碑。它首次在国际层面系统定义了“何为可信的测序序列”，并提供了明确的、可量化的验证方法框架。该标准直接回应了测序数据转化为可靠生物学知识的核心瓶颈——对数据真实性的判断，为精准医学、分子诊断、环境监测及农业基因组学等应用领域建立了一个统一的技术语言和度量基准。其直接影响在于：*提升数据质量一致性：不同实验室使用该标准时，输出的VNGS将具有相近的质量等级，极大促进了多中心研究结果的合并和比较。*降低监管和合规风险：IVD制造商、临床实验室可以依据该标准设计验证方案，使产品更容易获得FDA、CE等监管