2027创新设计一轮生物 高考共鸣点14　基因敲除及同源重组、融合基因与融合蛋白

SHENGWUXUE基因敲除及同源重组、融合基因与融合蛋白高考共鸣点14热点考情速览基因敲除及同源重组构建基因表达载体2025·福建卷，10；2025·广西卷，21；2025·安徽卷，20；2025·广东卷，21；2025·河北卷，22；2024·重庆卷，20；2024·广西卷，21；2023·江苏卷，22；2023·天津卷，17融合基因与融合蛋白2025·福建卷，20；2025·黑吉辽蒙卷，25；2024·江苏卷，23；2023·辽宁卷，8；2023·浙江6月选考，19；2023·天津卷，171目

录基因敲除及同源重组构建基因表达载体2融合基因与融合蛋白热点1基因敲除及同源重组构建基因表达载体1.同源重组构建表达载体 (1)减数分裂Ⅰ非姐妹染色单体的交换(2)利用同源重组双交换实现基因敲除2.基因敲除技术——应用Cre－LoxP系统进行基因敲除 (1)Cre－loxP系统的组成(2)Cre－loxP系统的作用方式[例]

(2025·安徽卷，20)稻瘟病是一种真菌病害，水稻叶片某些内生放线菌对该致病菌有抑制作用。科研小组分离筛选出内生放线菌，并开展了相关研究。回答下列问题。

(1)采集有病斑的水稻叶片，经表面消毒、研磨处理，制备研磨液。此后，采用

(填方法)将研磨液接种于不同的选择培养基，分别置于不同温度下培养，目的是___________________________________________。稀释涂布平板法筛选出不同条件下生长的内生放线菌(2)经筛选获得一株内生放线菌，该菌株高效合成铁载体小分子，能辅助内生放线菌吸收铁离子。R基因是合成铁载体的关键基因之一。科研小组构建R基因敲除株，探究铁载体的功能。主要步骤如下：首先克隆R基因的上游片段R－U和下游片段R－D；然后构建重组质粒；最后利用重组质粒和内生放线菌DNA片段中同源区段可发生交换的原理，对目标基因进行敲除。如图1所示。

说明：用图1中的引物1和2进行PCR扩增。采用PCR技术鉴定R基因的敲除结果。PCR通过变性、复性和延伸三步，反复循环，可实现基因片段的

。R基因敲除过程中，可发生多种形式的同源区段交换，PCR检测结果如图2所示，其中R基因敲除株为菌落

(填序号)，出现菌落④的可能原因是____________________________________________________________________________________。(3)内生放线菌和稻瘟病致病菌的生长均需要铁元素。科研小组推测该内生放线菌通过对铁离子的竞争性利用，从而抑制稻瘟病致病菌生长。设计实验验证该推测，简要写出实验思路。_____________________________________________________________________________________________________________。快速扩增②

只有R－U或R－D一处发生了同源重组，导致整个重组质粒整合到了内生放线菌的基因组中

将野生型内生放线菌、R基因敲除内生放线菌分别与稻瘟病致病菌混合培养在含铁培养液中,统计培养液中铁离子含量及两种菌的数量变化解析

(1)可采用稀释涂布平板法将研磨液接种于不同的选择培养基，并分别置于不同温度下培养的目的是筛选出不同条件下生长的内生放线菌。(2)PCR的实质是体外的DNA复制，所以PCR可以实现基因片段的快速扩增。由图1可知，未发生同源重组前，在引物1、2的作用下可扩增出的片段为3000bp，故菌落①③未发生同源重组。若R基因被敲除，引物1和引物2只能扩增出R－U和R－D片段，长度为1000bp，故菌落②为发生同源重组后的R基因敲除株。根据题干信息，R基因敲除过程中可发生多种形式的同源区段交换，菌落④的大小约为7000bp，则可以推测在同源重组过程中，只发生了R－U或R－D一处同源重组，导致整个重组质粒片段接入。(3)若要验证内生放线菌通过与稻瘟病致病菌竞争性利用铁离子抑制稻瘟病致病菌的生长，则实验的自变量应为内生放线菌是否能利用培养液中的铁离子，即R基因的有无，因变量应该为稻瘟病致病菌的生长情况，最后可观测两种菌的数量和培养液中的铁离子含量变化情况来验证实验结论。所以实验可分为两组，甲组：将适量的含R基因的内生放线菌和稻瘟病致病菌混合培养在含铁的培养液中；乙组：将等量的R基因敲除内生放线菌与稻瘟病致病菌混合培养在相同的含铁培养液中；将两组培养液放在适宜的条件下，间隔合适时间记录每组培养液中铁离子含量变化和两种菌的数量变化。热点2

融合基因与融合蛋白1.融合基因与融合蛋白2.报告基因技术[例1]

(2025·福建卷，20)为建立一种效率高、毒性小的基因敲除系统，将图1所示的质粒1和质粒2导入大肠杆菌，质粒2中的sgRNA基因依据目的基因设计，其转录的短链RNA通过与目的基因碱基互补配对，与Cas9蛋白共同作用，敲除大肠杆菌基因组中的目的基因。回答下列问题：(1)大肠杆菌LacZ基因的表达产物可催化X－gal生成蓝色物质从而使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。将质粒1与含LacZ基因相应sgRNA基因的质粒2同时转化到大肠杆菌中，涂布到含抗生素

的平板(含有X－gal)上进行培养。若长出的是

色菌落则为LacZ基因被敲除的大肠杆菌。(2)Cas9基因的表达量会影响敲除效率，但其过量表达会对大肠杆菌有毒。为评估毒性和敲除效率，用5种启动子(A、B、C、D和E)启动Cas9的转录，相应检测结果如图2所示。结果表明，启动子

对细胞毒性最小；综合考量毒性和敲除效率，应选用启动子

用于该系统。卡那霉素和四环素白CA(3)含有质粒的大肠杆菌在无抗生素选择压力下培养，少数子代细胞会丢失质粒。结合质粒1和质粒2的特点，在成功敲除LacZ基因的大肠杆菌中消除质粒1和质粒2，实验流程如图3所示。①培养12小时后，图3试管1中大部分的大肠杆菌

(填选项)。A.含质粒1和质粒2

B.只含质粒1C.只含质粒2 D.无质粒1和质粒2B②若要从图3平板上筛出质粒1和质粒2均被消除的大肠杆菌，简要写出实验思路和预期结果：___________________________________________________________________________________________________________________________。

将同一菌落的大肠杆菌分别用含卡那霉素和四环素培养基进行培养，两者均不生长则为筛出的大肠杆菌解析

(1)质粒2中含有与LacZ基因对应的sgRNA基因，其转录出来的短链RNA与目的基因(LacZ基因)发生碱基互补配对，与Cas9蛋白共同作用，敲除大肠杆菌LacZ基因，因而不能使X－gal分解产生蓝色物质，将质粒1和质粒2导入大肠杆菌，因此在含四环素和卡那霉素且含X－gal的培养基中，筛选白色的菌落即为LacZ基因成功敲除的菌落。(2)Cas9的表达量过高对大肠杆菌产生毒性，使其数量减少，结合图2可知，启动子C对应的菌落数最高，因此启动子C对细胞毒性最小。结合菌落数和敲除率可知，启动子A的菌落数和敲除率均较高，因此综合考虑，应选择启动子A作用于该系统。(3)①质粒2为温度敏感型质粒，在37℃下不能进行复制，培养12小时后，试管1中大部分大肠杆菌为只有质粒1，B正确，A、C、D错误。

②试管2加入蔗糖，质粒1中的SacB基因表达的SacB蛋白能将蔗糖转化为有毒化合物，抑制大肠杆菌的生长繁殖，因此试管2中含质粒的大肠杆菌较少，为进一步筛选质粒1和质粒2均消除成功的大肠杆菌，实验设计思路和预测实验结果为：将同一菌落的大肠杆菌分别用含卡那霉素和四环素培养基进行培养，在无抗生素平板上可以生长，在含抗生素平板上均不生长的则为筛出的大肠杆菌。[例2]

(2026·广东汕头调研)人类γ基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A蛋白结合位点，该位点结合BCL11A蛋白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定BCL11A蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。(1)为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，在F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是

，在R末端添加的序列所对应的限制酶是

。本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要

种酶。Sal

ⅠEcoRⅠ6(2)将构建的载体导入除去BCL11A基因的受体细胞，成功转化后，含F1～F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光；含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光。含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光的原因是__________________________________________________________________。F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达(3)向培养液中添加适量的雌激素，含F1～F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光，而含F5～F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有BCL11A蛋白的结合位点序列，据此结果可推测，BCL11A蛋白结合位点位于___________________________________________________________________________________________________________，

引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上理由是__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。

根据有无荧光情况判断，F1～F4与R扩增产物上均有BCL11A蛋白结合位点，因此结合位点位于F4所对应调控序列的下游；F5～F6与R扩增产物上均无BCL11A蛋白结合位点，可知结合位点位于F5所对应调控序列的上游。所以，结合位点位于引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上解析

(1)据图可知，荧光蛋白基因的启动子在右侧，右侧有三种限制酶识别位点，用EcoRⅠ会破坏荧光蛋白基因，所以为了定向连接，需用两种限制酶，即Xho

Ⅰ和Mun

Ⅰ。据图可知，扩增后的产物F1～F7末端添加的序列应与Xho

Ⅰ切割的末端相连，R末端添加的序列应与Mun

Ⅰ切割的末端相连，由于调控序列及启动子中含有Xho

Ⅰ识别序列和切割位点，因此用Sal

Ⅰ可切割出相同的黏性末端，所以在F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是Sal

Ⅰ；同理，调控序列及启动子中含有Mun

Ⅰ识别序列和切割位点，因此用EcoRⅠ可切割