团体标准 枸杞干果中30种有机磷的测定 气相色谱-串联质谱法

团体标准枸杞干果中30种有机磷的测定气相色谱-串联质谱法本标准按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》起草。本标准由__________团体提出并归口。本标准起草单位：__________、__________、__________、__________、__________。本标准主要起草人：__________、__________、__________、__________、__________、__________。本标准为首次发布。1范围本标准规定了枸杞干果中30种有机磷农药残留量的气相色谱-串联质谱测定方法，包括方法原理、试剂与材料、仪器与设备、样品制备、测定步骤、结果计算与表述、精密度、检出限与定量限、质量控制及安全与防护等要求。本标准适用于枸杞干果中30种有机磷农药残留量的定性鉴别与定量测定，30种有机磷农药具体名单参见附录A。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T1.1—2020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则GB2763食品安全国家标准食品中农药最大残留限量GB2760食品安全国家标准食品添加剂使用标准GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T8321（所有部分）农药合理使用准则GB/T27404实验室质量控制规范食品理化检测SN/T0001进出口商品抽样检验方法通则SN/T2324进出口食品中有机磷类农药残留量的检测方法气相色谱-质谱法3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1有机磷农药一类含有磷元素的有机化合物农药，具有高效、广谱的杀虫、杀菌、除草作用，本标准特指附录A中规定的30种有机磷农药。3.2检出限（LOD）在规定的实验条件下，样品中目标物能够被定性检出的最低浓度，本标准中以3倍信噪比（S/N≥3）对应的浓度作为检出限。3.3定量限（LOQ）在规定的实验条件下，样品中目标物能够被准确定量测定，且回收率和精密度符合要求的最低浓度，本标准中以10倍信噪比（S/N≥10）对应的浓度作为定量限。3.4基质匹配标准溶液以空白枸杞干果样品提取液为基质，加入一定量的有机磷标准储备液配制而成的标准溶液，用于消除样品基质对测定结果的干扰。3.5回收率样品中添加已知量的目标物后，经过样品处理、测定，实际测得的目标物量与添加量的比值，用于评价方法的准确性。4原理枸杞干果样品经乙腈提取，盐析分层后，取上清液经固相萃取柱净化，去除样品基质中的杂质（如色素、多糖、酚类等），浓缩定容后，采用气相色谱-串联质谱法（GC-MS/MS）进行测定。样品中的目标有机磷农药经气相色谱柱分离后，进入质谱仪，在电子轰击电离源（EI）或化学电离源（CI）作用下电离成离子碎片，通过选择反应监测模式（SRM）监测特征母离子和子离子，以保留时间和特征离子对进行定性鉴别，外标法（基质匹配）进行定量计算。5试剂与材料除非另有说明，本标准所用试剂均为分析纯或色谱纯，实验用水符合GB/T6682规定的一级水。5.1试剂乙腈（CH₃CN）：色谱纯。甲醇（CH₃OH）：色谱纯。乙酸乙酯（CH₃COOC₂H₅）：色谱纯。氯化钠（NaCl）：分析纯，650℃灼烧4h，冷却后密封保存，去除杂质。无水硫酸镁（MgSO₄）：分析纯，650℃灼烧4h，冷却后密封保存，去除水分及杂质。甲酸（HCOOH）：分析纯，纯度≥98%。氨水（NH₃·H₂O）：分析纯，浓度25%~28%。石英砂：分析纯，650℃灼烧4h，冷却后备用，用于样品研磨分散。5.2标准品与标准溶液30种有机磷农药标准品：纯度≥98%，具体名单、CAS号参见附录A，购自国家认可的标准物质供应商，具有标准物质证书。标准储备液（1000μg/mL）：分别准确称取适量各有机磷农药标准品，用甲醇溶解并定容至容量瓶中，配制成浓度为1000μg/mL的标准储备液，置于-20℃避光密封保存，有效期6个月。混合标准中间液（10μg/mL）：准确吸取适量各有机磷农药标准储备液，用甲醇稀释并定容，配制成浓度为10μg/mL的混合标准中间液，置于4℃避光密封保存，有效期1个月。基质匹配标准工作液：准确吸取适量混合标准中间液，用空白枸杞干果样品提取液逐级稀释，配制成浓度为0.01μg/mL、0.02μg/mL、0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.5μg/mL的基质匹配标准工作液，现配现用。内标溶液（可选）：准确称取适量内标物（如磷酸三苯酯），用甲醇配制成浓度为10μg/mL的内标溶液，用于校正样品处理过程中的损失，置于4℃避光密封保存，有效期1个月。5.3固相萃取材料与耗材固相萃取柱：C18柱（500mg/6mL）或PSA柱（500mg/6mL），或等效固相萃取柱，用于样品净化。滤膜：0.22μm有机相滤膜，用于过滤净化后的样品溶液，去除微小杂质。离心管：50mL、10mL聚四氟乙烯离心管，无农药残留，提前用乙腈润洗，晾干后使用。容量瓶：10mL、50mL、100mL玻璃容量瓶，无农药残留，校准合格后使用。移液管：1mL、2mL、5mL、10mL，校准合格后使用，无交叉污染。6仪器与设备气相色谱-串联质谱仪（GC-MS/MS）：配备电子轰击电离源（EI）和化学电离源（CI），具备选择反应监测模式（SRM），性能符合相关标准要求。高速冷冻离心机：转速≥8000r/min，温度可调控（0~4℃），用于样品提取后的分层离心。分析天平：感量0.1mg和0.001g，校准合格后使用，用于标准品、样品及试剂的称量。超声波提取仪：功率≥200W，频率40kHz，用于样品的辅助提取，提高提取效率。氮吹仪：配备氮气发生器，可调控温度（30~80℃），用于样品溶液的浓缩定容。固相萃取装置：真空固相萃取装置，可调控真空度，用于样品的固相萃取净化。组织捣碎机/研磨机：用于枸杞干果样品的粉碎、研磨，确保样品均匀。烘箱：可调控温度（50~105℃），用于玻璃器皿的烘干。超声波清洗器：用于玻璃器皿的清洗，去除残留杂质。涡旋振荡器：用于样品提取液、标准溶液的混匀，确保体系均匀。玻璃器皿：烧杯、移液管、容量瓶、离心管等，使用前经硝酸浸泡、自来水冲洗、蒸馏水冲洗、烘干，确保无农药残留。7样品7.1样品采集按照SN/T0001的规定，根据枸杞干果的生产批次、产地、规格，随机采集具有代表性的样品，每批次采集样品量不少于1kg，分为两份，一份用于检测，一份作为留样，留样保存于-20℃避光密封条件下，保存期限不少于6个月。采集样品时，应避免样品受到污染，使用无农药残留的采样工具和容器，详细记录样品信息（包括样品名称、产地、批次、采集时间、采集地点、规格等）。7.2样品制备样品粉碎：将采集的枸杞干果样品去除杂质（如石子、枝叶、破损果实等），放入组织捣碎机/研磨机中，加入适量石英砂，粉碎至均匀粉末（过40目筛），确保样品均匀，无明显颗粒。样品保存：粉碎后的样品放入洁净、无农药残留的密封容器中，标注样品信息，置于4℃冷藏保存，保存期限不超过7天，尽快完成检测，避免农药残留发生变化。7.3样品提取准确称取5.00g（精确至0.001g）粉碎后的枸杞干果样品，置于50mL聚四氟乙烯离心管中，加入20mL乙腈，涡旋振荡1min，使样品充分浸润。将离心管放入超声波提取仪中，在室温下超声提取20min（功率200W，频率40kHz），期间每隔5min涡旋振荡1次，确保提取充分。提取完成后，向离心管中加入5g氯化钠和3g无水硫酸镁，立即涡旋振荡2min，使乙腈与水相充分分层，无水硫酸镁吸收水分。将离心管放入高速冷冻离心机中，在4℃、8000r/min条件下离心10min，使上清液与沉淀完全分离。小心吸取上清液10mL，置于10mL离心管中，待净化；若上清液浑浊，可先经0.45μm有机相滤膜过滤，再取滤液待净化。7.4样品净化采用固相萃取柱净化，可选用C18柱或PSA柱，具体操作如下（以C18柱为例）：固相萃取柱活化：将C18柱安装在固相萃取装置上，用5mL甲醇活化柱子，再用5mL乙腈平衡柱子，弃去流出液，控制流速为1~2mL/min，确保柱子充分活化。上样与洗脱：将待净化的上清液10mL缓慢加入固相萃取柱中，控制流速为1~2mL/min，弃去流出液；用5mL乙腈洗脱柱子，收集洗脱液于10mL离心管中。浓缩定容：将收集的洗脱液放入氮吹仪中，在40℃、氮气保护条件下浓缩至近干，加入1.0mL甲醇（或基质匹配空白提取液），涡旋振荡1min，使残留物充分溶解，经0.22μm有机相滤膜过滤，滤液转移至进样瓶中，供GC-MS/MS测定；若使用内标法，在浓缩定容前加入适量内标溶液，混匀后过滤。7.5空白实验除不加入枸杞干果样品外，其余按照7.3~7.4的步骤进行空白实验，制备空白样品溶液，供GC-MS/MS测定，用于扣除空白干扰。7.6加标回收实验准确称取5.00g空白枸杞干果样品（经检测确认无目标有机磷农药残留），分别加入低、中、高三个浓度水平的混合标准中间液，使加标浓度分别为定量限、2倍定量限、10倍定量限，每个浓度水平平行测定6次，按照7.3~7.4的步骤进行样品处理和测定，计算回收率和精密度，验证方法的准确性和可靠性。8测定8.1气相色谱条件气相色谱条件可根据仪器型号和目标物性质适当调整，参考条件如下，确保30种有机磷农药能够完全分离：色谱柱：HP-5MS毛细管柱（30m×0.25mm×0.25μm），或等效毛细管柱（如DB-5MS、BP-5MS）。载气：高纯氮气（纯度≥99.999%），恒流模式，流速1.0mL/min。进样口温度：250℃，不分流进样，分流比0:1（不分流时间1min，之后分流比10:1）。进样量：1μL。柱温程序：初始温度60℃，保持1min；以8℃/min升温至150℃，保持2min；以5℃/min升温至220℃，保持3min；以10℃/min升温至280℃，保持8min；进样口、检测器温度同步匹配。溶剂延迟：5min，避免溶剂峰干扰目标物测定。8.2质谱条件质谱条件可根据仪器型号和目标物性质适当调整，参考条件如下，确保目标物的特征离子对能够有效监测：电离源：电子轰击电离源（EI），电离能量70eV。离子源温度：230℃。接口温度：280℃，与色谱柱出口温度匹配。监测模式：选择反应监测模式（SRM），每种目标有机磷农药选择1个母离子和2个特征子离子（1个定量子离子，1个定性子离子），具体母离子、子离子及碰撞能量参见附录A。碰撞气：高纯氩气（纯度≥99.999%），碰撞气压力0.2Pa。扫描周期：0.1s，确保每个色谱峰至少有10个扫描点。8.3测定步骤仪器调试：开启气相色谱-串联质谱仪，按照上述气相色谱条件和质谱条件调试仪器，预热30min以上，确保仪器性能稳定，基线平稳，信噪比符合要求。标准曲线绘制：按照浓度由低到高的顺序，依次注入基质匹配标准工作液，每个浓度水平进样3次，记录目标物的定量子离子峰面积（或峰高）。以目标物的浓度为横坐标（x），定量子离子峰面积（或峰高）为纵坐标（y），绘制标准曲线，计算回归方程和相关系数（r），相关系数r应≥0.995，否则重新配制标准溶液并绘制标准曲线。样品测定：将制备好的样品溶液、空白样品溶液、加标样品溶液依次注入气相色谱-串联质谱仪，按照上述条件进行测定，记录目标物的保留时间、定量子离子峰面积（或峰高）。定性鉴别：根据样品溶液中目标物的保留时间，与基质匹配标准工作液中目标物的保留时间进行比对，相对偏差应≤2%；同时，样品溶液中目标物的定性子离子与定量子离子的峰面积比，应与基质匹配标准工作液中对应离子对的峰面积比一致，相对偏差应≤15%，满足上述条件即可定性鉴别样品中含有该目标有机磷农药。9结果计算与表述9.1结果计算采用外标法（基质匹配）计算样品中各有机磷农药的残留量，计算公式如下：X=式中：X——样品中目标有机磷农药的残留量，单位为毫克每千克（mg/kg）；C——由标准曲线计算得到的样品溶液中目标有机磷农药的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；C₀——由标准曲线计算得到的空白样品溶液中目标有机磷农药的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；若空白样品中未检出目标物，则C₀=0；V——样品溶液的最终定容体积，单位为毫升（mL）；f——样品提取过程中的稀释倍数（本标准中f=2，因吸取10mL上清液，最终定容至1mL，稀释倍数=20mL/10mL×1mL/1mL=2）；m——称取的样品质量，单位为克（g）；1000——单位换算系数（1mg=1000μg）。若使用内标法，计算公式中需加入内标校正因子，具体按照仪器操作说明书和相关标准调整。9.2结果表述定量结果：样品中目标有机磷农药的残留量计算结果保留两位有效数字；若测定结果小于检出限（LOD），则表述为“未检出（＜LOD）”；若测定结果大于等于检出限、小于定量限（LOQ），则表述为“检出，但未达到定量限（LOD≤X＜LOQ）”；若测定结果大于等于定量限，则直接表述为计算得到的残留量数值。平行样结果：每个样品应至少做2个平行样测定，平行样测定结果的相对偏差应≤15%，取平行样测定结果的平均值作为最终测定结果；若平行样相对偏差大于15%，应重新进行样品处理和测定。限量判定：测定结果应与GB2763中规定的枸杞干果中对应有机磷农药的最大残留限量进行比对，若测定结果小于最大残留限量，则判定为符合要求；若测定结果大于等于最大残留限量，则判定为不符合要求。10精密度重复性：在重复性条件下，对同一枸杞干果样品（添加低、中、高三个浓度水平的目标有机磷农药），分别平行测定6次，各目标物的相对标准偏差（RSD）应≤15%，低浓度水平（定量限附近）的相对标准偏差（RSD）应≤20%。再现性：在再现性条件下，不同实验室、不同仪器、不同操作人员，对同一标准阳性样品进行测定，各目标物的相对标准偏差（RSD）应≤20%，确保方法的再现性符合要求。11检出限与定量限本标准中30种有机磷农药的检出限（LOD）为0.001~0.005mg/kg，定量限（LOQ）为0.003~0.015mg/kg，具体每种有机磷农药的检出限和定量限参见附录A，均满足GB2763中对枸杞干果中有机磷农药残留限量检测的要求。12质量控制12.1试剂与标准品控制试剂：所用试剂均应符合本标准规定的纯度要求，实验前应对试剂进行空白检查，确保无目标有机磷农药干扰；实验用水应定期检测，符合GB/T6682规定的一级水要求。标准品：标准品应购自国家认可的标准物质供应商，具有标准物质证书，使用前检查标准品的纯度和有效期；标准储备液、中间液、工作液的配制应严格按照本标准要求进行，做好配制记录，标注配制日期、浓度、配制人员等信息，定期核查标准溶液的稳定性。固相萃取柱：固相萃取柱应在有效期内使用，使用前进行活化验证，确保净化效果；不同批次的固相萃取柱应进行空白实验和加标回收实验，验证其适用性。12.2仪器控制气相色谱-串联质谱仪：仪器应按照相关标准进行定期校准（每年至少1次），校准合格后方可使用；实验前应对仪器进行调试，检查载气纯度、流速、柱温、离子源温度等参数，确保仪器性能稳定；实验过程中做好仪器使用记录，包括开机时间、调试参数、测定样品数量、仪器运行状况等，定期维护保养（如更换色谱柱、清洗离子源、检查检测器等）。其他仪器：高速冷冻离心机、分析天平、氮吹仪、超声波提取仪等仪器，应定期校准和维护，确保仪器精度和性能稳定，实验前进行调试，做好使用记录。12.3实验过程控制样品采集与制备：样品采集应具有代表性，采样工具和容器无农药残留；样品粉碎应均匀，避免样品污染和交叉污染；粉碎后的样品应及时检测，避免农药残留发生变化。提取与净化：样品提取过程中，超声时间、离心转速、离心时间等参数应严格控制，确保提取充分；固相萃取净化过程中，活化液、洗脱液的用量和流速应严格按照本标准要求进行，避免目标物损失或净化不彻底。空白实验：每批样品（不超过20个）应至少设置1个空白样品，空白样品检测结果应为未检出目标有机磷农药，若检出目标物，应排查试剂、耗材、仪器等环节的污染，重新进行实验。加标回收实验：每批样品（不超过20个）应至少设置1个加标样品（中浓度水平），加标回收率应在70%~120%之间，低浓度水平（定量限附近）的加标回收率应在60%~130%之间，否则该批样品的测定结果无效，应排查原因并重新进行检测。平行样控制：每个样品应至少做2个平行样测定，平行样相对偏差应≤15%，若偏差过大，应重新进行样品处理和测定。12.4数据控制实验数据应及时、准确记录，包括样品信息、试剂信息、仪器参数、标准曲线数据、样品测定峰面积、计算结果等，记录应完整、清晰、可追溯，不得随意涂改，涂改处应签字确认。标准曲线的相关系数r应≥0.995，否则重新配制标准溶液并绘制标准曲线；测定结果的计算应准确，单位换算正确，平行样平均值的计算符合要求。检测结果应经双人复核，确保定性鉴别准确、定量计算无误，复核人员签字确认后，方可出具检测报告。13安全与防护实验过程中使用的乙腈、甲醇、乙酸乙酯等有机溶剂具有挥发性、毒性和易燃性，应在通风橱中进行操作，佩戴防护手套、防护眼镜、口罩等个人防护用品，避免皮肤接触和吸入；严禁在实验现场吸烟、使用明火，防止火灾和爆炸事故发生。有机磷农药标准品具有毒性，称量和配制时应严格遵守操作规程，在通风橱中进行，佩戴一次性手套和口罩，避免误食和皮肤接触；剩余的标准品和废弃的标准溶液应按照危险废物管理规定进行处理，不得随意丢弃。实验过程中使用的硝酸、甲酸、氨水等试剂具有腐蚀性，应妥善保管，避免接触皮肤和衣物；若不慎接触，应立即用大量流动清水冲洗，必要时就医。气相色谱-串联质谱仪、氮吹仪等仪器运行过程中，应严格按照仪器操作说明书进行，避免违规操作；仪器运行时，不得擅自打开仪器外壳，防止高温、高压和辐射伤害。实验结束后，应及时清理实验台面，关闭仪器电源、气源和水源，通风换气；清洗实验器具，将废弃的试剂、耗材分类收集，按照危险废物管理规定进行处理。实验人员应经过专业培训，掌握实验操作技能和安全防护知识，熟悉应急处理措施，确保实验安全。14废弃物处理固体废弃物：实验过程中产生的固体废弃物（如枸杞样品残渣、用过的滤膜、固相萃取柱、一次性手套、口罩等），应收集在专用的固体废弃物容器中，分类存放，标注废弃物类型，按照危险废物管理规定委托有资质的单位进行无害化处理，严禁随意丢弃。液体废弃物：实验过程中产生的液体废弃物（如有机提取液、废弃标准溶液、试剂废液等），应收集在专用的废液桶中，标注废液种类和收集日期，分类存放（如有机溶剂废液、酸性废液、碱性废液），经无害化处理后排放，或委托有资质的单位进行处理，严禁随意排放，防止污染环境。废弃仪器与耗材：废弃的色谱柱、离心管、容量瓶等仪器耗材，应清洗干净后，按照实验室废弃物管理规定进行处理；若被有机磷农药或有毒试剂污染，应按照危险废物处理。15附录附录A（规范性附录）30种有机磷农药相关信息及质谱参数A.130种有机磷农药具体名单、CAS号、检出限、定量限参见表A.1。A.230种有机磷农药在GC-MS/MS测定中的质谱参数（母离子、定量子离子、定性子离子、碰撞能量）参见表A.1。序号农药名称CAS号母离子（m/z）定量子离子（m/z）定性子离子（m/z）碰撞能量（eV）检出限（mg/kg）定量限