SNT 5872-2025 出口食品中诺如病毒和甲肝病毒检测方法 实时荧光逆转录重组酶介导链替换核酸扩增法（实时荧光RT-RAA法）标准立项发展报告

出口食品中诺如病毒和甲肝病毒检测方法实时荧光逆转录重组酶介导链替换核酸扩增法（实时荧光RT-RAA法）标准立项发展报告EnglishTitle:StandardizationDevelopmentReport:DetectionMethodforNorovirusandHepatitisAVirusinExportedFoods-Real-timeFluorescenceReverseTranscriptionRecombinase-AidedAmplification(Real-timeFluorescenceRT-RAA)摘要关键词中英文关键词-中文关键词：出口食品；诺如病毒；甲肝病毒；实时荧光RT-RAA；检测方法；行业标准；食品安全；口岸检疫-英文Keywords：ExportedFoods;Norovirus;HepatitisAVirus;Real-timeFluorescenceRT-RAA;DetectionMethod;IndustryStandard;FoodSafety;PortQuarantine正文一、引言食品安全是全球关注的焦点问题，关乎公众健康、贸易秩序与社会稳定。病毒性食源性疾病是全球范围内发病率最高的食源性疾病之一。其中，诺如病毒（Norovirus,NoV）和甲肝病毒（HepatitisAVirus,HAV）是导致人类急性胃肠炎和急性肝炎的两大主要病原体。这两种病毒主要通过粪-口途径传播，具有感染剂量低、环境稳定性高、可在食品中持续存活等特点。贝类（如牡蛎）、浆果、色拉用蔬菜、即食食品等因易受污染，常成为病毒传播的载体。对于我国而言，作为全球最大的食品出口国之一，出口食品的安全质量直接关系到国家信誉、企业利益和国际贸易的顺利进行。近年来，欧盟、美国、日本等主要贸易伙伴国对我国出口食品中的病毒残留监管日趋严格，屡次因诺如病毒或甲肝病毒污染问题触发预警通报，甚至导致贸易壁垒。传统的病毒检测技术，如细胞培养法、电子显微镜法和RT-qPCR法，均存在明显局限性。例如，细胞培养法耗时长且NoV难以体外培养；电子显微镜法灵敏度低、设备昂贵；RT-qPCR法则需要精密的热循环仪和专业实验室，难以满足口岸一线快速、便捷、高通量的现场检测需求。鉴于上述挑战，开发一种适用于口岸实际、操作简便、结果可靠且成本可控的快速检测方法显得尤为迫切。实时荧光逆转录重组酶介导链替换核酸扩增技术（Real-timeFluorescenceReverseTranscriptionRecombinase-AidedAmplification,简称实时荧光RT-RAA）应运而生。该技术模拟了细胞内DNA复制和重组的过程，利用重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶，在恒定温度（通常37-42℃）下即可实现核酸的指数级扩增，并通过荧光探针实时监测扩增过程，实现了对靶标核酸的定性或定量检测。其核心优势在于无需复杂的温度循环设备，检测时间通常可缩短至15-30分钟，且灵敏度可与RT-qPCR相媲美。正是在此技术成熟和行业需求的双重驱动下，海关总署组织相关技术机构启动了SN/T5872-2025《出口食品中诺如病毒和甲肝病毒检测方法实时荧光逆转录重组酶介导链替换核酸扩增法（实时荧光RT-RAA法）》的编制工作。本标准是首次将实时荧光RT-RAA技术正式纳入我国出入境检验检疫行业标准体系，为出口食品中病毒污染的快速筛查提供了标准化的技术依据。二、标准立项背景与必要性2.1行业紧迫需求-口岸通关效率要求：生鲜食品（如冷冻莓果、冰鲜水产品）保质期短，对通关速度要求极高。传统检测方法从采样到出结果往往需要4-6小时甚至更久，严重制约了货物周转。RT-RAA技术可将检测周期缩短至1小时内，显著提升口岸放行效率。-监管技术升级需求：随着国际贸易技术壁垒（TBT）的不断变化，对检测技术的灵敏度、特异性、抗干扰能力和便携性提出了更高要求。现有国标和行标多基于RT-qPCR，缺乏针对恒温扩增这一新兴主流技术的标准。-打破贸易壁垒需求：主要贸易伙伴国（如欧盟、美国）已在其官方监测中广泛应用等温扩增技术作为初筛手段。我国制定相应标准，有助于实现技术对标，提升检测结果的国际互认度，减少贸易摩擦。2.2技术发展的成熟性实时荧光RT-RAA技术自被提出以来，经过多年的优化与验证，在技术原理、引物探针设计、试剂配方、仪器微型化等方面均已趋于成熟。大量研究表明，该方法在复杂食品基质（如贝类组织、植物叶片、油脂）中的核酸提取与扩增抑制控制方面取得了突破性进展，其灵敏度和特异性已得到充分验证，具备了标准化的技术基础。2.3现有标准体系的补充完善我国目前关于食品中病毒检测的标准主要有GB4789系列和SN/T系列，主要以RT-qPCR和普通PCR方法为主。这些标准在病毒确证和定量方面发挥着重要作用，但在应对口岸大量、快速筛查场景时存在短板。SN/T5872-2025的立项，正是在原有的“金标准”方法体系之外，引入了一种适用于现场快速检验（POCT）的补充方法，完善了我国出口食品病毒检测的标准层级，实现了从“实验室确证”到“口岸快筛”的完整覆盖。三、标准核心技术内容解读SN/T5872-2025标准为首次制定，其核心是建立一套基于实时荧光RT-RAA技术，用于检测出口食品中诺如病毒（GI型和GII型）和甲肝病毒RNA的标准操作规程。其主要技术内容包括：3.1适用范围本标准适用于出口贝类、浆果类、生鲜蔬菜类及其他可能受病毒污染的即食食品中诺如病毒和甲肝病毒的定性检测。明确指出适用于口岸查验、生产加工企业自检及监管部门监督抽检。3.2检测原理本标准基于以下技术原理：在恒温条件下（39℃），利用逆转录酶将病毒RNA反转录为cDNA。随后，重组酶（Recombinase）与引物结合形成蛋白-核酸复合物，在辅助蛋白作用下，识别并解开双链DNA模板。单链结合蛋白（SSB）稳定生成的单链区域，具有链置换活性的DNA聚合酶随即从引物3‘端开始延伸，合成新的DNA链。通过引物对和荧光标记探针，在扩增过程中不断产生可被检测的荧光信号，实现实时监测。3.3关键试剂与耗材标准详细规定了试剂要求，包括但不限于：-引物与探针：针对NoVGI、NoVGII、HAV的保守区域（如NoV的RdRp区、HAV的VP1/2A区），设计了高特异性引物和带有荧光基团（如FAM）与猝灭基团的探针。-酶体系：包含重组酶、单链DNA结合蛋白、具有链置换活性的BsuDNA聚合酶（大片段）和逆转录酶。-核酸提取试剂盒：要求使用能够有效去除食品中多糖、蛋白质、脂类及RT-RAA抑制剂的试剂盒，并给出了推荐产品和自配方法。3.4操作步骤标准对操作流程作了严格规定，主要包括：1.样品前处理：针对不同食品基质（如贝类去壳取消化腺和鳃、浆果直接匀浆、蔬菜剪碎），规定了具体的样品重量、洗脱液体积和匀浆条件。2.病毒浓缩与核酸提取：采用聚乙二醇（PEG）沉淀法或超滤离心法浓缩病毒颗粒，随后进行核酸提取与纯化。3.实时荧光RT-RAA反应：在0.2mL或0.5mL反应管中配制反应体系，加入模板核酸。置于恒温荧光检测仪中，设置39℃反应30分钟，同时进行荧光采集（如FAM通道）。标准明确给出了阳性对照（含靶标RNA的质粒或灭活病毒）、阴性对照（无核酸酶水）和内部扩增对照（IAC）的设置要求。4.结果判读：采用两个标准进行判定：-定性判读：在扩增曲线呈典型“S”型，且Ct值（扩增曲线上各点荧光强度达到仪器设定阈值时的循环数，此处指时间阈值）在有效范围内（例如≤20分钟），则判定为阳性。-内部对照判读：所有样本的IAC必须正常扩增，以排除因核酸提取失败或扩增抑制导致的假阴性。四、标准的特点与创新1.快速高效：从样品前处理到出具结果，整个流程可在2-3小时内完成，相比RT-qPCR法（通常需4-6小时）效率提升50%以上，满足口岸现场“即采即检”需求。2.操作简便：无需复杂的热循环设备，只需要一台恒温荧光检测仪（或普通水浴锅+荧光检测设备），操作人员经过短期培训即可掌握，降低了对高端实验室和资深技术人员的依赖。3.高灵敏性与特异性：通过精心设计的引物和探针，以及对反应体系的优化，标准方法对诺如病毒和甲肝病毒的检测限可达到10³copies/g（克）以下，与RT-qPCR在同一数量级，特异性达到100%。4.抗污染能力强：实时荧光RT-RAA采用封闭管反应，减少了气溶胶污染的风险。同时，标准引入了内部扩增对照，进一步提高了结果的可靠性。5.兼容性好：该方法可与多种商品化的核酸提取试剂盒和便携式恒温荧光检测仪配套使用，具有良好的通用性和可扩展性。五、主要参与单位介绍——中国海关科学技术研究中心SN/T5872-2025标准的制定凝聚了我国出入境检验检疫领域顶尖科研机构的智慧与力量，其中，中国海关科学技术研究中心（简称海科中心）作为核心起草单位，发挥了至关重要的作用。中国海关科学技术研究中心是海关总署直属的正局级事业单位，是我国海关系统最高级别的专业技术支撑机构。其主要职能包括：开展进出境安全风险评估与预警研究、承担海关系统重大科研攻关任务、负责海关系统标准体系建设与管理、提供执法结果的复核与仲裁检测、开展国际技术交流与规则协调等。在食品微生物与病毒检测领域，海科中心拥有国家级重点实验室——食品安全检测实验室，配备有世界一流的设施设备，包括全自动核酸提取工作站、高通量测序仪、数字PCR仪、多模式酶标仪及各类等温扩增分析仪等。该中心长期致力于口岸食品中病毒污染的监测、溯源与快速检测技术研究，在诺如病毒、甲肝病毒、戊肝病毒以及轮状病毒等食源病毒的分子流行病学和快速诊断方法开发方面积累了丰富经验。在本标准的编制过程中，海科中心牵头承担了以下关键任务：1.技术路线论证：联合多家实验室，对实时荧光RT-RAA技术原理进行深入剖析，比较不同等温扩增技术（如LAMP、RCA、HDA等）在复杂食品基质中的表现，最终确定了RAA技术作为最适合口岸快检的方案。2.引物探针设计优化：基于全球现有病毒的基因序列库，通过生物信息学分析，设计了覆盖NoVGI、NoVGII和HAV主要流行株的简并引物和特异性探针，并通过大量的实际样本验证其广谱性和特异性。3.方法学验证：组织全国多个口岸海关实验室开展实验室间比对验证。使用人工污染样品和自然污染样品，系统评估了方法的灵敏度、特异性、重现性、检出限、抗干扰性及稳定性，为本标准的科学性提供了坚实的实验数据支撑。4.标准文本撰写与协调：负责编制标准草案、编制说明、意见汇总处理表等全套立项与报批材料。积极与全国食品进出口标准化技术委员会（SAC/TC444）沟通，协调解决标准制定过程中的技术争议，确保了标准文本的质量。海科中心的深度参与，不仅保证了标准在技术层面的领先性和权威性，更为标准发布后的宣贯培训、方法推广、能力验证等后续工作奠定了坚实基础，充分体现了国家级技术机构的责任与担当。六、结论与展望SN/T5872-2025《出口食品中诺如病毒和甲肝病毒检测方法实时荧光逆转录重组酶介导链替换核酸扩增法（实时荧光RT-RAA法）》的正式发布与实施，是我国食品安全标准化建设中的一个重要里程碑。它成功地将成熟的等温扩增技术转化为行业标准，为出口食品中病毒污染的快速、现场、即时检测提供了权威的技术规范。该标准不仅能够有效解决传统检测方法周期长、依赖高端设备、难以普及等痛点，显著提升口岸一线监管的科技含量和执法效能，更能帮助企业提升自身品质控制能力，降低贸易风险。展望未来，本标准的发展与推广可从以下几个方面深化：1.向多靶标联检发展：探索在一次反应中同时检测NoV、HAV、戊肝病毒等多种食源病毒的多重RT-RAA检测方法，提高检测通量和性价比。2.向便携化、集成化发展：与微流控芯片、生物传感器等技术结合，开发集核酸提取、扩增、检测于一体的“样品进-结果出”全集成式检测设备，实现真正的掌上式现场即时检测（POCT）。3.向数字化、智能化发展：建立基于云平台的实时荧光RT-RAA