DB43∕T 3250-2025 基于高通量测序的农作物基因分型检测技术规程

43Codeofpracticeforcropgenotyping-high-throughputsequencingmethodI 2 24.4DNA提取 34.5DNA质控 3 4 45.2联合探针锚定测序法 4 6 7 76.2基因分型 7 9 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。李为国、方妙全、李乐、许美娟、肖湘谊、王俊领、黄祖军、罗超伟、尹立新、唐宜1基于高通量测序的农作物基因分型检测技术规程GB/T6682分析实验室用水规格GB/T33767.14-2023信息技术生物特征样本质量第14部分GB/T35537高通量基因测序结GB/T35890-2018高通量测序数GB/T37864生物样本库质量和能力GB/T37874核酸提取纯化方3.13.24样本质量控制4.1.1DNA4.1.2样本24.1.3水和试剂用分析纯试剂，所有试剂溶液宜大体积配制、小体积分装后高压灭菌后使用，不宜高压灭菌的试剂用0.22μm膜过滤除菌，酶溶液避免d)96孔深孔板用硬滤纸板覆盖，4.2.2保存及运输简单处理法干燥处理法www.www.a)水份含量较低的样本，用二氧化硅硅胶将叶片干燥变脆后，密封保存或运送；b)水份含量较高的样本，用真空冷冻干燥机将叶片冷冻干燥变脆后，密封保存或运送。冷冻处理法4.3种子样本取样、保存及运输4.3.1取样4.3.2保存34.3.3运输干燥的种子打包后常温快递运输，未经干燥的种子打包后低温本文推荐采用CetyltrimethylammoniumBr样本干燥样本研磨4.4.2离心柱提取法样本干燥样本研磨h。加入氯仿并混匀后离心，吸取上层水相至新的管孔中，加入等体积缓冲液后，转入离心柱，进行2次漂洗后，用TE进行溶解，获得高质量的DNA进行完整性和浓度质控，两项质控均达标才是合b)如主带不清晰呈弥散状，则为严重降解样本；4常规测序文库；进行靶向测序文库构建还需用探针对常苷酸所带荧光基团发出荧光，通过高清摄像头拍摄照片，收集保存荧光信号，完成测序5.2联合探针锚定测序法文库构建文库，两端接头主要包括扩增及测序引物互补序列、文库质控测序文库浓度、片段大小检测：文库浓度≥10ng/μL，文库片段大小主解链环化消化环化反应结束后加入核酸外切酶I和核酸外切酶Ⅲ进行消化，去除未环化线测序引物与测序模板结合生化反应端进行单脱氧核糖核苷酸结合及延伸，荧光标记被切除激发出荧光信号采集CCD照相机对测序载片拍照，采集并保存单次延伸的荧光信号，四种脱氧核糖循环测序双端测序标签序列测序碱基识别以FASTQ格式的文件进行存储，FASTQ格式中每一条测序序列用4行信息表示，符合GB/T35数据拆分测序报告生成65.3边合成边测序法测序文库构建文库，两端接头主要包括扩增及测序引物互补序列、文库质控测序文库浓度、片段大小检测：文库浓度≥10ng/μL，文库片段大小主测序文库加载到测序载片，通过桥式PCR，测序文库在测序载片上进行簇生成，获得测序模板。测序引物与测序模板结合生化反应端进行单脱氧核糖核苷酸结合及延伸，荧光标记被切除激发出荧光信号采集CCD照相机对测序载片拍照，采集并保存单次延伸的荧光信号，四种脱氧核糖循环测序双端测序增获得测序模板的互补链，然后切除掉测序模板，以互补链为新的测序模板，标签序列测序碱基识别数据拆分测序报告生成用生信分析软件，将纯净数据比对到参考基因