2026年呼吸道样本新型冠状病毒（SARS-CoV-2）核酸检测实验室技术操作规范

年呼吸道样本新型冠状病毒（SARS-CoV-2）核酸检测实验室技术操作规范前言为规范2026年度医疗机构、第三方医学检验实验室呼吸道标本新冠病毒核酸全流程检测操作，落实《新型冠状病毒实验室生物安全指南》《GB/Z157-2026体外诊断检验系统核酸扩增法检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的要求和建议》国家标准要求，强化生物安全防控、全程质量管控、防核酸交叉污染、标准化结果判读与医疗废物处置，结合当前新冠病毒变异株检测灵敏度需求、高通量筛查混采检测场景、气溶胶风险分级管控要求，制定本操作规范。本规范适用于所有开展鼻咽拭子、口咽拭子、痰液、气道抽吸物等呼吸道样本实时荧光RT-PCR新冠核酸检测的二级及以上生物安全实验室；涵盖检验前（样本转运、接收、前处理灭活）、检验中（核酸提取、扩增体系配制、上机扩增）、检验后（结果判读、报告审核、样本留存销毁、环境消杀、废弃物处置）全流程操作，所有实验室工作人员必须全员培训考核合格后方可上岗，本规范自2026年3月1日起正式执行，替代旧版实验室操作文件。第一章总则1.1适用范围标本类型：鼻咽拭子、口咽拭子、口鼻混合拭子、深咳痰液、支气管肺泡灌洗液、鼻咽抽吸物等全部呼吸道临床样本；涵盖单采单检、10合1、20合1混采样本。检测方法：以实时荧光逆转录聚合酶链式反应（Real-timeRT-PCR）为核心，同步适配全自动一体化核酸检测平台、手工核酸提取平台，针对ORF1ab、N双靶标基因扩增检测。适用机构：医院检验科、发热门诊专属PCR实验室、第三方医学检验所、疾控中心病原检测实验室。排除范围：环境物表样本、动物样本、血清抗体检测、抗原快速检测不在本规范约束范畴。1.2规范性引用文件GB/Z157-2026《体外诊断检验系统核酸扩增法检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的要求和建议》WS310《医院消毒卫生标准》GB19489《实验室生物安全通用要求》《医疗机构新冠病毒核酸检测工作手册（2026修订版）》《医疗废物管理条例》及配套医疗卫生机构废物处置规范UN3373B类感染性物质运输标准1.3术语与定义呼吸道样本灭活：分为化学灭活（含胍盐病毒保存液）、热力灭活（56℃水浴30min），通过破坏病毒包膜与核酸酶降低气溶胶感染风险。气溶胶高风险操作：样本管开盖、剧烈振荡、离心开盖、移液器快速吸排液体、破碎样本管处置，此类操作必须全程在Ⅱ级A2型生物安全柜内完成。核酸分区防污染：实验室严格划分为试剂制备区（清洁区）、样本处理提取区（污染区）、扩增检测区（产物区），三区设备、耗材、移液器、工作服完全独立，物品严禁跨区流动。灰区样本：扩增Ct值37.0～40.0区间，无法直接判定阴阳性，需原始样本双试剂复核、重复提取扩增。混采样本复核：20合1/10合1混合样本检出阳性后，全部原始单管样本拆分复检溯源。1.4人员资质与通用要求上岗资质：检验人员需具备医学检验、分子生物学相关专业学历，完成新冠核酸检测生物安全、防污染、仪器操作、应急处置四项专项培训，理论+实操考核满分80分以上持证上岗；实验室每月开展1次复训，每季度实操考核。健康管理：实验室工作人员每日岗前测温，出现发热、咽痛、咳嗽等呼吸道症状立即离岗；建立人员健康台账，每年开展职业暴露体检；有基础免疫缺陷、孕期人员禁止长期从事样本开盖等高风险操作。人员分区管理：三区人员单向流动，仅允许清洁区→提取区→扩增区单向通行，禁止逆向穿行；各区配备专属工作服、一次性隔离衣、N95口罩、护目镜、鞋套，跨区必须更换外层全套防护用品。操作纪律：实验室内禁止饮食、饮水、化妆、徒手触碰面部；禁止使用公共移液器跨区使用；实验全程禁止快速甩动液体、大力开盖减少气溶胶产生。第二章实验室硬件分区、设备与耗材管理规范2.1实验室三区硬件布局（硬性强制标准）2.1.1试剂制备区（清洁区，无任何病毒核酸模板）功能：试剂盒拆分、引物探针配制、反应体系预混液配制、阴性对照、阳性质控分装，全程无临床样本进入。硬件要求：独立负压缓冲间，单向气流；超净工作台（100级洁净）；独立冰箱、微量移液器、离心机、涡旋振荡器；独立工作服、一次性手套、75%乙醇、核酸清除剂。污染防控红线：严禁携带提取完成的核酸、扩增产物进入本区；所有耗材一次性独立包装，开封仅在本区完成；每日实验前后紫外照射2h，台面核酸清除剂擦拭。2.1.2样本处理提取区（半污染/高风险区，气溶胶产生核心区域）功能：样本接收核对、样本灭活、样本管外壁消毒、开盖振荡、核酸提取、样本留存，所有呼吸道标本操作集中于此。硬件强制配置：Ⅱ级A2生物安全柜（至少2台，手工/自动化提取分开使用）、4℃冷藏冰箱、-20℃/-70℃低温样本留存冰箱、高速冷冻离心机、全自动核酸提取仪、水浴灭活箱、双层医疗废物收集桶、专用锐器盒、应急溢洒处置包。通风要求：实验室负压-10Pa至-15Pa，独立排风系统带HEPA高效过滤，排风直排室外，禁止循环回风。2.1.3扩增检测区（产物污染高危区）功能：提取核酸加样至PCR反应板、荧光定量PCR仪上机扩增、扩增产物密封收集，本区存在大量病毒扩增核酸，污染风险最高。硬件要求：独立密闭房间，负压-15Pa；多通道实时荧光定量PCR仪；封膜机；扩增产物专用医疗废物箱；本区移液器仅用于扩增管加样，禁止带出本区。核心禁令：严禁将扩增产物带回试剂区、提取区；PCR反应管全程密封，实验结束不允许开盖。2.2核心设备定期维护、校准规范生物安全柜：每月检测气流流速、HEPA过滤器完整性；每次实验前紫外消毒30min，实验结束风机持续运行10min排空气溶胶，75%酒精擦拭内壁；每年第三方全面性能校验并留存报告。荧光定量PCR仪：每季度校准荧光通道、基线阈值；每日开机空白孔质控；每月清洁光学通道；每年厂家深度维护，建立设备维护台账。核酸提取仪：每批次实验结束使用2000mg/L含氯消毒剂擦拭内部磁棒、磁套；每周深度拆解清洗，每月验证提取效率（阳性质控Ct值波动≤2为合格）。低温冰箱：4℃冷藏每日记录温度；-20℃、-70℃冰箱每日2次温度登记，配备温度报警装置；每季度除霜，温度失控立即转移样本。水浴灭活箱：每次使用校准温度计，保证56℃恒温；每日换水消毒，防止交叉污染。2.3耗材与试剂管控标准（2026新版质控要求）耗材准入：全部移液器吸头采用带滤芯无菌吸头，杜绝气溶胶反向污染；样本管、PCR八联管无DNase/RNase污染；耗材到货每批次做空白验证，超纯水扩增无阳性扩增曲线方可入库。新冠核酸检测试剂盒管理（1）准入资质：仅采购国家药监局注册三类体外诊断试剂，试剂盒必须同时靶向ORF1ab、N双基因，检出限≤200copies/mL，适配混采样本检测。（2）试剂储存：试剂盒组分按说明书分区冷藏/冷冻保存，引物探针避光-20℃分装，避免反复冻融（冻融次数≤5次）。（3）试剂批次管理：不同批次试剂盒分开使用，每新批次试剂盒开展性能验证（灵敏度、特异性、抗干扰实验），验证合格方可临床使用；试剂开封后标注失效时间。消毒剂耗材：常备75%医用乙醇、2000mg/L（0.2%）含氯消毒液、5500mg/L（0.55%）高浓度含氯消毒液、核酸去除喷雾、3%过氧化氢消毒气溶胶，消毒液现配现用，每日更换。第三章检验前操作规范（呼吸道样本转运、接收、灭活前处理）3.1呼吸道样本采集基础要求（实验室接收核查标准）实验室接收人员需核对采样操作合规性，不合格样本直接拒收登记，退回临床重采：鼻咽拭子（首选，灵敏度最高）：拭子深入鼻腔鼻咽壁旋转擦拭，双侧鼻咽各5次，拭子头完全浸入2～3mL病毒保存液。口咽拭子：越过舌根擦拭双侧扁桃体、咽后壁各3次，禁止仅擦拭舌尖。痰液样本：患者深咳深部痰液，黏液黏稠样本需标注，实验室前处理增加液化步骤。混采样本：10合1/20合1混采需每支拭子全部浸入同一保存管，清晰标注混采人数、编号、原始单管对应清单，无编号直接拒收。3.2样本转运规范（UN3373B类感染性物质三层包装）三层包装结构：内层密封样本管、中层吸水缓冲密封袋、外层硬质转运箱；转运箱内放置吸水纸，防止渗漏污染。转运时效：样本采集后4小时内送达实验室；无法即时转运样本2～8℃冷藏保存，保存时长≤24h；超过24h未送检样本判定失效，不予检测。长途院际转运：干冰-70℃低温运输，全程冷链监控，转运人员具备感染性物质运输培训证书。转运箱消杀：每次转运完成，内外表面喷洒2000mg/L含氯消毒液，静置30min擦拭晾干。3.3实验室样本接收、核查、登记流程（提取区生物安全柜内完成）双人签收制度：转运人员、实验室接收人员双人核对《样本送检清单》，记录送检科室、人数、样本类型、采集时间、样本总数、混采配比。外包装消毒：转运箱在提取区缓冲间开盖，中层密封袋75%乙醇全覆盖喷洒，静置10min后取出样本管。样本完整性核查（任意一项不合格拒收）（1）无条码、无患者信息、无采样时间；（2）样本管破裂、渗漏、保存液泄漏；（3）拭子未完全浸入保存液、液体量不足1mL；（4）室温放置超过4h无冷藏措施；（5）痰液样本无标注、痰液量过少。合格样本登记：录入实验室LIS信息系统，生成实验室内部唯一编号，同步关联患者信息，原始送检台账保存≥1年。3.4呼吸道样本灭活与前处理标准化操作3.4.1通用灭活方案（二选一，优先化学灭活）化学灭活（含胍盐病毒保存液样本）：采样管自带灭活保存液，室温静置15min完成病毒灭活，可降低80%气溶胶感染风险，开盖操作仍需生物安全柜内进行。热力灭活（普通生理盐水保存样本）：样本管直立放入56℃恒温水浴箱，水浴30min；水浴结束取出冷却至室温，冷却10min后方可开盖，禁止高温直接开盖。3.4.2不同呼吸道样本差异化前处理拭子类（鼻咽/口咽/混采拭子）（1）生物安全柜内，样本管45°倾斜缓慢旋转开盖，减少气溶胶释放；（2）涡旋振荡器剧烈振荡30s，确保拭子病毒充分洗脱；（3）瞬时低速离心30s，管壁液体全部沉降至管底，备用提取。黏稠痰液样本（1）加入等体积0.4mg/mL蛋白酶K缓冲液，涡旋振荡15s；（2）室温静置20min液化痰液，再次振荡15s；（3）13000rpm高速离心5min，吸取上层澄清液体进行核酸提取，沉淀废弃物高压灭菌处理。支气管灌洗液：充分混匀后直接取200μL样本上清提取，无需液化步骤。3.5样本临时留存规范24h内完成检测样本：4℃冷藏直立存放，分类摆放，避免倾倒渗漏。延迟检测样本（24h～7d）：灭活后分装至无菌冻存管，-20℃冷冻保存；需长期复核溯源样本置于-70℃冰箱，留存期限不少于7天；阳性样本单独分区存放，红色标识区分。样本销毁：检测完成7天后，未留存样本全部高压灭菌无害化销毁，留存销毁登记台账。第四章检验中核心检测操作规范（核酸提取、RT-PCR扩增）4.1试剂制备区：扩增预混液配制（无模板清洁操作）操作人员更换本区专属无尘隔离衣、双层手套，佩戴N95口罩，台面核酸清除剂擦拭，紫外消毒30min后开始操作。依据试剂盒说明书配制RT-PCR反应预混液，体系包含逆转录酶、Taq酶、dNTP、ORF1ab/N基因引物探针、缓冲液；全程冰上低温操作，防止酶活性降解。每批次检测同步配制：阴性提取对照（无菌生理盐水）、空白对照（超纯水）、弱阳性质控品（检出限2倍浓度）、强阳性质控品，质控品与样本同步参与全部实验流程。预混液配制完成后密封，转运至提取区，本区不存放任何临床样本、核酸模板、扩增产物。4.2样本提取区：全自动/手工核酸提取标准化流程4.2.1全自动核酸提取仪操作（高通量混采样本首选）生物安全柜内吸取200μL处理后呼吸道样本，加入提取板对应孔位；同步加入阴性质控、阳性质控。严格按照试剂盒磁珠法提取程序设置参数：裂解10min、磁珠结合、洗涤3次、洗脱核酸50μL；裂解步骤充分灭活残留病毒。提取全程关闭提取仪舱门，禁止中途开盖；提取完成后吸取洗脱核酸，密封PCR八联管，通过密闭传递窗转运至扩增区，禁止人员跨区携带。实验结束提取仪内部喷洒5500mg/L含氯消毒液，静置30min擦拭清洁。4.2.2手工核酸提取操作（少量急诊样本）全程Ⅱ级生物安全柜内操作，带滤芯吸头一次性使用，禁止重复吸头；液体缓慢吸排，避免产生气泡飞溅。样本裂解液加入后室温静置10min充分灭活病毒；洗涤步骤彻底去除蛋白、血红蛋白等扩增抑制物。最终核酸洗脱体积50μL，核酸置于冰上暂存，30min内完成加样扩增，避免核酸降解。4.2.3提取质量管控关键点每批次提取必须设置3个阴性对照，若任意阴性对照出现扩增曲线，判定本次提取存在核酸污染，整批次样本全部重新提取，同步开展实验室全面核酸消杀溯源。4.3扩增检测区：荧光RT-PCR上机操作防护要求：扩增区专属隔离衣、护目镜，仅携带提取完成的核酸样本进入，禁止提取区耗材带入。加样流程：将5μL提取核酸模板加入含预混液的PCR反应管，封膜机严格密封八联管，杜绝扩增产物气溶胶泄漏。PCR扩增程序（通用双靶标程序，试剂盒有特殊参数以说明书为准）（1）逆转录阶段：50℃15min；（2）酶激活预热：95℃3min；（3）扩增循环（40个循环）：95℃10s，58℃30s（荧光信号采集）。上机后关闭PCR仪舱门，实验过程中禁止开启舱门；扩增结束仪器自动保存荧光曲线、Ct值原始数据，不得手动修改。第五章室内质量控制、结果判读与复核规范5.1全流程室内质控规则（2026新版强制质控体系）批次内同步质控（每板必做）空白对照（超纯水）：无Ct值，无扩增曲线；出现曲线判定试剂/耗材污染，实验作废。阴性提取对照（生理盐水）：无扩增信号，监测提取过程交叉污染。弱阳性质控品：Ct值稳定在33～36区间，Ct值漂移＞3判定提取/扩增失效。强阳性质控品：Ct值25～30区间，用于验证扩增体系有效性。日常室内质控：每日固定低值阳性质控连续检测20次，绘制L-J质控图，1-3s、2-2s规则失控立即停机排查污染、试剂、仪器问题。室间质评：按时参加国家、省级临床检验中心新冠核酸室间质评，全年质评合格率100%，质评报告归档留存。混采样本专项质控：20合1混采增加模拟阳性混样质控，验证低浓度病毒样本检出灵敏度，防止漏检变异株。5.2检测结果分级判读标准（双靶标基因判定，严格区分灰区）5.2.1阳性结果判定ORF1ab、N两个靶标基因均检出Ct值≤37.0，直接判定新冠病毒核酸阳性。单基因Ct≤37.0：判定可疑阳性，立即使用另一品牌不同靶标试剂盒对原始呼吸道样本重新提取、扩增复核，复核双基因阳性方可出具阳性报告。5.2.2阴性结果判定ORF1ab、N基因均无扩增曲线、无Ct值，且全部质控品结果正常，判定新冠病毒核酸未检出（阴性）。5.2.3灰区样本处置流程（Ct37.0～40.0）任一靶标Ct落在37～40灰区间，不直接出具报告；取原始留存呼吸道样本，重新完整灭活、提取核酸、双试剂扩增；复核双基因无信号：报告阴性；复核出现有效扩增曲线：报告阳性；仍为灰区，24小时后重新采集患者呼吸道样本复检。5.2.4无效实验判定阳性质控无扩增曲线、阴性对照出现阳性信号、扩增曲线基线异常，全部判定实验无效，所有样本重新检测，同步记录污染事件开展环境终末消杀。5.3阳性样本溯源与混采复核规范单采阳性：立即通知临床科室隔离管控，样本留存-70℃至少7天，必要时送测序实验室变异株分型。10/20合1混采阳性：该批次所有原始单管样本全部拆分单检，逐一复核，锁定阳性个体；混采阳性结果2小时内上报院感、疾控管理部门。阳性报告双人审核制度：初级检验人员初审，实验室主管复核签字后方可发布报告，禁止单人出具阳性报告。5.4检测报告标准化要求报告必填内容：患者信息、样本类型、采样时间、接收时间、检测方法、试剂盒名称、ORF1ab/N基因Ct值、结果判定、检测人员、审核人员、报告时间、检出限。报告时限：发热门诊、急诊重点人群6小时内出报告；普通住院、筛查人群12小时内完成，最长不超过24小时。报告存档：电子报告LIS系统永久保存，纸质报告归档保存不少于3年。第六章生物安全、环境消杀与职业暴露应急处置6.1实验室分区分级消杀标准（每日、每批次终末消毒）提取区（高风险）每批次样本实验结束：生物安全柜75%酒精擦拭内壁，紫外照射30min；台面、离心机使用2000mg/L含氯消毒液擦拭，作用30min清水擦净；地面每日两次2000mg/L含氯消毒液拖拭。每日实验全部结束：实验室3%过氧化氢气溶胶熏蒸密闭2h，通风过夜；紫外灯全屋照射2h以上。试剂制备区：每日实验前后核酸清除剂擦拭台面，紫外照射2h，每周一次过氧化氢熏蒸去核酸污染。扩增产物区：每次上机结束75%酒精擦拭PCR仪表面，每日紫外消毒，每周深度消杀。核酸污染专项清除：实验室出现阴性对照阳性污染时，全部台面、设备使用专用核酸降解喷雾全覆盖，密闭静置4h，连续3天空白质控无污染后方可恢复检测。6.2呼吸道样本溢洒分级应急处置流程6.2.1少量溢洒（＜1mL样本液体，生物安全柜内）立即停止操作，关闭生物安全柜风机静置15min，沉降气溶胶；佩戴双层手套、面屏，吸水纸巾覆盖溢洒区域，倾倒5500mg/L高浓度含氯消毒液，完全浸润纸巾，静置30min灭活；由内向外擦拭清理污染物，污染纸巾、拭子全部放入双层医疗废物袋高压灭菌；台面二次消毒，风机运行10min后恢复操作，记录溢洒事件台账。6.2.2大量溢洒（＞1mL、样本管破裂、实验室地面溢洒）立即疏散区域所有人员，关闭实验室负压通风，密闭房间静置30min，气溶胶完全沉降；处置人员全套三级防护（防护服、双层手套、N95+面屏、防水靴套）；吸水纱布全覆盖污染区域，倾倒高浓度含氯消毒液，静置60min；破碎玻璃、试管放入锐器盒，所有污染物双层密封高压灭菌；全屋过氧化氢熏蒸消毒2h，连续3次空白样本验证无污染，方可重启实验。6.3职业暴露应急处置皮肤黏膜暴露：样本液体沾染皮肤，2000mg/L含氯消毒液冲洗10min，清水洗净；溅入眼结膜，大量生理盐水持续冲洗15min，上报院感，7天每日核酸监测。锐器刺伤（移液器吸头、破碎试管扎伤）：由近心端向远心端挤压出血，碘伏消毒伤口，立即上报职业暴露，连续3天呼吸道核酸检测，留存随访记录。所有职业暴露24小时内填写《实验室职业暴露登记表》，院感部门全程跟踪随访。第七章实验后废弃物闭环处置规范7.1感染性固体废物分类处理样本接触废物：拭子、样本管、提取板、吸头、八联PCR管全部放入内层黄色医疗垃圾袋，装满2/3扎紧内层袋，再套第二层垃圾袋，粘贴“SARS-CoV-2感染性废物”红色标识。锐器废物：破碎试管、穿刺吸头立即投入防渗漏锐器盒，3/4满密封，禁止徒手分拣锐器。所有固