聚乙二醇干扰素α-2a注射液标准AS20010007

聚乙二醇干扰素α-2a注射液（成品）质量标准PEGASYS(Peginterferonalfa-2a) JS20020002 1 外观应为无色澄清液体，且不得含有肉眼可见的不溶物。2 pH值按《中国生物制品规程》方法测定，pH值应为6.0±0.5。3.鉴别试验（RP-HPLC法）按照纯度（RP-HPLC方法）测定的方法（见附录2）进行，待检品的保留时间与层析图谱应与其参考品一致。4．鉴别试验（苯甲醇）采用RP-HPLC方法进行（见附录3），样品中苯甲醇的保留时间与层析图谱应与参考品一致。5．纯度测定用RP-HPLC方法测定（见附录2），聚乙二醇干扰素单体的峰面积应不低于总吸收峰的95.0%；未修饰的干扰素应低于0.5%（重量）。蛋白含量测定按照纯度（RP-HPLC方法）测定的方法（见附录2）进行，聚乙二醇干扰素的蛋白含量应为标示蛋白含量的85～115%。7．生物活性测定用WISH细胞-VSV病毒系统（见附录1）测定，聚乙二醇干扰素比活性应为6.0E5-1.4E6U/mg。每支聚乙二醇干扰素(180µg/ml)含干扰素生物活性1.80E5U/ml，其生物活性测定范围应为标示量的60%-140%。苯甲醇含量测定采用RP-HPLC方法进行（见附录3），每毫升聚乙二醇干扰素的苯甲醇含量应为9.0-11.0mg。9. 细菌内毒素含量按《中国药典》方法进行，聚乙二醇干扰素内毒素含量应不高于10.0EU/ml。10．无菌试验按《中国生物制品规程》方法测定，应合格。11.装量测定按《中国药典》方法进行，应合格。12.渗透压测定按《中国药典》方法进行，应为355-425mOsm/kg。【规格】1.80E5U/ml(180µg/ml)【效期】2～8℃条件下保存2年【生产国别及生产厂】瑞士F.豪夫迈。拉罗氏公司【复核单位】中国药品生物制品检定所附录（1）微量病毒抑制（WISH／VSV）法1.原理：IFN效价测定采用微量病毒抑制（WISH／VSV）法。IFN可以保护人羊膜细胞（WISH）免受滤泡性口炎病毒（VSV）破坏。用结晶紫对存活WISH细胞染色，可以得到IFN对WISH细胞的保护效应曲线。按50％保护点的稀释倍数可以折算为待检样品中IFN的效价，测定结果需用IFN国家标准品校正。2.材料和试剂：（所用试剂均需分析纯或与指定产品相当）2.1. MEM培养液：GIBCO产品，按说明书配制，置于玻璃或塑料瓶中，4℃条件下保存。使用期限不得超过产品标示有效期。2.2. 牛血清：无支原体，杭州四季青生物工程研究所生产，中国药品生物制品检定所监制，2.3. 完全培养液：MEM培养液添加10％牛血清。2.4. 测定培养液：MEM培养液添加7％牛血清。2.5. 攻毒培养液：MEM培养液添加3％牛血清。2.6. 消化液：取0.2gEDTA、8gNaCl、0.2gKCl、1.152gNa2HPO4、0.2gKH2PO4用双蒸水配成1000ml的溶液，经121℃、15分钟高压灭菌。2.7. 染色液：取50mg结晶紫加入20ml乙醇溶解，用蒸馏水定容至100ml。2.8. 脱色液：50％乙醇，50％蒸馏水，0.1％乙酸（V／V）。2.9. 标准品：IFN效价测定用国家标准品，03／94（12000IU/支）。2.10. PBS缓冲液：取8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4、0.24gKH2PO4用蒸馏水配成1000ml的溶液，经121℃、15分钟高压灭菌。2.11. WISH细胞（人羊膜细胞）：WISH细胞在培养基中呈单层，贴壁生长，每周二次，1／4消化传代，于完全培养基中生长。2.12. VSV病毒（滤泡性口炎病毒）：-70℃保存3.设备和器材：按实验室和设备规范进行准备和检查。4.实验操作：（4.1.～4.7.各步骤应于无菌条件下进行）（第一天）4.1. 铺板：弃去WISH细胞培养瓶中的培养基，用PBS缓冲液涮洗二次后消化和收集细胞，用完全培养液配成2.5-3.5×105／ml的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，每孔100symbol109\f"Symbol"\s10.5ml。37℃，5％CO2条件下培养小时。4.2. 制备样品溶液：取1支标准品按说明书配成标准样品溶液。取规定数量的待检样品按说明书配成待检样品溶液。4.3. 制备样本溶液：根据情况用测定培养基将效价高于103IU／ml的的待检样品溶液稀释至约103IU／ml，每步稀释不得超过10倍。按以上预稀释程序制备的溶液称为样本溶液。效价低于103IU／ml的待检样品溶液和标准样品溶液作为样本溶液直接制备样本梯度。4.4. 制备样本梯度：于96孔细胞培养板中每孔加入150symbol109\f"Symbol"\s10.5ml测定培养液。在A6、A7各孔中每孔加入50symbol109\f"Symbol"\s10.5ml标准样本溶液，在A2、A3；A4、A5；A8、A9；A10、A11各孔中每孔加入50symbol109\f"Symbol"\s10.5ml各待检样本溶液，每个待检样品做2个复孔。自A行取50symbol109\f"Symbol"\s10.5ml至H行作4倍稀释，每孔留150symbol109\f"Symbol"\s10.5ml余液。4.5. 加样：取4.1.制备的细胞培养板，弃去上清。将4.4.制备的实验样本梯度移入该细胞培养板，每孔100symbol109\f"Symbol"\s10.5ml。其中，标准样本梯度和较高效价待检样品的待检样本梯度移取43～48梯度；较低效价待检样品的待检样本梯度移取41～46梯度。37℃，5％CO2条件下培养小时。（第二天）4.6. 制备病毒液：攻毒剂量为100TCID50，取保存的VSV病毒用攻毒培养液稀释至工作浓度。4.7. 攻毒：取4.5.制备的细胞培养板，弃去上清。加入病毒液，每孔100symbol109\f"Symbol"\s10.5ml。37℃，5％CO2条件下培养24～36小时（镜检标准样本的50％病变点在D或E行）。（第三天）4.8. 染色：轻轻吹打96孔细胞培养板各孔2～3次，弃去上清（于特制容器内，并做消毒处理）。每孔加入30symbol109\f"Symbol"\s10.5ml染色液，室温放置30分钟。4.9. 脱色：流水小心冲去染色液，吸干残留水分。每孔加入100symbol109\f"Symbol"\s10.5ml脱色液，室温放置3～5分钟。4.10. 比色：测定波长570nm，参比波长630nm，记录测定结果。5.结果处理：5.1. 计算实验结果：对各实验样品的各实验点O.D.值、预稀释倍数、样本梯度等数据采用计算机程序**********进行处理。附录（2）纯度RP-HPLC法测定纯度按照鉴别试验的RP-HPLC方法测定。该方法也用于测定peginterferonalfa-2a蛋白含量和未修饰干扰素alfa-2a（作为限度测定）含量的方法。另外，也评估peginterferonalfa-2a的纯度。设备和试验条件可以使用相当的仪器、试验条件和具有相当质量的试剂。HPLC系统：Waters2690“Alliance"分离器与脱气真空泵、柱加热器相连，自动加样器与样品温控装置相连，温度控制在5C。如果可以达到相当的结果也可以使用其他的温度。柱子：Phenomenex:JupiterC18，颗粒大小5um，孔径300埃，内径25cmx0.46cm。监测器：WatersPDA996（监测池长10mm）。实验室处理系统：WatersMenllennium32。流动相A：三氟乙酸/乙腈/水（0.2+30+70）流动相B：三氟乙酸/乙腈/水（0.2+80+20）梯度程序时间（min）A液%B液%077.023.04562.637.45548.551.56010.090.06510.090.06877.023.08077.023.0流速： 0.9ml/min柱压： 约75bar上样体积： 200ul波长： 210nm柱温： 常温。试剂乙腈， WaterR 用MilliQPlus处理或相当的设备三氟乙酸（TFA）， 苯甲醇 氯化钠， 乙酸钠（三水）， Polysorbate80 氢氧化钠， 冰乙酸 溶液流动相A：混合600份体积的乙腈，1400份体积的水R和4.0份体积的的TFA，抽气。流动相B混合1600份体积的乙腈，400份体积的水R和4.0份体积的的TFA，抽气。稀释液的配制称量10.0g苯甲醇，8.0gNaCl，2.62g乙酸钠含3个结晶水，50.0gPolysorbate80和44ul冰乙酸，至1L的容量瓶中装有大约900ml水R，用10%的乙酸或1N的NaOH调节pH至6.0±0.1，用蒸馏去离子水补充至1000ml。药品配制部门可以提供相当的缓冲液。参考溶液配制180ug/1ml的测试瓶的浓度。试验步骤首先做一个空梯度洗脱，参考品溶液A、参考品溶液B、然后样品。参考品溶液A和B的上样应有一定的间隔（如至少上样3次参考品溶液A和2次参考品溶液B，反之亦然）。测定后，应洗系统，如用50份体积的乙腈和50份体积的WaterR，洗脱约2小时。计算PEG--IFNalfa-2a的含量AS×WRBPEG--IFNalfa-2a的含量（ug/ml）=AR其中：AS为样品层析图谱中PEG-IFN的峰面积AR为参考品层析图谱中PEG-IFN的峰面积WRB为参考品溶液中PEG-IFNalfa-2a原液参考品的量（mg）附录（3）苯甲醇含量测定苯甲醇含量（mg/ml）应用反相层析测定。仪器和试验条件HPLC系统： Waters2694“Alliance"分离器与脱气真空泵相连前柱： 4×4.0mm内径，WatersSymmetryC18；5um固定相： 内径250mmx4.0mm、WatersSymmetryC18；5um，监测器： Waters2487。实验室处理系统： Menllennium32。流动相： 甲醇-0.1M乙酸钠溶液（60+40），pH5.6流速： 约0.7ml/min柱压： 约160bar上样体积： 10ul波长： 254nm温度： 室温试剂WaterR 用MilliQPlus处理或相当的设备甲醇 氯化钠， 乙酸钠（三水），Polysorbate80 氢氧化钠， 冰乙酸 溶液（按照需要的体积配制）。流动相（2L）溶解6.55g无水乙酸钠于800mlwaterR中，加入1200ml甲醇后，混合，用浓乙酸调节pH至6.0±0.1，抽气。Pegasys配制缓冲液（不含苯甲醇）溶解8.0gNaCl、2.62g乙酸钠（三水）、50mgPolysorbate80和44ul冰醋酸于装有900mlWaterR的1L容量瓶中，用1N的NaOH或10%的乙酸调节pH至6.0±0.1，用WaterR稀释至刻度。参考品溶液精确称量200±5mg的苯甲醇参考品，至20ml的容量瓶中，用Pegasys配制缓冲液（不含苯甲醇）稀释至刻度。样品溶液样品直接上样。计算AS×WR苯甲醇浓度（mg/ml）=AR其中：AS：为样品层析图谱中苯甲醇的峰面积；WR：参考品溶液中苯甲醇参考物质的重量（mg）AR：参考品溶液中苯甲醇的峰面积。聚乙二醇干扰素α-2a注射液（原液）质量标准PEGASYS(Peginterferonalfa-2a) JS20020003 1 外观应为无色澄清液体，且不得含有肉眼可见的不溶物。2 pH值按《中国生物制品规程》方法测定，pH值应为6.0±0.5。3.鉴别试验（RP-HPLC法）按照纯度（RP-HPLC方法）测定的方法（见附录3）进行，待检品的保留时间与层析图谱应与其参考品一致。4．鉴别试验（SDS法）采用非还原凝胶电泳方法进行（见附录2），待检品的凝胶电泳区带应与其参考品一致。5．纯度测定用RP-HPLC方法测定（见附录3），聚乙二醇干扰素单体的峰面积应不低于总吸收峰的97.0%；聚乙二醇干扰素寡聚体的峰面积应不高于总吸收峰的3.0%；其他微量体的总和应不高于总吸收峰的3.0%；未修饰的干扰素应低于0.5%（重量）。6.蛋白含量测定按《中国生物制品规程》蛋白含量测定微量法（Lowry）进行，待检品的蛋白含量应为1.0-2.0mg/ml。7．生物活性测定用WISH细胞-VSV病毒系统（见附录1）测定，聚乙二醇干扰素比活性应为6.0E5-1.4E6U/mg。8. 细菌内毒素含量按《中国药典》方法进行，聚乙二醇干扰素内毒素含量应不高于50.0EU/ml。【生产国别及生产厂】瑞士F.豪夫迈。拉罗氏公司【复核单位】中国药品生物制品检定所附录（1）微量病毒抑制（WISH／VSV）法1.原理：IFN效价测定采用微量病毒抑制（WISH／VSV）法。IFN可以保护人羊膜细胞（WISH）免受滤泡性口炎病毒（VSV）破坏。用结晶紫对存活WISH细胞染色，可以得到IFN对WISH细胞的保护效应曲线。按50％保护点的稀释倍数可以折算为待检样品中IFN的效价，测定结果需用IFN国家标准品校正。2.材料和试剂：（所用试剂均需分析纯或与指定产品相当）2.1. MEM培养液：GIBCO产品，按说明书配制，置于玻璃或塑料瓶中，4℃条件下保存。使用期限不得超过产品标示有效期。2.2. 牛血清：无支原体，杭州四季青生物工程研究所生产，中国药品生物制品检定所监制，2.3. 完全培养液：MEM培养液添加10％牛血清。2.4. 测定培养液：MEM培养液添加7％牛血清。2.5. 攻毒培养液：MEM培养液添加3％牛血清。2.6. 消化液：取0.2gEDTA、8gNaCl、0.2gKCl、1.152gNa2HPO4、0.2gKH2PO4用双蒸水配成1000ml的溶液，经121℃、15分钟高压灭菌。2.7. 染色液：取50mg结晶紫加入20ml乙醇溶解，用蒸馏水定容至100ml。2.8. 脱色液：50％乙醇，50％蒸馏水，0.1％乙酸（V／V）。2.9. 标准品：IFN效价测定用国家标准品，03／94（12000IU/支）。2.10. PBS缓冲液：取8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4、0.24gKH2PO4用蒸馏水配成1000ml的溶液，经121℃、15分钟高压灭菌。2.11. WISH细胞（人羊膜细胞）：WISH细胞在培养基中呈单层，贴壁生长，每周二次，1／4消化传代，于完全培养基中生长。2.12. VSV病毒（滤泡性口炎病毒）：-70℃保存3.设备和器材：按实验室和设备规范进行准备和检查。4.实验操作：（4.1.～4.7.各步骤应于无菌条件下进行）（第一天）4.1. 铺板：弃去WISH细胞培养瓶中的培养基，用PBS缓冲液涮洗二次后消化和收集细胞，用完全培养液配成2.5-3.5×105／ml的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，每孔100symbol109\f"Symbol"\s10.5ml。37℃，5％CO2条件下培养小时。4.2. 制备样品溶液：取1支标准品按说明书配成标准样品溶液。取规定数量的待检样品按说明书配成待检样品溶液。4.3. 制备样本溶液：根据情况用测定培养基将效价高于103IU／ml的的待检样品溶液稀释至约103IU／ml，每步稀释不得超过10倍。按以上预稀释程序制备的溶液称为样本溶液。效价低于103IU／ml的待检样品溶液和标准样品溶液作为样本溶液直接制备样本梯度。4.4. 制备样本梯度：于96孔细胞培养板中每孔加入150symbol109\f"Symbol"\s10.5ml测定培养液。在A6、A7各孔中每孔加入50symbol109\f"Symbol"\s10.5ml标准样本溶液，在A2、A3；A4、A5；A8、A9；A10、A11各孔中每孔加入50symbol109\f"Symbol"\s10.5ml各待检样本溶液，每个待检样品做2个复孔。自A行取50symbol109\f"Symbol"\s10.5ml至H行作4倍稀释，每孔留150symbol109\f"Symbol"\s10.5ml余液。4.5. 加样：取4.1.制备的细胞培养板，弃去上清。将4.4.制备的实验样本梯度移入该细胞培养板，每孔100symbol109\f"Symbol"\s10.5ml。其中，标准样本梯度和较高效价待检样品的待检样本梯度移取43～48梯度；较低效价待检样品的待检样本梯度移取41～46梯度。37℃，5％CO2条件下培养小时。（第二天）4.6. 制备病毒液：攻毒剂量为100TCID50，取保存的VSV病毒用攻毒培养液稀释至工作浓度。4.7. 攻毒：取4.5.制备的细胞培养板，弃去上清。加入病毒液，每孔100symbol109\f"Symbol"\s10.5ml。37℃，5％CO2条件下培养24～36小时（镜检标准样本的50％病变点在D或E行）。（第三天）4.8. 染色：轻轻吹打96孔细胞培养板各孔2～3次，弃去上清（于特制容器内，并做消毒处理）。每孔加入30symbol109\f"Symbol"\s10.5ml染色液，室温放置30分钟。4.9. 脱色：流水小心冲去染色液，吸干残留水分。每孔加入100symbol109\f"Symbol"\s10.5ml脱色液，室温放置3～5分钟。4.10. 比色：测定波长570nm，参比波长630nm，记录测定结果。5.结果处理：5.1. 计算实验结果：对各实验样品的各实验点O.D.值、预稀释倍数、样本梯度等数据采用计算机程序**********进行处理。附录（2）SDS凝胶电泳1.试剂：（所用试剂均需分析纯）超纯水：电阻率应不低于13MΩ·CM。A液(1.5mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸,Tris-Hcl,PH8.8)：取18.15g三羟甲基氨基甲烷加适量超纯水溶解，用浓盐酸调PH至8.8,加超纯水定容至100ml。B液（30%丙烯酰胺-0.8%N,N’-甲叉双丙烯酰胺）：取30g丙烯酰胺,0.8gN,N’-甲叉双丙烯酰胺加超纯水溶解至100ml,待其完全溶解后用滤纸过滤，避光保存。C液（1%十二烷基磺酸钠,SDS）：取1g十二烷基磺酸钠,加超纯水溶解至100ml,室温保存。D液（10%四甲基乙二胺）：取10ml四甲基乙二胺,加超纯水定容至100ml。E液（10%过硫酸铵）：取100mg过硫酸铵，加超纯水溶解至1ml。F液(0.5mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸,PH6.8)：取6.05g三羟甲基氨基甲烷加适量超纯水溶解，用浓盐酸调PH至6.8,加超纯水定容至100ml。电极缓冲液：取3g三羟甲基氨基甲烷,14.4g甘氨酸，1g十二烷基磺酸钠加适量超纯水溶解，用浓盐酸调PH至8.3，加超纯水定容至1000ml。样品缓冲液：取0.303g三羟甲基氨基甲烷,0.189ml盐酸,4ml甘油，2mg溴酚蓝，加超纯水溶解至10ml。（如用于非还原SDS,应再加0.8g十二烷基磺酸钠;用于还原SDS,则加0.8g十二烷基磺酸钠,2mlβ-巯基乙醇）1.10.蛋白质标准，样品的分子量应包括在使用的分子量标准范围之内。1.11.固定液：取250ml甲醇，60ml冰醋酸，加超纯水至500ml。1.12.漂洗液：取100ml乙醇,50ml冰醋酸，加超纯水至1000ml。1.13.辅染液：取10g重铬酸钾，2ml硝酸加适量超纯水溶解，定容至200ml。用前40倍稀释。1.14.银染液：取2.04g硝酸银加超纯水溶解至1000ml。1.15.显色液：取0.5ml甲醛，30g碳酸钠加适量超纯水溶解，定容至1000ml。1.16.终止液：取10ml冰醋酸加超纯水至1000ml。1.17.考马斯染色液：取1g考马斯亮蓝R-250,200ml甲醇，50ml冰醋酸，加蒸馏水溶解至500ml。1.18.考马斯脱色液：取400ml甲醇,100ml冰醋酸，加蒸馏水至1000ml。2.操作：制备分离胶：将配好的分离胶灌入电泳槽中（配方见下表），加水覆盖，室温下聚合（室温不同，聚合时间不同）。PAGE凝胶配方凝胶浓度(%)分离胶浓缩胶5%7.5%10%12.5%15%17.5%4.5%A液444444B液2.745.46.789.41.35C液1.61.61.61.61.61.60.9D液0.10.10.10.10.10.10.07E液0.10.10.10.10.10.10.07F液2.25H2O7.364.883.32.280.884.33制备浓缩胶：待分离胶聚合后，用滤纸吸去上面的水层，再灌入浓缩胶（配方见上表），插入样品梳，注意避免气泡出现。样品处理：将待测样品与样品液按3：1的比例混匀，100℃水浴3-5分钟。加样：待浓缩胶聚合后拔出样品梳，将电极缓冲液注满电泳槽前后槽，在加样孔中加入样品5ug。电泳：接通电源、冷凝水，以恒流10mA开始电泳，至样品进入分离胶后将电流调至20mA,直至电泳结束。染色方法1（银染法）固定：将电泳后的凝胶取下，浸入固定液中，过夜。漂洗：将凝胶自固定液中取出，用漂洗液漂洗三次，每次10分钟。辅染：将漂洗后的凝胶浸于辅染液中7-10分钟。清洗：将凝胶自辅染液中取出，用超纯水清洗三次，每次2分钟。银染：将清洗后的凝胶浸于银染液中，置较强日光或类似光源下照射30分钟，再于正常光线下放置20分钟。清洗：将凝胶自银染液中取出，用超纯水清洗两次，每次1分钟。显色：将清洗后的凝胶浸于显色液中，每隔2分钟换液，直至蛋白条带显色完全。终止：将凝胶浸于终止液中10分钟后，保存于超纯水中。染色方法2（考马斯亮兰法）2.6染色：将电泳后的凝胶取下，浸入染色液中，过夜。2.7脱色：将凝胶自染色液中取出，浸入脱色液中，直至凝胶底色近于无色为止，凝胶保存在超纯水中。计算非还原电泳凝胶与还原电泳凝胶经扫描进行纯度分析，还原电泳凝胶蛋白质标准经扫描作分子量标准曲线，计算样品的分子量。比较待检品与参考品的电泳迁移率。附录（3）聚乙二醇干扰素含量测定及鉴别试验（RP-HPLC）本HPLC方法试用于PEG-IFN的鉴别试验和纯度试验。仪器（可以使用相当的仪器和试验条件）HPLC系统：Waters2694分离器与脱气真空泵、柱加热器相连，自动加样器与样品温控装置相连，温度控制在15C。如果可以达到相当的结果也可以使用其他的温度。柱子：Phenomenex:Jupiter系列（C18）颗粒大小5μm，球形，孔径300埃，内径25cmx0.46cm.。柱子的进一步处理（适应）条件为至少用77.0%的流动相A和23.0%流动相B洗脱1小时。装配柱子，注射2次135μg/ml的聚乙二醇干扰素α-2a，当PEG-IFN的洗脱峰形为尖峰时表明柱子可以使用。注意：可以使用其他的处理条件。柱温： 25C（可以使用ISR柱子温控系统）监测器/setting Waters2487双波长吸收监测器210nm（10mm监测池长度）。测定周期 80分钟加样体积 200 μl。梯度流动相：A液和B液梯度流速（ml/min）时间（min）A液%B液%0.9077.023.00.94562.637.40.95548.551.5线性梯度0.96010.090.00.96510.090.00.96877.023.00.98077.023.0试剂（可以使用相当的试剂）乙腈，HPLC纯度，Fisher三氟乙酸（TFA），HPLC纯度，Fisher蒸馏或去离子水，HPLC纯度，MilliQ氯化钠乙酸钠氢氧化钠聚乙二醇干扰素α-2A参考品，贮存于约-70C。配制试剂（根据需要可以配制其他体积）流动相A：30%乙腈/0.2%的TFA混合600ml乙腈，1400ml蒸馏去离子水和4.0ml的TFA，用0.45或0.2μm的尼龙膜过滤。流动相B：80%乙腈/0.2%的TFA混合1600ml乙腈，400ml蒸馏去离子水和4.0ml的TFA，用0.45或0.2μm的尼龙膜过滤。柱子贮存溶液（30%乙腈）混合300ml乙腈，700ml蒸馏去离子水于1L的烧瓶中，过滤。每一个试验后，若保存柱子，用上述30%的乙腈液洗柱子30分钟。也可以使用其他适合的保存液。缓冲液稀释液（D2缓冲液）：20mM乙酸钠，50mM氯化钠称量2.72g乙酸钠含3个结晶水，和2.92gNaCl，至1L的烧杯中，用大约950ml水溶解，用10%的乙酸或0.25N的NaOH调节pH至6.0±0.1，移至1L的容量瓶中，用蒸馏去离子水补充至1000ml，混匀。过滤。柱子Primer、参考品、检测溶液（柱子性能测定）、限度测定溶液、样品溶液柱子Primer（使用时）可以使用任何适合的聚乙二醇干扰素α-2a原料药或成品，浓度在180μg/ml至0.4mg/ml间。参考品使用前完全融化参考品，然后轻轻旋转使之完全混合。用缓冲液稀释液配制聚乙二醇干扰素α-2a参考品，最终浓度为0.18mg/ml，配制足够的体积，在将参考品移至自动加样槽中时轻轻摇动混匀。成品上样量为100ul,原液纯度分析直接上样100ul。聚乙二醇干扰素α-2a注射液（成品）质量标准PEGASYS(Peginterferonalfa-2a) JS20020004 1 外观应为无色澄清液体，且不得含有肉眼可见的不溶物。2 pH值按《中国生物制品规程》方法测定，pH值应为6.0±0.5。3.鉴别试验（RP-HPLC法）按照纯度（RP-HPLC方法）测定的方法（见附录2）进行，待检品的保留时间与层析图谱应与其参考品一致。4．鉴别试验（苯甲醇）采用RP-HPLC方法进行（见附录3），待检品中苯甲醇的保留时间与层析图谱应与其参考品一致。5．纯度测定用RP-HPLC方法测定（见附录2），聚乙二醇干扰素单体的峰面积应不低于总吸收峰的95.0%；未修饰的干扰素应低于0.5%（重量）。6.蛋白含量测定按照纯度（RP-HPLC方法）测定的方法（见附录2）进行，聚乙二醇干扰素的蛋白含量应为其标示蛋白含量的85%-115%。7．生物活性测定用WISH细胞-VSV病毒系统（见附录1）测定，聚乙二醇干扰素比活性应为6.0E×105-1.4×106U/mg。每支聚乙二醇干扰素(135µg/ml)含干扰素生物活性1.35E5U/ml，其生物活性测定范围应为标示量的60%-140%。苯甲醇含量测定采用RP-HPLC方法进行（见附录3），每毫升聚乙二醇干扰素的苯甲醇含量应为9.0-11.0mg。9. 细菌内毒素含量按《中国药典》方法进行，聚乙二醇干扰素内毒素含量应不高于10.0EU/ml。10．无菌试验按《中国生物制品规程》方法测定，应合格。11.装量测定按《中国药典》方法进行，应合格。12.渗透压测定按《中国药典》方法进行，应为355-425mOsm/kg。13．异常毒性试验按《中国生物制品规程》方法测定，应合格。【规格】：1.35E5U/ml(135µg/ml)【生产国别及生产厂】瑞士F.豪夫迈。拉罗氏公司【复核单位】中国药品生物制品检定所附录（1）微量病毒抑制（WISH／VSV）法1.原理：IFN效价测定采用微量病毒抑制（WISH／VSV）法。IFN可以保护人羊膜细胞（WISH）免受滤泡性口炎病毒（VSV）破坏。用结晶紫对存活WISH细胞染色，可以得到IFN对WISH细胞的保护效应曲线。按50％保护点的稀释倍数可以折算为待检样品中IFN的效价，测定结果需用IFN国家标准品校正。2.材料和试剂：（所用试剂均需分析纯或与指定产品相当）2.1. MEM培养液：GIBCO产品，按说明书配制，置于玻璃或塑料瓶中，4℃条件下保存。使用期限不得超过产品标示有效期。2.2. 牛血清：无支原体，杭州四季青生物工程研究所生产，中国药品生物制品检定所监制，2.3. 完全培养液：MEM培养液添加10％牛血清。2.4. 测定培养液：MEM培养液添加7％牛血清。2.5. 攻毒培养液：MEM培养液添加3％牛血清。2.6. 消化液：取0.2gEDTA、8gNaCl、0.2gKCl、1.152gNa2HPO4、0.2gKH2PO4用双蒸水配成1000ml的溶液，经121℃、15分钟高压灭菌。2.7. 染色液：取50mg结晶紫加入20ml乙醇溶解，用蒸馏水定容至100ml。2.8. 脱色液：50％乙醇，50％蒸馏水，0.1％乙酸（V／V）。2.9. 标准品：IFN效价测定用国家标准品，03／94（12000IU/支）。2.10. PBS缓冲液：取8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4、0.24gKH2PO4用蒸馏水配成1000ml的溶液，经121℃、15分钟高压灭菌。2.11. WISH细胞（人羊膜细胞）：WISH细胞在培养基中呈单层，贴壁生长，每周二次，1／4消化传代，于完全培养基中生长。2.12. VSV病毒（滤泡性口炎病毒）：-70℃保存3.设备和器材：按实验室和设备规范进行准备和检查。4.实验操作：（4.1.～4.7.各步骤应于无菌条件下进行）（第一天）4.1. 铺板：弃去WISH细胞培养瓶中的培养基，用PBS缓冲液涮洗二次后消化和收集细胞，用完全培养液配成2.5-3.5×105／ml的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，每孔100symbol109\f"Symbol"\s10.5ml。37℃，5％CO2条件下培养小时。4.2. 制备样品溶液：取1支标准品按说明书配成标准样品溶液。取规定数量的待检样品按说明书配成待检样品溶液。4.3. 制备样本溶液：根据情况用测定培养基将效价高于103IU／ml的的待检样品溶液稀释至约103IU／ml，每步稀释不得超过10倍。按以上预稀释程序制备的溶液称为样本溶液。效价低于103IU／ml的待检样品溶液和标准样品溶液作为样本溶液直接制备样本梯度。4.4. 制备样本梯度：于96孔细胞培养板中每孔加入150symbol109\f"Symbol"\s10.5ml测定培养液。在A6、A7各孔中每孔加入50symbol109\f"Symbol"\s10.5ml标准样本溶液，在A2、A3；A4、A5；A8、A9；A10、A11各孔中每孔加入50symbol109\f"Symbol"\s10.5ml各待检样本溶液，每个待检样品做2个复孔。自A行取50symbol109\f"Symbol"\s10.5ml至H行作4倍稀释，每孔留150symbol109\f"Symbol"\s10.5ml余液。4.5. 加样：取4.1.制备的细胞培养板，弃去上清。将4.4.制备的实验样本梯度移入该细胞培养板，每孔100symbol109\f"Symbol"\s10.5ml。其中，标准样本梯度和较高效价待检样品的待检样本梯度移取43～48梯度；较低效价待检样品的待检样本梯度移取41～46梯度。37℃，5％CO2条件下培养小时。（第二天）4.6. 制备病毒液：攻毒剂量为100TCID50，取保存的VSV病毒用攻毒培养液稀释至工作浓度。4.7. 攻毒：取4.5.制备的细胞培养板，弃去上清。加入病毒液，每孔100symbol109\f"Symbol"\s10.5ml。37℃，5％CO2条件下培养24～36小时（镜检标准样本的50％病变点在D或E行）。（第三天）4.8. 染色：轻轻吹打96孔细胞培养板各孔2～3次，弃去上清（于特制容器内，并做消毒处理）。每孔加入30symbol109\f"Symbol"\s10.5ml染色液，室温放置30分钟。4.9. 脱色：流水小心冲去染色液，吸干残留水分。每孔加入100symbol109\f"Symbol"\s10.5ml脱色液，室温放置3～5分钟。4.10. 比色：测定波长570nm，参比波长630nm，记录测定结果。5.结果处理：5.1. 计算实验结果：对各实验样品的各实验点O.D.值、预稀释倍数、样本梯度等数据采用计算机程序**********进行处理。

附录（2）纯度RP-HPLC法测定纯度按照鉴别试验的RP-HPLC方法测定。该方法也用于测定peginterferonalfa-2a蛋白含量和未修饰干扰素alfa-2a（作为限度测定）含量的方法。另外，也评估peginterferonalfa-2a的纯度。设备和试验条件可以使用相当的仪器、试验条件和具有相当质量的试剂。HPLC系统：Waters2690“Alliance"分离器与脱气真空泵、柱加热器相连，自动加样器与样品温控装置相连，温度控制在5C。如果可以达到相当的结果也可以使用其他的温度。柱子：Phenomenex:JupiterC18，颗粒大小5um，孔径300埃，内径25cmx0.46cm。监测器：WatersPDA996（监测池长10mm）。实验室处理系统：WatersMenllennium32。流动相A：三氟乙酸/乙腈/水（0.2+30+70）流动相B：三氟乙酸/乙腈/水（0.2+80+20）梯度程序时间（min）A液%B液%077.023.04562.637.45548.551.56010.090.06510.090.06877.023.08077.023.0流速： 0.9ml/min柱压： 约75bar上样体积： 200ul波长： 210nm柱温： 常温