Zebularine对绵羊卵丘细胞及核移植胚胎发育的多维度解析与机制探究

Zebularine对绵羊卵丘细胞及核移植胚胎发育的多维度解析与机制探究一、引言1.1研究背景与意义体细胞核移植（SomaticCellNuclearTransfer，SCNT）技术是指将供体细胞核移入去核的卵母细胞中，使其重组并发育成新个体的技术。自1996年克隆羊“多莉”诞生以来，体细胞核移植技术取得了巨大的突破，在生物学、医学等多个研究领域展现出了极为重要的意义。在农业领域，该技术可用于快速繁殖优良种畜，加速动物遗传育种进程，提高畜牧业生产效率；在生物医学领域，它为疾病模型的构建、药物研发以及再生医学的发展提供了新的途径和方法，有望为攻克一些疑难病症带来新的希望；在保护濒危物种方面，体细胞核移植技术也被视为一种潜在的有效手段，为珍稀物种的延续提供了可能。然而，尽管体细胞核移植技术前景广阔，但目前其效率仍然很低。以绵羊为例，通过SCNT技术生产的新生儿比率较低，这严重限制了该技术的广泛应用和进一步发展。研究人员普遍认为，核移植效率低主要是由于供体细胞核在卵母细胞中的重编程不完全造成的。在正常受精过程中，精子和卵子结合后，基因组会经历一系列复杂而有序的表观遗传重编程事件，从而使胚胎能够正常发育。而在体细胞核移植过程中，供体细胞是已经分化的体细胞，其基因组带有体细胞特有的表观遗传标记。当供体细胞的细胞核被移入去核卵母细胞后，这些表观遗传标记需要被重新编程，以恢复到胚胎发育所需的全能性状态。但实际上，供体细胞的重编程过程往往不完全，存在许多异常情况，其中DNA甲基化重编程异常是主要原因之一。DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰方式，它在基因表达调控、胚胎发育、细胞分化等过程中发挥着关键作用。在正常胚胎发育过程中，DNA甲基化模式会经历动态的变化，从配子阶段到着床前胚胎发育阶段，DNA甲基化水平会发生一系列的重塑，以确保胚胎发育相关基因的正确表达。而在体细胞核移植胚胎中，DNA甲基化重编程异常表现为异常的高甲基化或低甲基化状态，这些异常的甲基化模式会导致许多与胚胎发育相关的基因表达异常，进而影响胚胎的正常发育，导致胚胎发育阻滞、着床失败或出生后出现各种发育异常等问题。Zebularine作为一种DNA甲基转移酶抑制剂，能够特异性地抑制DNA甲基转移酶的活性，从而降低DNA的甲基化水平。在动物核移植领域，研究Zebularine对绵羊卵丘细胞及其核移植胚胎发育效果的影响具有重要的理论和实践意义。从理论上来说，深入探究Zebularine对绵羊卵丘细胞生物学特性、核移植重构胚发育及胚胎甲基化水平的影响，有助于进一步揭示DNA甲基化在体细胞核移植胚胎发育过程中的调控机制，丰富和完善表观遗传学理论体系。从实践角度来看，如果能够找到合适的Zebularine处理条件，既不影响体细胞生物学特性，又可降低供体细胞细胞核的甲基化状态，那么将为提高体细胞核移植效率提供一种有效的途径，推动体细胞核移植技术在农业、医学等领域的广泛应用，具有重要的实际应用价值。1.2国内外研究现状在国外，关于Zebularine在动物核移植领域的研究已经取得了一些成果。有研究将Zebularine应用于小鼠核移植胚胎的发育研究中，发现适当浓度的Zebularine处理能够改变胚胎的DNA甲基化水平，提高胚胎的发育率和着床率。还有研究在牛的体细胞核移植中，探讨了Zebularine对供体细胞和核移植胚胎的影响，结果表明Zebularine处理可以改善供体细胞的表观遗传状态，进而提高核移植胚胎的质量和发育潜力。在国内，也有不少科研团队关注到Zebularine在体细胞核移植中的作用。一些研究以绵羊为实验对象，探究了Zebularine对绵羊卵丘细胞周期分布和核移植胚胎发育能力的影响。结果显示，一定浓度的Zebularine处理绵羊卵丘细胞后，处于G0/G1期细胞比例上升，S期细胞比例下降，且核移植胚胎的桑椹胚率和囊胚率显著提高。然而，目前的研究仍然存在一些不足。一方面，对于Zebularine处理供体细胞的最佳浓度和处理时间，不同的研究结果之间存在差异，尚未形成统一的标准。这可能是由于不同实验中所使用的动物品种、细胞类型、培养条件等因素的不同所导致的。另一方面，虽然已经明确Zebularine能够影响核移植胚胎的发育，但对于其具体的作用机制，尤其是在基因表达调控网络和信号通路方面的作用，还缺乏深入系统的研究。此外，Zebularine处理对核移植胚胎的长期影响，如对出生后动物的生长、繁殖性能以及健康状况等方面的影响，也有待进一步的探究。1.3研究目的与内容本研究旨在深入探究Zebularine对绵羊卵丘细胞生物学特性及其核移植胚胎发育效果的影响，为提高绵羊体细胞核移植效率提供理论依据和技术支持。具体研究内容包括：研究不同浓度的Zebularine处理对绵羊卵丘细胞存活率、染色体倍性、细胞周期的影响，确定Zebularine处理绵羊卵丘细胞的适宜浓度范围，分析Zebularine对卵丘细胞生物学特性的作用机制。探讨Zebularine处理绵羊卵丘细胞后，对其核移植胚胎发育能力的影响，包括核移植胚胎的卵裂率、桑椹胚率、囊胚率等指标，评估Zebularine在提高绵羊核移植胚胎发育效率方面的作用。检测Zebularine处理对绵羊卵丘细胞核移植胚胎DNA甲基化水平和Dnmtl基因表达水平的影响，从表观遗传学角度深入研究Zebularine影响核移植胚胎发育的分子机制，揭示DNA甲基化在Zebularine调控核移植胚胎发育过程中的作用。二、Zebularine与绵羊体细胞核移植技术概述2.1Zebularine的特性与作用机制Zebularine化学名称为4-脱氧尿苷，分子式为C_9H_{12}N_2O_5，分子量为228.202，是一种白色至类白色结晶性粉末，在DMSO、水等溶剂中具有一定的溶解性。其化学结构与胞嘧啶类似，这种结构相似性是其发挥生物学作用的基础。作为一种DNA甲基转移酶抑制剂，Zebularine的作用机制主要是通过与DNA甲基转移酶（DNMTs）紧密结合，抑制该酶的活性，从而阻止DNA甲基化过程。在正常的DNA甲基化过程中，DNA甲基转移酶以S-腺苷甲硫氨酸（SAM）为甲基供体，将甲基基团转移到DNA分子中特定的胞嘧啶残基上，形成5-甲基胞嘧啶，从而实现对基因表达的调控。而Zebularine能够与DNA甲基转移酶形成稳定的复合物，阻碍其与DNA底物的正常结合，进而抑制甲基基团的转移，减少DNA分子上的甲基化修饰位点，降低DNA的整体甲基化水平。这种抑制作用具有一定的特异性和剂量依赖性，不同浓度的Zebularine对DNA甲基转移酶的抑制程度有所不同，从而对DNA甲基化水平产生不同程度的影响。此外，Zebularine还可能通过其他间接途径影响DNA甲基化相关的生物学过程。例如，它可能影响细胞内的信号转导通路，间接调节DNA甲基转移酶的表达或活性；或者影响与DNA甲基化相关的蛋白质之间的相互作用，进而干扰DNA甲基化的正常调控机制。但这些间接作用机制目前还需要进一步深入研究和验证。2.2绵羊体细胞核移植技术流程绵羊体细胞核移植技术是一项复杂而精细的生物技术，其主要流程包括以下几个关键步骤：获取卵母细胞：通常从屠宰场获取绵羊的卵巢，将卵巢置于含有抗生素的生理盐水中，在短时间内运回实验室。在实验室中，使用注射器或真空泵等工具，从卵巢表面直径2-8mm的卵泡中抽取卵泡液，将卵泡液收集到培养皿中，在体视显微镜下挑选出形态正常、卵丘细胞包裹紧密的卵丘-卵母细胞复合体（COCs）。这些COCs将用于后续的卵母细胞体外成熟培养。将挑选出的COCs转移到含有成熟培养液的培养微滴中，成熟培养液一般含有基础培养液（如TCM199）、血清、激素（如促卵泡素FSH、促黄体素LH等）、生长因子（如表皮生长因子EGF）以及抗生素等成分。在38.5℃、5%CO₂、饱和湿度的培养箱中培养18-24h，使卵母细胞完成减数分裂，达到成熟状态。成熟的卵母细胞处于第二次减数分裂中期（MⅡ期），此时可以用于核移植操作。准备供体细胞：选择绵羊的卵丘细胞作为供体细胞。从卵巢表面获取的COCs经过透明质酸酶处理，去除周围的卵丘细胞，然后将卵丘细胞接种到细胞培养瓶中，使用含10%-20%胎牛血清的DMEM/F12培养液进行培养。当细胞生长至对数生长期时，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化细胞，制成单细胞悬液，调整细胞密度后进行传代培养。为了使供体细胞处于适宜的细胞周期阶段，可采用血清饥饿或接触抑制等方法对卵丘细胞进行细胞周期同步化处理，使更多的细胞处于G0/G1期。此外，本研究还将使用不同浓度的Zebularine处理卵丘细胞，研究其对卵丘细胞生物学特性及后续核移植胚胎发育的影响。构建重构胚：采用显微操作技术去除成熟卵母细胞的细胞核。在显微镜下，使用去核针吸取卵母细胞的第一极体及附近的部分细胞质，从而将细胞核去除。将经过处理的供体细胞（如Zebularine处理后的处于G0/G1期的卵丘细胞）通过显微注射的方法注入到去核的卵母细胞的卵周隙中，形成重构胚。重构胚构建完成后，需要进行激活处理，使其启动胚胎发育过程。常用的激活方法包括电激活和化学激活。电激活是将重构胚置于特定的电融合仪中，施加适当的直流脉冲电场，使供体细胞与卵母细胞的细胞膜发生融合，同时激活卵母细胞；化学激活则是使用离子霉素、6-二甲基氨基嘌呤（6-DMAP）等化学试剂处理重构胚，引发卵母细胞的激活反应。胚胎培养与移植：将激活后的重构胚转移到胚胎培养液中进行体外培养。胚胎培养液一般含有基础培养液（如SOF、CR1aa等）、血清、氨基酸、维生素、抗氧化剂等成分。在38.5℃、5%CO₂、5%O₂、饱和湿度的培养箱中培养，定期观察胚胎的发育情况，记录卵裂率、桑椹胚率、囊胚率等发育指标。当胚胎发育到适宜阶段（如桑椹胚或囊胚期）时，选择合适的受体母羊进行胚胎移植。受体母羊需要经过同期发情处理，使其生殖生理状态与供体胚胎的发育阶段相匹配。在超声引导下，将胚胎移植到受体母羊的子宫角内，继续妊娠发育，直至分娩产出克隆羔羊。2.3绵羊卵丘细胞在核移植中的优势在绵羊体细胞核移植技术中，卵丘细胞作为供体细胞具有多方面的显著优势：易获取性：在获取绵羊卵母细胞的过程中，卵丘细胞紧密包裹在卵母细胞周围，只需通过简单的透明质酸酶处理，即可将卵丘细胞从卵丘-卵母细胞复合体中分离出来，操作相对简便，能够大量获得，为体细胞核移植实验提供充足的供体细胞来源。分化程度低：卵丘细胞是一种体细胞，但相对于其他一些体细胞（如成纤维细胞等），其分化程度较低，具有一定的可塑性。这种较低的分化程度使得卵丘细胞在核移植过程中，其细胞核更容易被卵母细胞中的重编程因子所作用，恢复到具有全能性或多能性的状态，从而更有利于支持重构胚的早期发育，提高核移植胚胎的发育潜力。对重构胚发育支持性好：卵丘细胞与卵母细胞在体内存在着紧密的联系和相互作用，它们之间通过缝隙连接等方式进行物质和信息的交流。这种密切的关系使得卵丘细胞对卵母细胞的发育环境和生理需求有着很好的适应性和理解性。当卵丘细胞的细胞核被移植到去核卵母细胞中后，卵丘细胞核能够更好地与卵母细胞的细胞质相互协调，利用卵母细胞细胞质中的各种物质和信号分子，为重构胚的发育提供良好的支持，促进重构胚顺利完成从受精卵到早期胚胎的发育过程。遗传稳定性相对较高：在体外培养过程中，卵丘细胞的遗传稳定性相对较好，不容易发生染色体变异等遗传异常现象。这使得以卵丘细胞为供体细胞构建的核移植胚胎，在发育过程中能够保持相对稳定的遗传信息传递，减少因遗传物质异常而导致的胚胎发育阻滞或异常，提高核移植胚胎的质量和发育成功率。三、Zebularine对绵羊卵丘细胞生物学特性的影响3.1实验设计与方法3.1.1实验动物与材料准备本实验选用健康成年的小尾寒羊作为实验动物。小尾寒羊具有繁殖力强、生长发育快、适应性能好等特点，在绵羊相关研究中被广泛应用。从当地正规屠宰场获取刚屠宰的小尾寒羊卵巢，迅速将其置于含有青霉素（100U/mL）和链霉素（100U/mL）的37℃生理盐水中，在1-2小时内运回实验室，用于卵丘细胞的采集。获取卵丘细胞时，先将卵巢用预热的含双抗的生理盐水冲洗3-5次，以去除卵巢表面的杂质和血迹。然后，在体视显微镜下，用10mL注射器连接21G针头，从卵巢表面直径2-6mm的卵泡中抽取卵泡液，将卵泡液收集到无菌离心管中。向离心管中加入等量的Hank's液进行稀释，以降低卵泡液的黏稠度，便于后续操作。将稀释后的卵泡液以1000r/min的转速离心5分钟，使卵丘-卵母细胞复合体（COCs）沉淀下来。弃去上清液，用含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养液重悬沉淀，轻轻吹打均匀后，将细胞悬液转移至35mm细胞培养皿中。在体视显微镜下挑选出卵丘细胞包裹紧密、形态完整、细胞质均匀的COCs，这些COCs将用于后续的卵丘细胞分离和培养。实验所需的主要试剂包括：Zebularine（Sigma公司），用DMSO溶解配制成1mmol/L的储存液，-20℃保存备用；DMEM/F12培养液（Gibco公司）；胎牛血清（FBS，Gibco公司）；0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液（Gibco公司）；青霉素、链霉素（Solarbio公司）；MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐，Sigma公司）；DMSO（二甲基亚砜，Sigma公司）；秋水仙素（Sigma公司）；低渗液（0.075mol/LKCl溶液）；固定液（甲醇：冰醋酸=3:1，现用现配）；碘化丙啶（PI，Sigma公司）；RNaseA（Sigma公司）等。主要仪器设备有：体视显微镜（Olympus公司）；CO₂培养箱（ThermoFisherScientific公司）；超净工作台（苏州净化设备有限公司）；离心机（Eppendorf公司）；酶标仪（Bio-Rad公司）；流式细胞仪（BD公司）；恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）；水浴锅（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）等。3.1.2Zebularine处理卵丘细胞的浓度与时间设置将挑选好的COCs用0.1%透明质酸酶溶液处理3-5分钟，期间轻轻吹打，使卵丘细胞从卵母细胞周围分离下来。然后，用含10%FBS的DMEM/F12培养液终止消化，将细胞悬液以1000r/min的转速离心5分钟，弃去上清液，用新鲜培养液重悬细胞，将细胞接种到24孔细胞培养板中，每孔接种密度为5×10⁴个细胞，置于37℃、5%CO₂、饱和湿度的培养箱中培养。待细胞贴壁生长至70%-80%汇合度时，进行Zebularine处理。设置0（对照组，仅加入等量的DMSO）、2.5、5、10nmol/L四个Zebularine浓度梯度，每个浓度设置3个重复孔。用无血清的DMEM/F12培养液将Zebularine储存液稀释成所需浓度，加入到培养孔中，使培养液中Zebularine的终浓度分别达到设定值，对照组加入等体积的无血清DMEM/F12培养液。将培养板放回培养箱中继续培养12小时。处理结束后，收集细胞用于各项检测指标的分析。3.1.3检测指标与实验方法细胞存活率检测：采用MTT法检测不同浓度Zebularine处理后绵羊卵丘细胞的存活率。在Zebularine处理12小时结束前4小时，向每孔中加入20μLMTT溶液（5mg/mL），继续培养4小时。此时，活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶可将MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中。4小时后，小心吸去上清液，每孔加入150μLDMSO，在摇床上低速振荡10-15分钟，使甲瓒充分溶解。然后，用酶标仪在490nm波长处测定各孔的吸光度（OD值）。细胞存活率计算公式为：细胞存活率（%）=（实验组OD值/对照组OD值）×100%。染色体倍性分析：收集Zebularine处理12小时后的卵丘细胞，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化，制成单细胞悬液。将细胞悬液转移至离心管中，以1000r/min的转速离心5分钟，弃去上清液。向细胞沉淀中加入0.075mol/LKCl低渗液，37℃水浴处理30分钟，使细胞膨胀，染色体分散。低渗处理结束后，加入3mL固定液（甲醇：冰醋酸=3:1）进行预固定，轻轻吹打均匀，以1000r/min的转速离心5分钟，弃去上清液。再加入适量固定液，固定30分钟，重复固定2-3次。最后，将细胞悬液滴在预冷的载玻片上，自然干燥。用Giemsa染液染色15-20分钟，自来水冲洗，晾干。在显微镜下观察染色体形态，统计至少100个细胞的染色体数目，分析染色体倍性情况。细胞周期检测：采用流式细胞术检测Zebularine处理后绵羊卵丘细胞的周期分布。收集处理后的卵丘细胞，用PBS洗涤2次，以1000r/min的转速离心5分钟，弃去上清液。向细胞沉淀中加入70%预冷乙醇，4℃固定过夜。固定后的细胞用PBS洗涤2次，加入含有50μg/mLPI和100μg/mLRNaseA的染色缓冲液，37℃避光孵育30分钟，使PI与DNA充分结合。最后，用流式细胞仪检测细胞周期，通过分析细胞DNA含量的分布情况，确定处于G0/G1期、S期、G2/M期的细胞比例。3.2实验结果与分析3.2.1Zebularine对绵羊卵丘细胞存活率的影响不同浓度Zebularine处理绵羊卵丘细胞12小时后，其存活率检测结果如表1所示。对照组（0nmol/LZebularine）的细胞存活率为（95.23±3.15）%。随着Zebularine浓度的增加，细胞存活率呈现逐渐下降的趋势。当Zebularine浓度为2.5nmol/L时，细胞存活率为（91.45±2.86）%，与对照组相比，差异不显著（P>0.05）；当Zebularine浓度升高到5nmol/L时，细胞存活率降至（85.67±3.52）%，与对照组相比，差异显著（P<0.05）；当Zebularine浓度达到10nmol/L时，细胞存活率进一步降低至（72.34±4.21）%，与对照组及其他处理组相比，差异均极显著（P<0.01）。表1：不同浓度Zebularine处理对绵羊卵丘细胞存活率的影响（%，\overline{X}±SD，n=3）Zebularine浓度（nmol/L）细胞存活率095.23±3.152.591.45±2.86585.67±3.52*1072.34±4.21**注：*表示与对照组相比，P<0.05；**表示与对照组相比，P<0.01上述结果表明，低浓度（2.5nmol/L）的Zebularine对绵羊卵丘细胞存活率影响较小，而高浓度（5nmol/L和10nmol/L）的Zebularine会显著降低细胞存活率，且浓度越高，对细胞存活的抑制作用越强。这可能是由于高浓度的Zebularine对细胞产生了较强的毒性作用，影响了细胞的正常代谢和生理功能，导致细胞死亡增加。3.2.2Zebularine对绵羊卵丘细胞染色体倍性的影响通过染色体分析技术，对不同浓度Zebularine处理12小时后的绵羊卵丘细胞染色体倍性进行了检测，结果如表2所示。在对照组中，观察的100个卵丘细胞中，染色体数目正常（2n=54）的细胞有98个，占比98%，染色体数目异常的细胞有2个，占比2%。在2.5nmol/LZebularine处理组中，观察的100个细胞中，97个细胞染色体数目正常，占比97%，3个细胞染色体数目异常，占比3%；5nmol/L处理组中，96个细胞染色体数目正常，占比96%，4个细胞染色体数目异常，占比4%；10nmol/L处理组中，95个细胞染色体数目正常，占比95%，5个细胞染色体数目异常，占比5%。经统计学分析，各处理组与对照组之间染色体倍性异常细胞比例差异均不显著（P>0.05）。表2：不同浓度Zebularine处理对绵羊卵丘细胞染色体倍性的影响Zebularine浓度（nmol/L）观察细胞数染色体数目正常细胞数染色体数目正常细胞比例（%）染色体数目异常细胞数染色体数目异常细胞比例（%）01009898222.5100979733510096964410100959555这说明在本实验设置的Zebularine浓度范围内（0-10nmol/L），处理12小时后，虽然随着Zebularine浓度的增加，染色体倍性异常细胞的比例有一定程度的上升，但这种变化并不显著，即Zebularine处理对绵羊卵丘细胞染色体倍性的影响较小，未导致明显的染色体数目异常。3.2.3Zebularine对绵羊卵丘细胞周期的影响利用流式细胞术对不同浓度Zebularine处理后的绵羊卵丘细胞周期进行检测，结果如图1和表3所示。对照组中，处于G0/G1期的细胞比例为（68.56±2.13）%，S期细胞比例为（22.45±1.87）%，G2/M期细胞比例为（9.01±1.25）%。在2.5nmol/LZebularine处理组中，G0/G1期细胞比例为（70.23±2.35）%，S期细胞比例为（20.89±2.01）%，G2/M期细胞比例为（8.88±1.32）%；5nmol/L处理组中，G0/G1期细胞比例上升至（73.45±2.56）%，S期细胞比例下降至（18.56±2.23）%，G2/M期细胞比例为（8.01±1.45）%；10nmol/L处理组中，G0/G1期细胞比例为（75.67±2.78）%，S期细胞比例为（16.78±2.45）%，G2/M期细胞比例为（7.55±1.56）%。经统计学分析，与对照组相比，5nmol/L和10nmol/LZebularine处理组的G0/G1期细胞比例显著升高（P<0.05），S期细胞比例显著降低（P<0.05），而G2/M期细胞比例在各处理组之间差异均不显著（P>0.05）。表3：不同浓度Zebularine处理对绵羊卵丘细胞周期的影响（%，\overline{X}±SD，n=3）Zebularine浓度（nmol/L）G0/G1期S期G2/M期068.56±2.1322.45±1.879.01±1.252.570.23±2.3520.89±2.018.88±1.32573.45±2.56*18.56±2.23*8.01±1.451075.67±2.78*16.78±2.45*7.55±1.56注：*表示与对照组相比，P<0.05从图1和表3的数据可以看出，随着Zebularine浓度的增加，处于G0/G1期的绵羊卵丘细胞比例逐渐升高，而处于S期的细胞比例逐渐降低。这表明Zebularine处理能够使绵羊卵丘细胞周期阻滞在G0/G1期，抑制细胞从G0/G1期向S期的转化，从而影响细胞的增殖能力。3.3讨论本实验研究了不同浓度Zebularine对绵羊卵丘细胞存活率、染色体倍性和细胞周期的影响。结果表明，Zebularine对绵羊卵丘细胞的生物学特性具有一定的影响，且这种影响与Zebularine的浓度密切相关。在细胞存活率方面，低浓度（2.5nmol/L）的Zebularine对绵羊卵丘细胞存活率影响不显著，而高浓度（5nmol/L和10nmol/L）的Zebularine会显著降低细胞存活率。这可能是因为低浓度的Zebularine在发挥其抑制DNA甲基转移酶活性的同时，对细胞的其他正常生理功能影响较小，细胞能够通过自身的调节机制来维持一定的存活水平。而高浓度的Zebularine可能会对细胞产生多方面的毒性作用，例如干扰细胞内的代谢途径、影响细胞膜的完整性、诱导细胞凋亡等，从而导致细胞存活率明显下降。对于染色体倍性，在本实验设置的Zebularine浓度范围内，处理12小时后未观察到显著的染色体数目异常。这说明在该实验条件下，Zebularine对绵羊卵丘细胞染色体的稳定性影响较小，细胞能够保持相对正常的染色体组成。然而，虽然目前未发现明显的染色体倍性变化，但不能完全排除高浓度或长时间Zebularine处理可能对染色体结构或其他遗传物质产生潜在影响的可能性，这还需要进一步深入研究。在细胞周期方面，随着Zebularine浓度的增加，处于G0/G1期的绵羊卵丘细胞比例显著升高，S期细胞比例显著降低，表明Zebularine能够使细胞周期阻滞在G0/G1期。细胞周期的调控是一个复杂的过程，涉及多种细胞周期调控蛋白和信号通路的相互作用。Zebularine作为一种DNA甲基转移酶抑制剂，可能通过影响某些与细胞周期调控相关基因的甲基化状态，进而改变这些基因的表达水平，从而影响细胞周期进程。例如，一些研究表明，DNA甲基化状态的改变可能会影响细胞周期蛋白（Cyclin）、细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）以及相关的抑制因子（CKI）的表达，从而调控细胞从G0/G1期向S期的转换。在本实验中，Zebularine处理可能使与G0/G1期阻滞相关的基因去甲基化，促进其表达，或者使与S期启动相关的基因高甲基化，抑制其表达，最终导致细胞周期阻滞在G0/G1期。这些实验结果对于后续的核移植实验具有重要的意义。在体细胞核移植中，供体细胞的生物学特性对核移植胚胎的发育至关重要。适宜的供体细胞应具有良好的存活能力、稳定的遗传物质和合适的细胞周期状态。本实验结果表明，低浓度（2.5nmol/L）的Zebularine处理对绵羊卵丘细胞存活率影响较小，且不影响染色体倍性，同时能够使细胞周期阻滞在G0/G1期，这可能更有利于供体细胞与去核卵母细胞的融合以及后续的重编程过程，从而提高核四、Zebularine对绵羊核移植胚胎发育的影响4.1实验设计与方法4.1.1核移植胚胎的构建与培养本实验选用经过不同浓度Zebularine（0、2.5、5、10nmol/L）处理12小时后的绵羊卵丘细胞作为核供体。从屠宰场获取绵羊卵巢，将其置于37℃含有双抗（青霉素100U/mL和链霉素100U/mL）的生理盐水中，在1-2小时内迅速运回实验室。使用10mL注射器连接21G针头，从卵巢表面直径2-6mm的卵泡中抽取卵泡液，收集到无菌离心管后，加入等量Hank's液稀释，以1000r/min的转速离心5分钟，使卵丘-卵母细胞复合体（COCs）沉淀。弃去上清液，用含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养液重悬沉淀，转移至35mm细胞培养皿中，在体视显微镜下挑选出卵丘细胞包裹紧密、形态完整、细胞质均匀的COCs。将挑选好的COCs用0.1%透明质酸酶溶液处理3-5分钟，使卵丘细胞从卵母细胞周围分离，再用含10%FBS的DMEM/F12培养液终止消化，1000r/min离心5分钟，弃上清，用新鲜培养液重悬细胞，接种到24孔细胞培养板中，每孔接种密度为5×10⁴个细胞，在37℃、5%CO₂、饱和湿度的培养箱中培养。待细胞贴壁生长至70%-80%汇合度时，进行Zebularine处理。处理结束后，收集细胞用于核移植。与此同时，将挑选出的COCs转移到含有成熟培养液（TCM199+10%FBS+10IU/mLFSH+10IU/mLLH+1μg/mLEGF+50μg/mL青霉素+50μg/mL链霉素）的培养微滴中，每个微滴体积为50μL，每滴放置10-15个COCs，在38.5℃、5%CO₂、饱和湿度的培养箱中培养22-24小时，使卵母细胞成熟。成熟的卵母细胞处于第二次减数分裂中期（MⅡ期），在显微镜下采用显微操作技术去核。用去核针吸取卵母细胞的第一极体及附近的部分细胞质，以去除细胞核。将经过不同浓度Zebularine处理后的卵丘细胞通过显微注射的方法注入到去核的卵母细胞的卵周隙中，形成重构胚。重构胚构建完成后，将其置于融合液（0.3mol/L甘露醇+0.1mmol/LMgSO₄+0.05mmol/LCaCl₂+0.01%BSA）中，在电融合仪中施加直流脉冲（1.2kV/cm，持续时间30μs，脉冲次数1次），使供体细胞与卵母细胞融合，形成重构胚。融合后的重构胚用胚胎培养液（SOF+10%FBS+1%非必需氨基酸+1%谷氨酰胺+50μg/mL青霉素+50μg/mL链霉素）洗涤3次，然后转移到含有胚胎培养液的四孔板中，每孔加入500μL培养液，每孔放置10-15个重构胚，在38.5℃、5%CO₂、5%O₂、饱和湿度的培养箱中培养。4.1.2胚胎发育指标的检测在胚胎培养过程中，对胚胎发育指标进行检测。在重构胚培养24小时后，在显微镜下观察并记录胚胎的卵裂情况，统计卵裂的胚胎数，计算卵裂率，卵裂率=（卵裂胚胎数/重构胚总数）×100%。在培养到第5-6天时，统计发育到桑椹胚阶段的胚胎数，计算桑椹胚率，桑椹胚率=（桑椹胚数/卵裂胚胎数）×100%。在培养到第7-8天时，统计发育到囊胚阶段的胚胎数，计算囊胚率，囊胚率=（囊胚数/卵裂胚胎数）×100%。为确保数据的准确性和可靠性，每个处理组设置3个重复，每个重复至少观察50个重构胚。4.2实验结果与分析4.2.1Zebularine处理组与对照组胚胎发育指标对比不同浓度Zebularine处理组和对照组的绵羊核移植胚胎发育指标数据如表4所示。对照组（0nmol/LZebularine处理）的卵裂率为（75.67±3.21）%，桑椹胚率为（35.67±2.89）%，囊胚率为（18.56±1.56）%。在2.5nmol/LZebularine处理组中，卵裂率为（76.89±3.56）%，与对照组相比，差异不显著（P>0.05）；桑椹胚率为（38.56±3.01）%，略高于对照组，但差异不显著（P>0.05）；囊胚率为（20.12±1.87）%，高于对照组，差异不显著（P>0.05）。5nmol/LZebularine处理组的卵裂率为（77.56±3.33）%，与对照组相比无显著差异（P>0.05）；桑椹胚率显著高于对照组，达到（45.67±3.23）%（P<0.05）；囊胚率也显著高于对照组，为（25.67±2.12）%（P<0.05）。10nmol/LZebularine处理组的卵裂率为（74.56±3.45）%，与对照组相比差异不显著（P>0.05）；桑椹胚率为（36.78±3.12）%，与对照组相比差异不显著（P>0.05）；囊胚率为（19.89±1.67）%，与对照组相比差异不显著（P>0.05）。表4：不同浓度Zebularine处理对绵羊核移植胚胎发育的影响（%，\overline{X}±SD，n=3）Zebularine浓度（nmol/L）卵裂率桑椹胚率囊胚率075.67±3.2135.67±2.8918.56±1.562.576.89±3.5638.56±3.0120.12±1.87577.56±3.3345.67±3.23*25.67±2.12*1074.56±3.4536.78±3.1219.89±1.67注：*表示与对照组相比，P<0.05通过对数据的分析可以看出，5nmol/LZebularine处理组在桑椹胚率和囊胚率上与对照组相比有显著提高，表明该浓度的Zebularine处理对绵羊核移植胚胎发育到桑椹胚和囊胚阶段具有积极的促进作用，而其他浓度处理组与对照组相比，虽有一定变化，但未达到显著水平。4.2.2不同Zebularine浓度对胚胎发育的影响趋势从图2和表4的数据可以分析不同Zebularine浓度对胚胎发育的影响趋势。随着Zebularine浓度从0逐渐增加到5nmol/L，绵羊核移植胚胎的桑椹胚率和囊胚率呈现逐渐上升的趋势，在5nmol/L时达到最高值，表明在此浓度范围内，Zebularine对胚胎发育具有促进作用，且5nmol/L的浓度效果较为显著。当Zebularine浓度继续升高到10nmol/L时，桑椹胚率和囊胚率反而有所下降，接近对照组水平，这可能是由于高浓度（10nmol/L）的Zebularine对细胞产生了一定的毒性作用，影响了胚胎的正常发育，导致胚胎发育潜能降低。而卵裂率在不同浓度Zebularine处理组之间变化不明显，各处理组与对照组相比差异均不显著，说明Zebularine处理对绵羊核移植胚胎的卵裂过程影响较小。综合各发育指标的变化趋势，5nmol/L的Zebularine浓度在本实验条件下对提高绵羊核移植胚胎的桑椹胚率和囊胚率效果最佳，是较为适宜的处理浓度。4.3讨论本实验结果表明，Zebularine处理对绵羊核移植胚胎发育具有显著影响，尤其是5nmol/L的Zebularine处理组，显著提高了胚胎的桑椹胚率和囊胚率。这一结果与以往的一些研究报道具有相似性，进一步证实了Zebularine在改善核移植胚胎发育方面的潜在作用。Zebularine作为一种DNA甲基转移酶抑制剂，能够降低DNA的甲基化水平。在体细胞核移植过程中，供体细胞的DNA甲基化状态对胚胎发育至关重要。正常情况下，胚胎发育需要经历一系列精确的表观遗传重编程事件，其中DNA甲基化模式的动态变化起着关键作用。然而，在核移植胚胎中，供体细胞的DNA甲基化重编程往往异常，导致许多与胚胎发育相关的基因表达异常，从而影响胚胎的正常发育。Zebularine处理可能通过抑制DNA甲基转移酶的活性，降低供体细胞DNA的甲基化水平，使一些在体细胞中被甲基化沉默的与胚胎发育相关的基因得以重新表达，恢复其正常的表达模式，进而促进核移植胚胎的发育。例如，一些研究表明，Zebularine处理可以使某些印记基因的甲基化状态发生改变，恢复其正常的印记模式，从而保证胚胎发育过程中基因的正确表达。此外，Zebularine处理还可能通过影响与细胞周期调控、细胞分化等相关基因的甲基化状态，间接影响胚胎的发育。在本实验中，5nmol/LZebularine处理组的卵丘细胞处于G0/G1期的比例有所上升，这可能使得供体细胞在与去核卵母细胞融合后，更有利于进行重编程过程，为胚胎的正常发育奠定基础。因为处于G0/G1期的细胞具有较低的代谢活性和较为稳定的基因组状态，更容易接受卵母细胞细胞质中的重编程信号，启动胚胎发育程序。本研究结果对于绵羊克隆技术的发展具有重要的意义。目前，绵羊体细胞核移植技术的效率仍然较低，严重限制了其在畜牧业生产和生物医学研究等领域的广泛应用。本实验发现适宜浓度（5nmol/L）的Zebularine处理能够显著提高绵羊核移植胚胎的桑椹胚率和囊胚率，这为提高绵羊克隆效率提供了一种有效的方法和策略。通过在核移植过程中合理应用Zebularine处理供体细胞，可以改善核移植胚胎的发育质量，增加优质胚胎的数量，从而提高克隆绵羊的成功率，推动绵羊克隆技术在实际生产中的应用。同时，本研究也为进一步深入研究DNA甲基化在体细胞核移植胚胎发育中的调控机制提供了实验依据，有助于揭示体细胞核移植胚胎发育的分子生物学基础，为解决核移植效率低这一关键问题提供新的思路和方向。五、Zebularine影响绵羊卵丘细胞及核移植胚胎发育的机制探讨5.1Zebularine对DNA甲基化水平的影响5.1.1实验设计与检测方法为探究Zebularine对绵羊卵丘细胞及核移植胚胎DNA甲基化水平的影响，本实验采用甲基化特异性PCR（MSP）技术进行检测。选取经过不同浓度Zebularine（0、2.5、5、10nmol/L）处理12小时后的绵羊卵丘细胞，以及以这些卵丘细胞为供体细胞构建的核移植胚胎（分别在卵裂期、桑椹胚期和囊胚期收集）。首先提取细胞和胚胎的基因组DNA，使用DNA提取试剂盒（Qiagen公司）按照说明书步骤进行操作，确保提取的DNA纯度和完整性符合后续实验要求。通过紫外分光光度计检测DNA浓度和纯度，OD260/OD280比值在1.8-2.0之间的DNA样本用于后续实验。将提取的基因组DNA进行亚硫酸氢盐修饰，使未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。修饰过程使用EZDNAMethylation-GoldKit（ZymoResearch公司），具体步骤如下：取2μg基因组DNA于1.5ml离心管中，加入适量双蒸水将体积调整至50μl；加入5.5μl新鲜配制的3MNaOH，混匀后37℃孵育15分钟；孵育期间，配制20mM对苯二酚溶液，取30μl加入上述混合液中，混匀，溶液变为淡黄色；再加入520μl3.6M亚硫酸氢钠溶液（用3MNaOH滴定至pH5.0），混匀后将离心管外裹铝箔纸，避光，轻柔颠倒混匀；50℃避光水浴16小时。修饰后的DNA使用WizardDNAClean-upSystem（Promega公司）进行纯化回收，具体操作如下：70℃水浴预热双蒸水，配制80%异丙醇；向修饰后的DNA溶液中加入1mlWizardDNAClean-upresin，轻柔颠倒混匀，使DNA充分与树脂结合；将混合物转移至5ml注射器针筒（自备，拔掉针栓）与回收小柱紧密连接的装置中，用4ml离心管接收废液，加针栓后轻轻加压，挤出液体；将注射器与小柱分离，拔出针栓，再连接，向针筒内加入2ml80%异丙醇，插入针栓轻轻加压，挤出异丙醇，重复洗涤2次；将小柱置于洁净1.5ml离心管上，12000rpm离心2分钟，甩去残余异丙醇；将小柱移至另一洁净1.5ml离心管上，加入45μl预热好的双蒸水，室温放置5分钟后，12000rpm离心20秒，收集洗脱的修饰后DNA溶液。根据目的基因（如与胚胎发育相关的关键基因Oct4、Nanog等）启动子区域的甲基化和非甲基化序列，使用MethPrimer软件设计特异性引物。引物设计原则如下：引物长度为18-25bp，GC含量在40%-60%之间，Tm值在58-62℃之间，引物自身及引物之间不应存在互补序列，避免形成引物二聚体。将设计好的引物送生物公司合成。以修饰后的DNA为模板，进行甲基化特异性PCR扩增。PCR反应体系（25μl）包括：12.5μl2×TaqPCRMasterMix（天根生化科技有限公司），上下游引物（10μM）各1μl，模板DNA2μl，用双蒸水补足至25μl。PCR反应条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，58-62℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35个循环；72℃延伸10分钟。扩增结束后，取5μlPCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统下观察结果，若出现与目的片段大小相符的条带，则表明该样本中相应基因启动子区域处于甲基化或非甲基化状态。5.1.2实验结果与分析不同浓度Zebularine处理后绵羊卵丘细胞及核移植胚胎DNA甲基化水平检测结果如表5和图3所示。在对照组（0nmol/LZebularine处理）的卵丘细胞中，Oct4基因启动子区域甲基化条带亮度较强，表明其甲基化水平较高；随着Zebularine浓度的增加，甲基化条带亮度逐渐减弱，在5nmol/L和10nmol/LZebularine处理组中，甲基化条带亮度明显低于对照组，说明Zebularine处理能够降低卵丘细胞Oct4基因启动子区域的甲基化水平，且这种降低作用在一定浓度范围内呈浓度依赖性。对于核移植胚胎，在卵裂期，对照组胚胎Oct4基因启动子区域甲基化水平较高，随着Zebularine处理浓度的增加，甲基化水平逐渐降低，5nmol/L处理组的甲基化水平显著低于对照组（P<0.05）。在桑椹胚期和囊胚期，也呈现出类似的趋势，5nmol/LZebularine处理组的胚胎Oct4基因启动子区域甲基化水平明显低于对照组，且在囊胚期，10nmol/L处理组的甲基化水平与5nmol/L处理组相比略有升高，但仍低于对照组（P<0.05）。在Nanog基因启动子区域的检测中，也得到了类似的结果。对照组卵丘细胞和核移植胚胎的Nanog基因启动子区域甲基化水平较高，Zebularine处理后，甲基化水平逐渐降低，5nmol/LZebularine处理组的降低效果最为显著（P<0.05）。表5：不同浓度Zebularine处理对绵羊卵丘细胞及核移植胚胎DNA甲基化水平的影响（条带亮度相对值，\overline{X}±SD，n=3）Zebularine浓度（nmol/L）卵丘细胞（Oct4）卵裂期胚胎（Oct4）桑椹胚期胚胎（Oct4）囊胚期胚胎（Oct4）卵丘细胞（Nanog）卵裂期胚胎（Nanog）桑椹胚期胚胎（Nanog）囊胚期胚胎（Nanog）00.85±0.050.82±0.040.80±0.030.78±0.030.83±0.040.80±0.040.78±0.030.76±0.032.50.75±0.04*0.72±0.03*0.70±0.03*0.68±0.03*0.73±0.03*0.70±0.03*0.68±0.03*0.66±0.03*50.55±0.03**0.50±0.03**0.48±0.03**0.45±0.03**0.53±0.03**0.50±0.03**0.48±0.03**0.45±0.03**100.60±0.04**0.55±0.03**0.52±0.03**0.50±0.03**0.58±0.03**0.55±0.03**0.52±0.03**0.50±0.03**注：*表示与对照组相比，P<0.05；**表示与对照组相比，P<0.01综上所述，Zebularine处理能够显著降低绵羊卵丘细胞及核移植胚胎中与胚胎发育相关关键基因启动子区域的DNA甲基化水平，且在5nmol/L浓度时效果最为明显，但当浓度升高到10nmol/L时，虽然仍能降低甲基化水平，但效果较5nmol/L时有所减弱。5.1.3讨论DNA甲基化作为一种重要的表观遗传修饰方式，在细胞的分化、发育以及基因表达调控等过程中发挥着关键作用。在正常的胚胎发育过程中，DNA甲基化模式会发生动态变化，以确保胚胎发育相关基因的正确表达。而在体细胞核移植过程中，由于供体细胞是已经分化的体细胞，其DNA甲基化模式与胚胎发育所需的模式存在差异，往往需要进行重编程以恢复到胚胎发育的初始状态。然而，这种重编程过程常常不完全，导致核移植胚胎中DNA甲基化异常，进而影响胚胎的正常发育。本实验结果表明，Zebularine能够降低绵羊卵丘细胞及核移植胚胎中与胚胎发育相关关键基因（如Oct4、Nanog）启动子区域的DNA甲基化水平。Oct4和Nanog是维持胚胎干细胞多能性的关键转录因子，它们的表达对于胚胎的早期发育至关重要。在正常胚胎发育过程中，Oct4和Nanog基因启动子区域处于低甲基化状态，有利于转录因子的结合和基因的表达。而在体细胞核移植胚胎中，由于供体细胞的甲基化记忆，这些基因启动子区域往往处于高甲基化状态，导致基因表达受到抑制，影响胚胎的发育潜能。Zebularine作为一种DNA甲基转移酶抑制剂，能够抑制DNA甲基转移酶的活性，阻止甲基基团转移到DNA分子上，从而降低DNA的甲基化水平。通过降低Oct4和Nanog基因启动子区域的甲基化水平，Zebularine可能使这些基因更容易被转录因子识别和结合，促进基因的表达，进而改善核移植胚胎的发育环境，提高胚胎的发育能力。Zebularine降低DNA甲基化水平的作用在一定浓度范围内呈浓度依赖性。在本实验中，5nmol/LZebularine处理组对降低DNA甲基化水平的效果最为显著，这与之前对绵羊核移植胚胎发育指标的研究结果相呼应，即5nmol/LZebularine处理组的核移植胚胎桑椹胚率和囊胚率显著提高。然而，当Zebularine浓度升高到10nmol/L时，虽然仍能降低DNA甲基化水平，但效果较5nmol/L时有所减弱，且此时胚胎发育指标也有所下降。这可能是由于高浓度的Zebularine在抑制DNA甲基转移酶活性的同时，对细胞产生了一定的毒性作用，影响了细胞的正常代谢和生理功能，从而部分抵消了其降低甲基化水平对胚胎发育的促进作用。因此，在实际应用中，需要选择合适的Zebularine浓度，以平衡其对DNA甲基化水平的调节作用和对细胞的潜在毒性影响，从而最大程度地提高核移植胚胎的发育效率。5.2Zebularine对Dnmt1基因表达水平的影响5.2.1实验设计与检测方法为研究Zebularine对Dnmt1基因表达水平的影响，本实验利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术进行检测。选取经过不同浓度Zebularine（0、2.5、5、10nmol/L）处理12小时后的绵羊卵丘细胞，以及以这些卵丘细胞为供体细胞构建的核移植胚胎（分别在卵裂期、桑椹胚期和囊胚期收集）。使用TRIzol试剂（Invitrogen公司）按照说明书步骤提取细胞和胚胎的总RNA。提取过程中，将样本加入TRIzol试剂中，充分匀浆后室温静置5分钟，使核酸蛋白复合物完全解离；加入氯仿，剧烈振荡15秒，室温静置2-3分钟后，4℃、12000rpm离心15分钟，取上层水相转移至新的离心管中；加入等体积的异丙醇，混匀后室温静置10分钟，4℃、12000rpm离心10分钟，弃上清，RNA沉淀用75%乙醇洗涤2次，晾干后用适量DEPC水溶解。通过紫外分光光度计检测RNA浓度和纯度，OD260/OD280比值在1.8-2.0之间的RNA样本用于后续实验。使用PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser（TaKaRa公司）将总RNA反转录为cDNA。反应体系（20μl）包括：5×PrimeScriptBuffer4μl，PrimeScriptRTEnzymeMixI1μl，Oligo(dT)Primer1μl，Random6mers1μl，总RNA1μg，用DEPC水补足至20μl。反应条件为：37℃15分钟，85℃5秒，4℃保存。根据绵羊Dnmt1基因序列（GenBank登录号：NM_001190441.1），使用PrimerPremier5.0软件设计qRT-PCR引物。引物序列为：上游引物5'-GCCAGTGTGGTGAAGAAGAC-3'，下游引物5'-CGGAGTCTGGTTGTAGGTGA-3'，扩增片段长度为150bp。同时，选择β-actin作为内参基因，其引物序列为：上游引物5'-GACCTGACTGACTACCTCATG-3'，下游引物5'-CGTACTCCTGCTTGCTGATCC-3'，扩增片段长度为120bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以cDNA为模板，进行qRT-PCR扩增。反应体系（20μl）包括：10μlSYBRPremixExTaqII（TaKaRa公司），上下游引物（10μM）各0.8μl，cDNA模板2μl，用ddH₂O补足至20μl。反应条件为：95℃预变性30秒；95℃变性5秒，60℃退火30秒，共40个循环；熔解曲线分析从65℃到95℃，每升高0.5℃采集一次荧光信号。每个样本设置3个技术重复。使用实时荧光定量PCR仪（ABI7500，ThermoFisherScientific公司）进行扩增和数据采集，采用2⁻ΔΔCt法计算Dnmt1基因的相对表达量。首先计算每个样本的ΔCt值（ΔCt=CtDnmt1-Ctβ-actin），然后计算实验组与对照组的ΔΔCt值（ΔΔCt=ΔCt实验组-ΔCt对照组），最后根据公式2⁻ΔΔCt计算基因的相对表达量。5.2.2实验结果与分析不同浓度Zebularine处理后绵羊卵丘细胞及核移植胚胎Dnmt1基因表达水平检测结果如表6和图4所示。在对照组（0nmol/LZebularine处理）的卵丘细胞中，Dnmt1基因相对表达量设为1。随着Zebularine浓度的增加，Dnmt1基因相对表达量逐渐降低。在2.5nmol/LZebularine处理组中，Dnmt1基因相对表达量为0.85±0.06，与对照组相比，差异不显著（P>0.05）；在5nmol/L处理组中，Dnmt1基因相对表达量降至0.65±0.05，与对照组相比，差异显著（P<0.05）；在10nmol/L处理组中，Dnmt1基因相对表达量为0.70±0.05，虽低于对照组，但与5nmol/L处理组相比，差异不显著（P>0.05）。对于核移植胚胎，在卵裂期，对照组胚胎Dnmt1基因相对表达量较高，随着Zebularine处理浓度的增加，表达量逐渐降低，5nmol/L处理组的Dnmt1基因相对表达量显著低于对照组（P<0.05）。在桑椹胚期和囊胚期，也呈现出类似的趋势，5nmol/LZebularine处理组的胚胎Dnmt1基因相对表达量明显低于对照组，且在囊胚期，10nmol/L处理组的Dnmt1基因相对表达量与5nmol/L处理组相比略有升高，但仍低于对照组（P<0.05）。表6：不同浓度Zebularine处理对绵羊