枸杞中5种全氟化合物含量的测定 高效液相色谱-串联质谱法

枸杞中5种全氟化合物含量的测定高效液相色谱-串联质谱法1范围本方法规定了枸杞中5种全氟化合物（全氟辛酸PFOA、全氟辛烷磺酸PFOS、全氟壬酸PFNA、全氟癸酸PFDA、全氟十二烷酸PFDoA）含量的高效液相色谱-串联质谱测定方法。本方法适用于枸杞果实（干制、鲜制）中上述5种全氟化合物的定性鉴别与定量测定，检出限为0.01~0.05μg/kg，定量限为0.03~0.15μg/kg。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本方法的引用而成为本方法的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本方法；凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本方法。GB5009.253-2021食品安全国家标准动植物源性食品中全氟化合物的测定GB2760食品安全国家标准食品添加剂使用标准GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T8302茶取样JJF1059.1测量不确定度评定与表示JJF1164液相色谱-质谱联用仪校准规范3术语和定义3.1全氟化合物（PerfluorinatedCompounds,PFCs）分子中碳原子上的氢原子全部被氟原子取代的一类有机化合物，具有持久性、生物累积性和远距离迁移性，本方法特指全氟辛酸、全氟辛烷磺酸等5种目标化合物。3.2检出限（LimitofDetection,LOD）在给定置信水平（通常为95%）下，能够与空白样品区分开的目标化合物的最低浓度，本方法以3倍信噪比（S/N≥3）对应的浓度作为检出限。3.3定量限（LimitofQuantitation,LOQ）在给定置信水平下，能够准确定量测定的目标化合物的最低浓度，本方法以10倍信噪比（S/N≥10）对应的浓度作为定量限。3.4基质匹配标准曲线以空白枸杞样品提取液为基质，配制不同浓度的目标化合物标准系列，消除基质效应对测定结果的影响，用于定量计算的标准曲线。4原理样品经冷冻干燥（鲜样）、粉碎、均质后，采用乙腈作为提取溶剂，通过涡旋振荡、超声提取、离心等步骤，提取样品中的5种全氟化合物；提取液经固相萃取柱净化、浓缩、定容后，采用高效液相色谱（HPLC）进行分离，串联质谱（MS/MS）进行检测。以目标化合物的保留时间和特征离子对（母离子→子离子）进行定性鉴别，外标法（基质匹配标准曲线）进行定量计算，实现枸杞中5种全氟化合物含量的准确测定。5试剂与材料5.1试剂乙腈（CH₃CN）：色谱纯，纯度≥99.9%，无目标化合物检出。甲醇（CH₃OH）：色谱纯，纯度≥99.9%，用于固相萃取柱活化与洗脱。超纯水：符合GB/T6682一级水要求，电导率≤0.01mS/m，无目标化合物检出。氨水（NH₃·H₂O）：分析纯，浓度25%~28%，用于调节提取液pH值。5种全氟化合物标准品：全氟辛酸（PFOA，CAS：335-67-1）、全氟辛烷磺酸（PFOS，CAS：1763-23-1）、全氟壬酸（PFNA，CAS：375-95-1）、全氟癸酸（PFDA，CAS：335-76-2）、全氟十二烷酸（PFDoA，CAS：307-55-1），纯度均≥98.0%，购自正规标准品供应商，带证书。标准储备液：分别准确称取5种全氟化合物标准品各10.0mg，用甲醇溶解并定容至100mL，配制浓度为100μg/mL的单标储备液，置于-20℃冰箱中密封保存，有效期6个月。混合标准中间液：准确移取上述单标储备液各1.0mL，用甲醇定容至100mL，配制浓度为1.0μg/mL的混合标准中间液，置于4℃冰箱中密封保存，有效期1个月。混合标准工作液：根据检测需求，用空白枸杞样品提取液逐级稀释混合标准中间液，配制浓度为0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50μg/L的基质匹配混合标准工作液，现配现用。内标溶液（可选）：选取全氟庚酸（PFHeA，CAS：375-85-9）作为内标，纯度≥98.0%，配制浓度为1.0μg/mL的内标储备液，用甲醇稀释至所需浓度，用于消除提取过程中的损失与基质效应（若不使用内标，可直接采用外标法）。5.2材料固相萃取柱：WAX固相萃取柱（6mL，500mg）或C18固相萃取柱（6mL，500mg），用于提取液净化，使用前需活化。离心管：50mL、15mL，聚四氟乙烯（PTFE）材质，无目标化合物检出，避免使用含氟材质污染样品。滤膜：0.22μm有机相滤膜（PTFE材质），用于过滤净化后的提取液，去除杂质。离心管架、涡旋振荡器、超声波清洗器、高速冷冻离心机、氮吹仪（带加热模块）、冷冻干燥机、粉碎仪、分析天平（精度0.1mg）。样品瓶：2mL，棕色玻璃材质，带密封垫，用于储存待检测样品液与标准工作液。6仪器与设备高效液相色谱-串联质谱仪（HPLC-MS/MS）：配备电喷雾离子源（ESI），能够实现正、负离子模式切换，具备多反应监测（MRM）功能。分析天平：精度0.1mg和0.001g，用于标准品称量与样品称量。高速冷冻离心机：转速≥12000r/min，温度可调节（0~4℃），用于提取液离心分离。超声波清洗器：功率≥200W，频率40kHz，用于样品提取，可调节温度。氮吹仪：带加热模块，温度可调节（30~60℃），氮气纯度≥99.999%，用于提取液浓缩。冷冻干燥机：真空度≤10Pa，温度可降至-50℃以下，用于鲜枸杞样品干燥。粉碎仪：不锈钢材质，用于枸杞样品粉碎，粉碎后过40目筛。涡旋振荡器：转速0~3000r/min，用于样品与提取溶剂的混合振荡。固相萃取装置：带负压调节功能，用于固相萃取柱净化操作。移液器：10μL、100μL、1mL、5mL、10mL，精度符合要求，定期校准。所有仪器设备需定期校准，符合JJF1164等相关校准规范要求，使用前检查仪器状态，确保正常运行。7样品制备7.1样品采集与保存样品采集：按照GB/T8302的规定，随机采集枸杞样品（干制或鲜制），至少3个独立样品，每个样品量不少于500g，采集后置于干净的聚乙烯袋中，密封，标注样品名称、采集时间、采集地点、样品状态（干/鲜）等信息。样品保存：鲜枸杞样品采集后立即置于4℃冰箱中冷藏，24h内进行前处理；干枸杞样品置于干燥、阴凉、通风处保存，避免受潮、污染，保质期内完成检测。7.2样品前处理7.2.1样品预处理鲜枸杞：去除杂质（果柄、叶片、腐烂果实等），洗净，沥干表面水分，放入冷冻干燥机中冷冻干燥至恒重，取出后用粉碎仪粉碎，过40目筛，均质后置于干燥的样品瓶中，密封保存，备用。干枸杞：去除杂质，用粉碎仪粉碎，过40目筛，均质后置于干燥的样品瓶中，密封保存，备用。7.2.2提取准确称取5.00g（精确至0.001g）预处理后的枸杞样品，置于50mL聚四氟乙烯离心管中，加入20mL乙腈，涡旋振荡1min，使样品与提取溶剂充分混合。用氨水调节提取液pH值至9.0~10.0，置于超声波清洗器中，30℃水浴超声提取20min（功率200W，频率40kHz），期间每隔5min涡旋振荡1次，确保提取充分。提取完成后，将离心管置于高速冷冻离心机中，4℃、10000r/min离心10min，小心吸取上清液至另一干净的50mL离心管中。向残渣中再次加入15mL乙腈，重复上述提取、离心步骤，合并两次上清液，摇匀，备用。7.2.3净化固相萃取柱活化：将WAX固相萃取柱安装在固相萃取装置上，依次用5mL甲醇、5mL超纯水活化柱子，控制流速为1~2mL/min，活化完成后，待柱子自然滴干（避免干涸）。上样与淋洗：将合并后的上清液缓慢注入活化后的固相萃取柱中，控制流速为1mL/min，待样品液全部过柱后，用5mL超纯水淋洗柱子，弃去淋洗液，再用5mL甲醇淋洗，弃去淋洗液，将柱子抽干5min，去除残留水分。洗脱：用8mL甲醇-氨水混合溶液（甲醇:氨水=95:5，v/v）洗脱目标化合物，控制流速为0.5~1mL/min，收集洗脱液于15mL离心管中。7.2.4浓缩与定容将收集的洗脱液置于氮吹仪中，40℃水浴加热，氮气吹扫浓缩至近干（避免完全吹干，防止目标化合物损失）。用乙腈溶解残渣，并定容至1.0mL，涡旋振荡1min，使残渣完全溶解，过0.22μm有机相滤膜，滤入2mL棕色样品瓶中，供HPLC-MS/MS检测。空白样品制备：称取5.00g空白枸杞样品（经检测无目标化合物检出），按照上述7.2.2~7.2.4步骤操作，制备空白样品液，用于基质匹配标准曲线的配制与空白扣除。8仪器操作条件8.1高效液相色谱条件色谱柱：C18色谱柱（150mm×2.1mm，1.8μm），或性能相当的色谱柱。柱温：35℃，保持恒定。流动相：A相为超纯水，B相为乙腈，梯度洗脱程序见表1。流速：0.3mL/min。进样量：10μL。洗脱方式：梯度洗脱，总运行时间15min，后运行时间5min，确保柱子平衡，避免残留。时间（min）A相（超纯水）（%）B相（乙腈）（%）0.060405.0208010.059512.059512.1604015.06040表1梯度洗脱程序8.2质谱条件离子源：电喷雾离子源（ESI），负离子模式（ESI⁻）。离子源温度：350℃。喷雾电压：-4500V。雾化气压力：35psi。干燥气流量：10L/min，干燥气温度：300℃。检测模式：多反应监测（MRM），每种目标化合物选取1个母离子和2个子离子（定量离子与定性离子），优化碰撞能量与去簇电压，确保离子响应强度高、干扰小。5种全氟化合物的质谱参数见表2（参考值，可根据仪器型号优化）。目标化合物保留时间（min）母离子（m/z）定量子离子（m/z）定性子离子（m/z）碰撞能量（eV）去簇电压（V）全氟辛酸（PFOA）7.8~8.2413.0369.0313.018-80全氟辛烷磺酸（PFOS）8.5~8.9499.080.0339.035-100全氟壬酸（PFNA）9.2~9.6463.0419.0363.020-85全氟癸酸（PFDA）10.0~10.4513.0469.0413.022-90全氟十二烷酸（PFDoA）11.5~11.9613.0569.0513.025-95表25种全氟化合物的质谱参数（参考值）9测定9.1仪器校准开机后，启动高效液相色谱-串联质谱仪，按照仪器操作规程进行预热、校准，确保仪器各项指标（流速、柱温、质谱参数）稳定。依次注入空白样品液、基质匹配混合标准工作液（从低浓度到高浓度），记录每种标准工作液的色谱图与质谱响应值。9.2标准曲线绘制以基质匹配混合标准工作液的浓度（μg/L）为横坐标（x），以对应目标化合物的定量离子峰面积为纵坐标（y），采用最小二乘法进行线性回归，绘制基质匹配标准曲线，计算回归方程与相关系数（r）。要求相关系数r≥0.995，否则需重新配制标准工作液，重新绘制标准曲线。9.3样品测定按照上述仪器操作条件，依次注入空白样品液、样品液，记录样品液中目标化合物的保留时间、定量离子峰面积与定性离子峰面积。每个样品平行测定3次，同时做空白实验与加标回收实验，确保测定结果准确可靠。9.4定性鉴别样品液中目标化合物的保留时间，与基质匹配混合标准工作液中对应目标化合物的保留时间偏差应≤±2.0%；样品液中目标化合物的定量离子与定性离子的峰面积比，与标准工作液中对应离子峰面积比的偏差应≤±15%，满足上述条件即可定性鉴别样品中含有该目标化合物。9.5定量计算根据样品液中目标化合物的定量离子峰面积，代入基质匹配标准曲线的回归方程，计算样品液中目标化合物的浓度（μg/L），再按照下列公式计算枸杞样品中5种全氟化合物的含量：X=式中：X——枸杞样品中目标化合物的含量，单位为μg/kg；C——由标准曲线计算得到的样品液中目标化合物的浓度，单位为μg/L；V——样品液的最终定容体积，单位为mL（本方法中V=1.0mL）；f——样品稀释倍数（本方法中未稀释，f=1）；m——称取的枸杞样品质量，单位为g；1000——单位换算系数（1L=1000mL）。平行测定3次，计算平均值与相对标准偏差（RSD），RSD应≤10%，否则需重新测定。10精密度与准确度10.1精密度选取空白枸杞样品，添加3个浓度水平（定量限、2倍定量限、10倍定量限）的混合标准工作液，每个浓度水平平行测定6次，计算相对标准偏差（RSD）。要求RSD≤10%，表明方法精密度良好。10.2准确度采用加标回收实验验证方法的准确度，选取空白枸杞样品，添加3个浓度水平（定量限、2倍定量限、10倍定量限）的混合标准工作液，按照7.2步骤进行前处理与测定，计算加标回收率。要求加标回收率在80%~120%之间，表明方法准确度良好。11检出限与定量限连续测定空白样品液11次，计算空白样品液中目标化合物定量离子峰面积的标准偏差（SD），以3倍SD对应的浓度作为检出限（LOD），以10倍SD对应的浓度作为定量限（LOQ）。本方法中5种全氟化合物的检出限为0.01~0.05μg/kg，定量限为0.03~0.15μg/kg，具体见表3。目标化合物检出限（μg/kg）定量限（μg/kg）全氟辛酸（PFOA）0.020.06全氟辛烷磺酸（PFOS）0.010.03全氟壬酸（PFNA）0.020.07全氟癸酸（PFDA）0.030.10全氟十二烷酸（PF