CN119039388B 一种动物血源抗氧化肽及其制备方法与应用 （合肥工业大学）

一种动物血源抗氧化肽及其制备方法与应用了血球蛋白中多肽的抗氧化活性机制与构效关23发与利用。并能从分子相互作用的角度解释蛋白质和生物活性肽之间的结构与活性4NaCl和金属离子等因素的影响下稳定性更350-1600m/Z;一级扫描中强度最高的20个离子经四极杆筛选后使用HCD裂解后进行碎片离级扫描。器https://distilldeep.ucd.ie/PeptideRanker/预测多肽的潜在生物活性，预测主[0023]分子对接使用Autodock分析所选抗氧化肽与Keap1的相互作用；在与抗氧化肽对BIOVIADiscoveryStudio2021Client可视化软件获得了多肽和目标蛋白之间相互作用5[0024]分子动力学模拟是使用Gromacs2020软件对通过分子对接获得的蛋白质_配体复[0025]首先通过约束蛋白质以及小分子的重原子，以及对水分子进行10000步的能量最和多肽之间的结构_活性关系；实现了有高抗氧化活性的多肽快速筛选，并阐明多肽与细胞实验不仅耗时少，成本也相对较低。本发明采用了H2O2诱导的Caco_2细胞氧化损伤模抗氧化肽预防细胞氧化应激损伤的潜在抗氧化途径，验证了抗氧化肽与Keap1蛋白的相互[0030](1)本发明制备方法利用益生菌协同酶解技术制备了血红蛋白肽粗肽，与单一酶[0032](3)本发明将多肽进一步的纯化鉴定，借助计算机的手段对其理化性质及活性预Keap1_Kelch区域氨基酸残基与Nrf2形成氢键的2个结合位点。分子动力学模拟结果显示，Keap1_GLWGKV和Keap1_LIVYPW两个复合物在100ns左右均达到了动态平衡，均未脱离蛋白Keap1之间，GLWGKV与Keap1蛋白的结合自由能为_86.37kJ/mol显著低于LIVYPW与Keap1蛋6[0033](4)本发明发现了多肽GLWGKV在模拟胃肠道消化过程中是稳定的，抗氧化活性整的预防机制。发现GLWGKV提高了H2O2诱导的氧化损伤Caco_2细胞中SOD、CAT和GSH_Px的活7[0056]为了测量水解产物受pH值的影响，使用1MHCl和1M℃)下静置1h后进行DPPH自由基清除活性测扫描范围：350-1600m/z;一级扫描中强度最高的20个离子(top20)经四极杆筛选后使用[0067]ToxinPred虚拟预测多肽的毒性(.in/raghava/8生物活性越高，选择≥0.5的多肽。使用CPPpred软件(https://distilldeep.ucd.ie/从0～1，得分越高生物可穿透性越高。使用BIOPEP_UWMTM生物活性肽数据库(https://氧化肽与Keap1的相互作用。Keap1蛋白的晶体结构从蛋白质数据库(PDBID:2FLU，中去除水分子和原始配体(Nrf2)，然后使用Autodock添加氢原子和电荷。使用ChemDraw视化软件获得了多肽和目标蛋白之间相互作用的2D和3D结[0071]使用Gromacs2020软件对通过分子对接获得的蛋白质_配体(Keap1_GLWGKV与Gaff2作为配体力场，选择TIP3P水模型向蛋白质_配体体系中加入溶剂，建立周期边界为5％CO2饱和湿度的培养箱中进行培养，每1～2d更换培养液细胞密度培养至8090％时9温)，并在室温下用5％脱脂牛奶封闭30min。将膜与稀释的一抗Nrf2(1:1000)、HO_1(1:M3[0089]为了纯化抗氧化肽，将富集的M1组分经过Sephadex_G25色谱柱进一步的分离纯果显示，从P1中鉴定出149条多肽。多肽的长度为6～25个氨基酸，分子量在559.34至[0093]将鉴定出149个多肽片段首先进行多肽的毒性预测，全都没有毒性。PeptideRanker程序用于根据其结构模式(得分为>0.5)筛选潜在的生物活性物质，鉴定149个多肽性与生物可及性评分都大于0.5，其可能具有潜在的抗氧化活性并能在细胞中发挥抗氧化作用。使用BIOPEP_UWMTM数据库将RFFASF、ASFGNL、ALARLLIVYPWTQRFF、[0095]通过计算机模拟预测筛选出2条可能根据有潜在生物活性的抗氧化肽，为了进一出与原生配体相似的结合模式(如图5)。具体来说，GT通过与受体蛋白Keap1的Arg380、了Keap1_Kelch区域的氨基酸残基与Nrf2形成氢键的6个结合位点(Arg380、Arg415、德华力等，对接的结合能为_10.85kcal/mol。LT占据了Keap1_Kelch区域的氨基酸残基与Nrf2形成氢键的2个结合位点(Arg415和Arg483)。较低的对接能量表明肽和蛋白质之间的回旋半径均有减小且达到平衡。GT与Keap1蛋白之间的氢键数量要明显多于LT与Keap1之的Caco_2细胞的活力显著增加了35.91恢复到未处理对照组的87.22同样，LT也nano_LC_MS/MS鉴定出分别来自6种蛋白的149条多肽，肽链长度小于10的多肽占比达Nrf2形成氢键的6个结合位点，LIVYPW则占据了2个结合位点。分子动力学模拟结果显示，Keap1_GLWGKV和Keap1_LIVYPW两个复合物在100ns左右均达到了动态平衡，均未脱离蛋白Keap1之间，GLWGKV与Keap1蛋白的结合自由能为_86.37kJ/mol显著低于LIVYPW与Keap1蛋多肽的抗氧化活性机制与构效关系。其方法也可拓展到抗氧化以外的功能活性的快速筛