(5.2.2)-5.2.2 常用检测技术 (分子生物学技术)完

分子生物学技术01分子生物学的概念0203实时荧光定量PCR免疫共沉淀染色质免疫共沉淀技术04目录分子生物学的概念第一章分子生物学（molecularbiology）是一门研究生物大分子的结构与功能的科学，旨在阐明生命现象的本质。它的发展与生物化学、生物物理学等其他学科相互交叉和渗透，形成了现代生命科学中的前沿领域。分子生物学的概念分子生物学的诞生可以追溯到1953年沃森和克里克提出DNA分子的双螺旋结构模型。这一发现标志着分子生物学的诞生，并推动了其后的发展。随着现代化学和物理学理论、技术和方法的应用，生物大分子的结构与功能研究取得了显著进展，为分子生物学的蓬勃发展奠定了基础。自20世纪50年代以来，分子生物学已经成为生物学的一个重要分支，其核心内容是通过研究生物物质基础如核酸、蛋白质、酶等的结构、功能及其相互作用的规律，来揭示生命的奥秘。分子生物学的发展分子生物学技术与遗传性疾病的研究、基因工程、PCR（聚合酶链反应）、单链构象多态性分析等领域密切相关，为生物学和医学的各个领域提供了一个强有力的技术平台，使得人们能够从分子水平上检测和比较不同物种、个体、细胞或生理（病理）状态的差异。分子生物学技术的意义实时荧光定量PCR第二章PCR又称为聚合酶链反应（PolymeraseChainReaction），是体外通过酶促反应合成特异DNA片段的一种方法。实时荧光定量PCR是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。目前，荧光定量PCR技术广泛应用于医学，如癌症的诊断、病原体的感染以及基因缺陷性疾病的检测。实时荧光定量PCR的概念DNA染料法荧光探针法猝灭染料引物法实时荧光定量PCR技术分类实时荧光定量PCR主要体现在荧光、实时与定量3个关键词上。荧光是指在标准PCR体系中加入了荧光物质；实时是指通过荧光信号的积累能够实时监测每次循环后PCR产物的变化，并生成荧光扩增曲线；定量是指该技术能够实现对初始模板的定量分析。常用的两种方法是SYBRgreen（荧光染料掺入法）和Taqmanprobe（探针法）。SYBRgreen（荧光染料掺入法）是在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。Taqmanprobe（探针法）是PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。梁子英,刘芳.实时荧光定量PCR技术及其应用研究进展[J].现代农业科技,2020(06):1-3+8.实时荧光定量PCR的实验原理各组大鼠FNGABAA受体mRNA相对表达量比较模型组：大鼠GABAA受体mRNA表达升高（P＜0.01）；电针组：大鼠GABAA受体mRNA表达降低（P＜0.01）；与电针组比较，激动剂组、激动剂＋电针组大鼠GABAA受体mRNA表达升高（P＜0.01）王帅亚,舒琪,陈翩翩,等.电针预处理对心肌缺血再灌注损伤大鼠小脑顶核GABAA受体及交感神经活动的影响[J].中国针灸神经示踪技术第三章免疫共沉淀技术（Co-immunoprecipitation，Co-IP）是目前广泛应用的一种研究体内蛋白质与蛋白质相互作用的方法，具有灵敏性高、特异性强、可信度高、自然状态下可操作且能够对蛋白半定量分析等优点。免疫共沉淀的概念信号传导、基因调控中相互作用因子的发现；血清中和抗体的快速筛选；受体蛋白结合配体的发现；病毒蛋白、激素、信号分子膜上结合位点的发现；核酸序列转录因子的发现；中草药活性成分的分离鉴定；中草药药效靶点的发现与确认等方面。免疫共沉淀的应用在细胞裂解液中加入抗目的蛋白的抗体，孵育后再加入与抗体特异结合的结合于sepharosebeads上的proteinA/G，细胞中有目的蛋白结合，就形成一种复合物-目的蛋白/目的蛋白-抗目的蛋白抗体-proteinA/G，经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物被分开。最后经免疫印迹或质谱对目的蛋白进行分析。免疫共沉淀的实验原理易璇,陈丽,王静芝,等.电针对胰岛素抵抗大鼠肝脏组织SIRT1/ATG7信号通路的影响[J].华中科技大学学报(医学版),2023,52(02):212-217.各组大鼠肝脏ATG7蛋白乙酰化水平比较染色质免疫共沉淀技术第四章染色质免疫共沉淀技术（chromatinimmunoprecipitationassay，ChIP）是目前被广泛应用于研究DNA和蛋白质相互作用的方法。同时，结合生物信息学的方法也可以预测DNA中转录因子结合位点的保守序列。ChIP技术能够在体内研究转录因子和靶基因启动子区域直接的相互作用，可以直接确定它们之间相互作用的动态变化，得到转录因子结合位点的信息，确定其直接作用的靶基因序列。ChIP技术被广泛应用于体内转录调节因子与靶基因启动子结合方面的研究，并成为染色质水平研究基因表达调控的有效方法。许昆,张静,杨敬平,等.脂肪组分染色质免疫共沉淀研究方法的建立[J].肾脏病与透析肾移植杂志,2022,31(02):144-148.染色质免疫共沉淀技术的概念应用于表观遗传信息研究。这项技术帮助研究者判断在细胞核中基因组的某一特定位置会出现何种组蛋白修饰；检测体内反式因子与DNA的动态作用，研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系；深入分析癌症、心血管疾病以及中央神经系统紊乱等疾病的主要代谢通路的一种非常有效的工具；广泛应用于体内转录调节因子与靶基因启动子结合方面的研究，并成为染色质水平研究基因表达调控的有效方法。染色质免疫共沉淀技术的应用染色质免疫共沉淀技术相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。但是该技术可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性；灵敏度没有亲和色谱高。染色质免疫共沉淀技术的应用交联免疫共沉淀(cross-linkedChIP,X-ChIP)。X-ChIP一般采用甲醛作为可逆的交联剂,通过超声波将染色质破碎为200–500bp的片段;免疫沉淀后,将蛋白质-DNA复合体解交联,蛋白质可通过蛋白酶进行降解,然后纯化提取DNA。由于甲醛固定增强了DNA与蛋白质的结合程度,降低了蛋白质重排的可能性,因此X-ChIP的灵敏度较高,适用于转录因子等与DNA结合程度不是很强的蛋白质研究。无交联免疫共沉淀(nativeChIP,N-ChIP)。N-ChIP是利用核酸酶消化未经固定的染色质,由于未经固定的蛋白质-DNA复合体保持在自然状态,因此N-ChIP适用于与DNA结合紧密的组蛋白修饰的表观遗传学研究;同时,由于抗体与未固定的目标蛋白质结合程度高,因此N-ChIP的特异性较强,DNA富集效率高。王泓力,焦雨铃.染色质免疫共沉淀实验方法[J].植物学报,2020,55(04):475-480.染色质免疫共沉淀技术的分类在生理状态下将细胞内DNA与蛋白质交联在一起，通过超声或酶处理方法，将染色质切为小片段，利用抗原抗体特异性识别反应，将与目的基因结合的蛋白质沉淀下来，再通过多种下游检测技术（实时定量PCR、基因芯片等）检测富集片段的DNA序列。染色质免疫共沉淀技术的实验原理张雪,金美玉,于洋,等.小鼠生殖细胞特异性转录因子NOBOX调控初级卵泡发育机制的研究[J].中国比较医学杂志,2021,31(04):107-114.a-c代表NOBOX可与Kit启动子(-2933