乌天麻萌发菌菌种生产技术规程

乌天麻萌发菌菌种生产技术规程1范围本规程规定了乌天麻萌发菌菌种生产过程中的术语定义、生产总则、生产环境与设施、培养基制备、菌种分离与纯化、菌种扩大培养、菌种质量检验、菌种包装、储存与运输、生产台账与追溯、监督管理及附则等全流程技术要求，明确操作标准与安全注意事项。本规程适用于各类乌天麻萌发菌菌种生产主体（企业、专业合作社、科研机构）的人工菌种生产，涵盖母种、原种、栽培种三个等级的生产过程，兼顾科学性、实用性与规范性，作为乌天麻萌发菌菌种标准化生产、质量管控的依据，与《天麻种植农业投入品使用规范》《天麻固定菌床栽培技术规程》配套执行。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。《中华人民共和国农产品质量安全法》《中华人民共和国农药管理条例》《中华人民共和国肥料登记管理办法》《农产品质量安全农药使用规范》（NY/T393-2020）《农产品质量安全肥料使用规范》（NY/T394-2013）《药用植物及制剂外经贸绿色行业标准》（WM/T2-2004）《天麻生产技术规程》（LY/T2584-2016）《食用菌菌种管理办法》《食用菌菌种生产技术规程》（NY/T528-2010）3术语和定义3.1乌天麻萌发菌特指与乌天麻种籽共生，能促进乌天麻种籽萌发，形成原生球茎，并为原生球茎初期生长提供营养，且对乌天麻生长无危害、共生性强的有益真菌（主要为紫萁小菇、石斛小菇等），是乌天麻有性繁殖的核心菌种，其活性直接决定乌天麻种籽发芽率和幼苗成活率。3.2母种又称一级种，是乌天麻萌发菌菌种的原始种源，通过野生菌株分离纯化、人工选育或引进合格菌株获得，纯度高、活性强、无杂菌、无病虫害，用于原种的扩大培养，是菌种生产的基础。3.3原种又称二级种，以母种为种源，接种到适宜的固体培养基上扩大培养而成，菌丝浓密、活力旺盛、无杂菌污染，用于栽培种的生产，起到菌种扩繁、保持菌种特性的作用。3.4栽培种又称三级种，以原种为种源，接种到规模化生产的固体培养基上扩大培养而成，菌丝布满培养基、活力稳定，直接用于乌天麻种籽拌种或播种，是生产上应用最广泛的菌种等级。3.5菌种分离与纯化从健康的乌天麻原生球茎、野生共生菌株或合格菌种中，通过组织分离、孢子分离等方法获得萌发菌菌株，再经多次培养、筛选，去除杂菌和变异菌株，获得纯度高、性状稳定的单一菌株的过程，是保证菌种质量的核心环节。3.6菌种扩大培养将纯化后的母种，逐步接种到不同规格、不同配方的培养基上，在适宜的温湿度、通风等条件下培养，使菌丝数量快速增加、活力保持稳定，实现菌种从母种到原种、再到栽培种的规模化扩繁过程，需严格控制污染，保持菌种优良性状。3.7菌种活力指乌天麻萌发菌菌丝的生长速度、浓密程度、抗逆性及与乌天麻种籽共生萌发的能力，是衡量菌种质量的关键指标，活力强的菌种能快速促进乌天麻种籽萌发，提高幼苗成活率。4生产总则4.1核心原则遵循“品种纯正、无菌操作、循序渐进、质效并重”的原则，优先选用适配乌天麻生长、共生性强的优良萌发菌菌株，严格执行无菌生产规范，杜绝杂菌污染；优先采用绿色、生态的生产材料和技术，严格按照《天麻种植农业投入品使用规范》选用培养基原料、消毒用品等投入品，杜绝禁限用物质使用，兼顾菌种产量与质量，保护生产区域生态环境。4.2责任要求菌种生产主体对乌天麻萌发菌菌种生产全流程负主体责任，严格按照本规程操作，建立菌种生产技术台账，如实记录菌株来源、培养基制备、菌种分离、扩繁、检验、包装、储存、运输等相关信息，接受监管部门和社会监督，确保菌种质量可追溯。生产操作人员需经专业培训，熟练掌握乌天麻萌发菌菌种分离、纯化、扩繁、无菌操作、质量检验等核心技术，了解投入品规范使用要求，持证上岗，避免违规操作导致菌种污染、活力下降或性状变异。监管部门、行业协会应加强对菌种生产技术的指导和监督，普及标准化生产知识，定期开展菌种质量抽查，查处违法违规生产、销售不合格菌种的行为，规范菌种生产市场秩序。4.3基本要求菌种生产全过程使用的菌株、培养基原料、消毒用品、包装材料等，需符合国家相关标准和本规程、《天麻种植农业投入品使用规范》要求，具备相应资质证明，严禁使用无资质、过期、变质、污染的材料，确保菌种生产安全。菌种分离、纯化、扩繁、培养等操作需在无菌环境下进行，严格控制生产环境的温湿度、通风、光照等条件，避免杂菌污染和菌种性状变异；生产区域需与生活区域、其他微生物生产区域严格分离，防止交叉污染。建立菌种质量检验体系，对母种、原种、栽培种进行全程质量检验，不合格菌种严禁出厂、销售和使用；建立菌种召回机制，对已出厂的不合格菌种，及时召回并妥善处置，防止危害乌天麻生产。5生产环境与设施5.1生产区域选址菌种生产场地需选择地势平缓、通风透气、排水良好、环境整洁的区域，远离工业污染、生活垃圾污染、水源污染区域，距离公路、工厂、养殖场等污染源不少于500米，避免粉尘、污水、有害气体等污染。生产场地需远离其他食用菌菌种生产场地、农作物种植区域，防止不同菌种交叉污染；场地周边无杂草丛生、无腐烂杂物堆积，减少杂菌滋生源头。5.2生产设施布局生产设施需按照“无菌操作、流程顺畅、分区明确、防止污染”的原则布局，划分以下功能区域，各区域独立设置，避免交叉污染：菌株分离与纯化室：用于乌天麻萌发菌菌株的分离、纯化、复壮，配备无菌操作台、培养箱、显微镜等设备，保持高度无菌环境。培养基制备室：用于母种、原种、栽培种培养基的配制、分装、灭菌，配备搅拌机、分装器、高压蒸汽灭菌锅等设备，地面需防水、防滑、易清洁。菌种培养室：用于母种、原种、栽培种的培养，配备恒温培养箱、培养架、控温、控湿、通风设备，确保培养环境稳定，可根据菌种等级划分不同培养区域。质量检验室：用于菌种质量检验，配备显微镜、培养箱、无菌操作台、天平、灭菌设备等，用于菌种纯度、活力、杂菌检测等。包装与储存室：用于菌种的包装、临时储存，包装区域需洁净、无菌，储存区域需干燥、通风、阴凉、避光，配备控温、防潮、防虫设备。废弃物处理区：用于生产过程中产生的废弃培养基、污染菌种、废弃包装材料等的集中存放和处置，远离生产区域，防止污染环境和菌种。5.3生产设施要求5.3.1无菌设施分离纯化室、培养基分装区域、菌种接种区域需配备无菌操作台（垂直流或水平流），无菌操作台需定期消毒、检测，确保无菌效果；室内需安装紫外线消毒灯、空气净化器，定期对空气进行消毒。无菌区域的门窗需密封良好，采用防尘、防菌材质，进入无菌区域需更换专用工作服、工作鞋、帽子、口罩，洗手消毒后进入，严禁非操作人员进入。5.3.2培养设施母种培养采用恒温培养箱，温度可调节范围为15-30℃，精度±1℃，具备控温、保湿、通风功能，定期校准温度，确保培养温度稳定。原种、栽培种培养采用培养架，培养架高度适宜，便于操作和通风；培养室配备控温设备（暖气、空调、加热管等）、控湿设备（加湿器、除湿机等）、通风设备（排风扇、通风管道等），温度可控制在20-25℃，相对湿度控制在60%-70%，通风良好，无直射光照。5.3.3灭菌设施培养基、接种工具、包装材料等灭菌采用高压蒸汽灭菌锅，压力可调节范围为0.10-0.15MPa，温度可调节范围为121-126℃，具备自动控压、控温、计时功能，容积适配生产规模，定期检修、校准，确保灭菌效果。小型接种工具（接种针、接种环、镊子等）可采用干热灭菌箱灭菌，温度控制在160-180℃，灭菌时间不少于2小时；无菌区域空气消毒采用紫外线消毒灯，波长254nm，功率不低于30W，每10平方米至少安装1盏，消毒时间不少于30分钟。5.3.4检验与其他设施质量检验室配备显微镜（放大倍数不低于1000倍）、恒温培养箱、无菌操作台、电子天平（精度0.01g）、pH计、灭菌锅等设备，用于菌种纯度检测、菌丝活力观察、杂菌鉴定等。包装区域配备包装机、电子秤、封口机等设备，包装材料需符合无菌、无毒、透气、防潮要求；储存室配备货架、控温设备（温度可控制在0-10℃）、防潮设备（除湿机）、防虫设备（防虫网、粘虫板），避免菌种受潮、霉变、虫蛀。5.4环境消毒与维护生产区域每天进行清洁，清除杂物、灰尘，地面、墙面、设备表面定期用低毒、无残留的消毒用品（如75%酒精、多菌灵溶液等）擦拭消毒；无菌区域每周进行一次彻底消毒，消毒后通风30分钟以上，方可进行操作。生产设施（无菌操作台、培养箱、灭菌锅、接种工具等）定期进行清洁、消毒、检修，无菌操作台每次使用前消毒30分钟，使用后及时清洁；灭菌锅每次使用后清理锅内水垢，定期进行压力、温度校准。生产区域周边定期清理杂草、腐烂杂物，喷洒消毒用品，减少杂菌滋生；废弃物处理区的废弃材料及时清运、消毒，严禁随意堆放，防止污染环境和生产区域。6培养基制备6.1培养基制备原则培养基制备需遵循“营养均衡、适配萌发菌生长、无菌无毒、成本合理”的原则，根据乌天麻萌发菌的营养需求，选择适宜的原料，合理搭配配方，确保培养基营养充足，能促进菌丝快速生长、保持菌种活力；制备过程严格执行无菌操作，避免杂菌污染。6.2原料选择与要求碳源原料：选用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、阔叶树锯末（青冈、板栗、桦树等）、玉米芯（粉碎）、麦麸、米糠等，要求干净、无杂菌、无病虫害、无霉变、无异味，其中锯末需提前晾晒5-7天，消毒杀菌，去除挥发性物质。氮源原料：选用蛋白胨、酵母膏、黄豆粉（粉碎）、花生饼粉、尿素等，要求纯度高、无杂菌、无霉变，其中黄豆粉、花生饼粉需提前粉碎、晾晒，消毒杀菌，避免带入杂菌。矿物质原料：选用磷酸二氢钾、硫酸镁、碳酸钙、石膏等，要求纯度高、无杂质、无霉变，用于补充培养基中的矿物质元素，调节培养基pH值，促进菌丝生长。其他原料：琼脂（用于母种固体培养基），要求凝固性好、无杂菌、无霉变；消毒用品（多菌灵、高锰酸钾、75%酒精等），符合《天麻种植农业投入品使用规范》要求，低毒、无残留。水源：选用清洁、无污染的自来水、井水或蒸馏水，pH值在5.5-7.0，避免使用污水、含重金属的水。6.3培养基配方（适宜乌天麻萌发菌）6.3.1母种培养基（固体）配方1（常用）：葡萄糖20g、蛋白胨10g、酵母膏5g、琼脂20g、磷酸二氢钾2g、硫酸镁1g、蒸馏水1000mL，pH值5.8-6.2。配方2（备用）：蔗糖20g、黄豆粉15g、琼脂20g、磷酸二氢钾2g、硫酸镁1g、碳酸钙3g、蒸馏水1000mL，pH值5.8-6.2。6.3.2原种培养基（固体）配方1（常用）：阔叶树锯末70%、麦麸20%、蔗糖2%、黄豆粉5%、磷酸二氢钾0.2%、硫酸镁0.1%、石膏1.7%、水适量，含水量60%-65%（手握成团、松开即散），pH值5.8-6.2。配方2（备用）：玉米芯（粉碎）60%、米糠25%、麦麸10%、蔗糖2%、磷酸二氢钾0.2%、硫酸镁0.1%、石膏2.7%、水适量，含水量60%-65%，pH值5.8-6.2。6.3.3栽培种培养基（固体）配方1（常用）：阔叶树锯末75%、麦麸15%、蔗糖1%、黄豆粉6%、磷酸二氢钾0.1%、硫酸镁0.1%、石膏2.8%、水适量，含水量60%-65%，pH值5.8-6.2。配方2（备用）：玉米芯（粉碎）65%、麦麸20%、米糠8%、蔗糖1%、磷酸二氢钾0.1%、硫酸镁0.1%、石膏5.8%、水适量，含水量60%-65%，pH值5.8-6.2。6.4培养基制备步骤6.4.1母种培养基制备配料：按照配方比例，准确称量各原料，将葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、磷酸二氢钾、硫酸镁等可溶性原料溶于适量蒸馏水中，搅拌均匀，确保完全溶解；琼脂单独放入另一容器中，加入剩余蒸馏水，浸泡30分钟，使其充分软化。融胶：将浸泡软化的琼脂置于酒精灯或电磁炉上加热，不断搅拌，直至琼脂完全融化，避免局部过热烧焦；然后将溶解好的可溶性原料溶液倒入琼脂溶液中，搅拌均匀，补充蒸馏水至1000mL。调pH值：用pH计检测培养基pH值，若pH值偏高，用盐酸溶液调节；若偏低，用氢氧化钠溶液调节，直至pH值达到5.8-6.2。分装：将配制好的培养基趁热分装到试管中，分装量为试管容积的1/5-1/4，分装过程中避免培养基沾到试管口和管壁，防止污染；分装后，及时塞紧试管塞（硅胶塞或棉塞），棉塞需松紧适度，既能透气，又能防止杂菌进入。灭菌：将分装好的试管放入高压蒸汽灭菌锅中，压力调至0.11-0.12MPa，温度121℃，灭菌20分钟；灭菌结束后，缓慢排气，待锅内压力降至常压后，打开锅盖，取出试管。摆斜面：将取出的试管趁热摆成斜面，斜面长度为试管长度的1/2-2/3，放置在洁净、平整的桌面上，自然冷却至凝固，凝固后即为母种斜面培养基；冷却后，放入恒温培养箱中，30℃培养24小时，检查无杂菌污染后，备用。6.4.2原种、栽培种培养基制备配料：按照配方比例，准确称量各原料，将锯末、麦麸、玉米芯、黄豆粉等固体原料放入搅拌机中，搅拌均匀；将蔗糖、磷酸二氢钾、硫酸镁等可溶性原料溶于适量水中，搅拌均匀，倒入固体原料中，边倒边搅拌，确保原料混合均匀。调含水量与pH值：加入适量水，不断搅拌，调节培养基含水量至60%-65%（手握成团、松开即散，指缝间有少量水珠渗出，不滴水）；用pH计检测pH值，调节至5.8-6.2，若pH值偏高，加入少量盐酸溶液；若偏低，加入少量碳酸钙调节。堆积发酵（可选）：将配制好的培养基堆积成高30-40cm、宽50-60cm的堆，盖上塑料薄膜，自然发酵2-3天，每天翻堆1次，调节温度至25-30℃，促进原料腐熟，杀灭部分杂菌；发酵结束后，摊开晾晒1-2小时，冷却至室温。分装：将冷却后的培养基分装到培养瓶（玻璃瓶或聚丙烯瓶）或菌袋中，分装量为培养瓶（菌袋）容积的2/3，分装过程中避免培养基沾到瓶口（袋口），分装后，轻轻压实，使培养基质地均匀、疏松透气。封口：培养瓶用硅胶塞或棉塞封口，棉塞需包裹一层纱布，防止杂菌进入；菌袋用封口机封口，或用绳子扎紧，封口处需平整、严密，确保无菌。灭菌：将分装好的培养瓶（菌袋）放入高压蒸汽灭菌锅中，原种培养基灭菌压力0.12-0.13MPa，温度121-123℃，灭菌30分钟；栽培种培养基灭菌压力0.11-0.12MPa，温度121℃，灭菌25-30分钟；灭菌结束后，缓慢排气，待锅内压力降至常压后，打开锅盖，取出培养瓶（菌袋），放置在洁净、通风的地方，自然冷却至室温，备用。无菌检查：冷却后的培养基，放入恒温培养箱中，25℃培养24-48小时，检查无杂菌污染（培养基表面无霉菌、细菌生长，无异味）后，方可用于接种。6.5培养基制备注意事项原料称量需准确，尤其是营养物质和矿物质原料，避免比例失衡影响菌丝生长；可溶性原料需充分溶解，避免结块，影响培养基营养均匀性。琼脂加热融胶时，需不断搅拌，避免局部过热烧焦，影响培养基凝固性；培养基分装需趁热进行，避免琼脂凝固，无法分装。灭菌过程中，严格控制压力、温度和时间，确保灭菌彻底；灭菌结束后，缓慢排气，避免试管、培养瓶（菌袋）因压力骤变破裂。冷却后的培养基需及时进行无菌检查，发现杂菌污染的，立即丢弃，严禁使用；培养基存放时间不宜过长，母种培养基存放不超过7天，原种、栽培种培养基存放不超过3天，避免杂菌污染和营养流失。7菌种分离与纯化7.1分离材料选择优先选择健康、无病虫害、共生性强的乌天麻原生球茎（播种后1-2个月，直径0.5-1cm，色泽洁白、饱满）作为分离材料，原生球茎需来自正规乌天麻繁育基地，确保菌株适配性。也可选择野生乌天麻共生的萌发菌菌株（如紫萁小菇、石斛小菇），或引进的合格乌天麻萌发菌菌株，引进菌株需具备菌株质量检验合格证明、品种鉴定报告等资质。分离材料需新鲜，采集后及时进行分离操作，常温下存放不超过24小时，存放时置于阴凉、通风、无菌处，避免霉变、污染。7.2分离方法（常用组织分离法）分离前准备：将分离材料、接种工具（接种针、镊子、剪刀）、母种培养基试管、无菌操作台等进行彻底消毒；操作人员更换专用工作服、工作鞋、帽子、口罩，洗手消毒后，进入无菌操作台操作。材料消毒：将采集的乌天麻原生球茎用清水轻轻冲洗干净，去除表面土壤、杂物，然后放入75%酒精溶液中浸泡30秒，消毒表面；再放入0.1%高锰酸钾溶液中浸泡5-10分钟，彻底消毒；最后用无菌蒸馏水冲洗3-4次，去除残留的消毒药液，用无菌滤纸吸干表面水分。组织切块：在无菌操作台下，用无菌剪刀、镊子将消毒后的原生球茎切开，选取内部洁白、饱满、无病斑、无损伤的组织块，切成0.3-0.5cm的小块，避免损伤组织细胞。接种培养：用无菌接种针将切好的组织块接种到母种斜面培养基上，每个试管接种1-2块组织块，接种时避免组织块沾到试管口和管壁，接种后，轻轻按压组织块，使其与培养基紧密接触；接种完成后，塞紧试管塞，标记分离日期、材料来源、菌株名称等信息，放入恒温培养箱中，22-25℃恒温培养，避光培养，避免光照影响菌丝生长。7.3菌种纯化初次纯化：组织块接种培养3-5天后，观察菌丝生长情况，当菌丝从组织块上萌发，长出白色、纤细的菌丝时，及时挑选菌丝生长旺盛、无杂菌污染的试管，在无菌操作台下，用无菌接种针挑取少量健壮的菌丝，接种到新的母种斜面培养基上，22-25℃恒温培养，避光培养。二次纯化：重复初次纯化操作，将挑取的菌丝再次接种到新的母种斜面培养基上，培养3-5天，观察菌丝生长情况，去除杂菌污染、菌丝细弱、生长缓慢的试管，保留菌丝洁白、浓密、生长旺盛、无杂菌的试管，直至获得纯度高、性状稳定的单一菌株，即为母种原始菌株。纯化检查：纯化后的母种，放入恒温培养箱中，22-25℃培养7-10天，用显微镜观察菌丝形态，确保菌丝形态一致、无杂菌（无细菌、霉菌等其他微生物），同时记录菌丝生长速度、浓密程度等性状，筛选出活力强、共生性好的母种菌株。7.4菌种复壮为保持乌天麻萌发菌菌种的优良性状和活力，避免菌种退化，需定期对母种进行复壮，复壮周期不超过6个月，复壮方法如下：选取活力强、无杂菌、性状稳定的母种菌株，接种到新的母种斜面培养基上，22-25℃恒温培养7-10天，促进菌丝快速生长。将复壮后的母种菌株，接种到原种培养基上，扩大培养，获得原种；也可再次通过组织分离法，从健康的乌天麻原生球茎中分离菌株，与现有母种菌株进行对比，筛选出优良菌株，实现复壮。7.5分离与纯化注意事项分离与纯化全过程需严格执行无菌操作，接种工具、培养基、分离材料等需彻底消毒，避免杂菌污染，确保获得纯净的菌株。组织块切割需精细，避免损伤组织细胞，影响菌丝萌发；接种时，组织块与培养基需紧密接触，促进菌丝快速生长。培养过程中，定期观察菌丝生长情况，及时去除杂菌污染、菌丝退化的试管，避免杂菌扩散和菌种退化。纯化后的母种，需单独存放，标记清晰，避免与其他菌种混淆；复壮后的母种，需进行质量检验，合格后方可用于原种生产。8菌种扩大培养8.1扩大培养原则菌种扩大培养需遵循“循序渐进、无菌操作、保持性状、控制污染”的原则，从母种到原种、再到栽培种，逐步扩大培养规模，严格控制培养条件，确保菌丝生长旺盛、活力稳定，保持乌天麻萌发菌的优良性状，杜绝杂菌污染和菌种退化。8.2母种扩大培养（用于原种接种）接种前准备：选择纯度高、活力强、无杂菌、性状稳定的母种菌株和合格的母种斜面培养基；将接种工具（接种针、镊子）、无菌操作台、培养箱等进行彻底消毒；操作人员做好无菌防护，进入无菌操作台操作。接种：在无菌操作台下，用无菌接种针挑取母种斜面上健壮的菌丝（带少量培养基），接种到新的母种斜面培养基上，每个母种试管可接种3-5个新的试管，接种时避免菌丝断裂，接种后，轻轻按压菌丝，使其与培养基紧密接触；接种完成后，塞紧试管塞，标记接种日期、母种编号、菌株名称等信息。培养：将接种后的母种试管放入恒温培养箱中，22-25℃恒温培养，避光培养，培养期间，定期观察菌丝生长情况，保持培养箱通风、湿度适宜（相对湿度60%-70%）；培养7-10天，当菌丝布满培养基斜面，菌丝洁白、浓密、活力旺盛，无杂菌污染时，即为扩大培养后的母种，可用于原种接种。8.3原种扩大培养（用于栽培种接种）接种前准备：选择合格的母种（扩大培养后的母种）和原种培养基（冷却至室温、无杂菌污染）；将接种工具、无菌操作台、培养室等进行彻底消毒；操作人员做好无菌防护，进入无菌操作台操作。接种：在无菌操作台下，用无菌接种针挑取母种斜面上健壮的菌丝（带少量培养基），接种到原种培养基中，每个母种试管可接种3-5个原种培养瓶（菌袋），接种量为原种培养基重量的5%-8%；接种时，将菌丝均匀分布在培养基表面，轻轻按压，使其与培养基紧密接触；接种完成后，及时封口，标记接种日期、母种编号、原种编号等信息。培养：将接种后的原种培养瓶（菌袋）放入培养室中，摆放整齐，保持培养室温度22-25℃，相对湿度60%-70%，通风良好，避光培养；培养期间，定期观察菌丝生长情况，每天通风1-2次，每次30分钟，避免杂菌污染；培养15-20天，当菌丝布满整个培养基，菌丝洁白、浓密、活力旺盛，无杂菌污染、无异味时，即为合格原种，可用于栽培种接种。8.4栽培种扩大培养（用于生产应用）接种前准备：选择合格的原种和栽培种培养基（冷却至室温、无杂菌污染）；将接种工具、无菌操作台、培养室等进行彻底消毒；操作人员做好无菌防护，进入无菌操作台操作；规模化生产时，可采用接种机接种，提高接种效率，确保接种均匀。接种：在无菌操作台下，用无菌接种针或接种铲，挑取原种培养基中健壮的菌丝（带少量培养基），接种到栽培种培养基中，每个原种培养瓶可接种10-15个栽培种培养瓶（菌袋），接种量为栽培种培养基重量的8%-10%；接种时，将菌丝均匀分布在培养基表面和内部，轻轻压实，使其与培养基紧密接触；接种完成后，及时封口，标记接种日期、原种编号、栽培种编号、生产批次等信息。培养：将接种后的栽培种培养瓶（菌袋）放入培养室中，摆放整齐，保持培养室温度22-25℃，相对湿度60%-70%，通风良好，避光培养；培养期间，定期观察菌丝生长情况，每天通风1-2次，每次30-60分钟，及时清除杂菌污染的培养瓶（菌袋），避免杂菌扩散；培养20-25天，当菌丝布满整个培养基，菌丝洁白、浓密、活力旺盛，无杂菌污染、无异味，触摸有韧性时，即为合格栽培种，可用于乌天麻种籽拌种或播种。8.5扩大培养注意事项接种过程严格执行无菌操作，接种工具需彻底灭菌，接种时避免菌丝暴露在空气中时间过长，防止杂菌污染和菌丝活力下降。培养过程中，严格控制温湿度、通风、光照等条件，温度过高（高于28℃）易导致菌丝老化、杂菌滋生；温度过低（低于20℃）易导致菌丝生长缓慢；通风不良易导致杂菌污染，影响菌种质量。定期观察菌丝生长情况，及时去除杂菌污染、菌丝细弱、生长缓慢的菌种，避免杂菌扩散和菌种退化；接种后，做好标记，便于追溯和管理。菌种扩大培养的代数不宜过多，母种扩大培养不超过3代，原种扩大培养不超过1代，栽培种直接用于生产，避免代数过多导致菌种退化，影响与乌天麻种籽的共生效果。9菌种质量检验9.1检验原则遵循“全程检验、严格标准、客观公正、及时处置”的原则，对母种、原种、栽培种进行产前、产中、产后全程检验，检验项目、检验标准符合本规程要求，不合格菌种严禁出厂、销售和使用，确保菌种质量达标，能满足乌天麻种籽萌发需求。9.2检验项目与标准9.2.1母种质量检验纯度检验：无杂菌污染，显微镜下观察，菌丝形态一致，无细菌、霉菌、酵母菌等其他微生物；培养基表面无绿色、黑色、黄色等杂菌菌落，无异味。活力检验：菌丝洁白、纤细、浓密，生长旺盛，生长速度正常（22-25℃培养，每天生长0.5-1cm）；菌丝触摸有韧性，无褐变、无萎缩、无腐烂。性状检验：菌丝形态符合乌天麻萌发菌（如紫萁小菇、石斛小菇）的典型特征，无变异；与乌天麻种籽共生性强，接种到种籽上，能促进种籽快速萌发（萌发率不低于80%）。9.2.2原种质量检验纯度检验：无杂菌污染，培养基表面和内部无杂菌菌落，无异味；显微镜下观察，菌丝形态一致，无其他微生物。活力检验：菌丝洁白、浓密、健壮，生长均匀，布满整个培养基；菌丝活力旺盛，触摸有韧性，无褐变、无萎缩、无腐烂；22-25℃培养，15-20天内菌丝布满培养基。性状检验：菌丝形态稳定，符合乌天麻萌发菌的典型特征，无变异；接种到栽培种培养基上，能快速生长，菌丝蔓延速度正常。9.2.3栽培种质量检验纯度检验：无杂菌污染，培养基表面和内部无杂菌菌落，无异味；显微镜下观察，菌丝形态一致，无其他微生物；规模化生产时，抽样检验，杂菌污染率不超过1%。活力检验：菌丝洁白、浓密、健壮，生长均匀，布满整个培养基；菌丝活力旺盛，触摸有韧性，无褐变、无萎缩、无腐烂；22-25℃培养，20-25天内菌丝布满培养基。性状检验：菌丝形态稳定，符合乌天麻萌发菌的典型特征，无变异；与乌天麻种籽共生性强，拌种后，种籽萌发率不低于75%，能促进原生球茎正常生长。外观检验：培养瓶（菌袋）无破损、无泄漏，封口严密；培养基质地均匀、疏松透气，含水量适宜（60%-65%），无结块、无霉变。9.3检验方法9.3.1外观检验肉眼观察菌种的外观、菌丝生长情况、培养基状态，检查有无杂菌菌落、异味、菌丝褐变、萎缩、腐烂等情况；检查培养瓶（菌袋）有无破损、泄漏，封口是否严密。9.3.2显微镜检验取少量菌丝，置于显微镜下（放大倍数不低于1000倍），观察菌丝形态、结构，检查有无杂菌（细菌、霉菌等），判断菌丝是否正常、有无变异。9.3.3培养检验选取少量菌种，接种到新的相应等级培养基上，22-25℃恒温培养，观察菌丝生长速度、浓密程度、活力情况，检查有无杂菌污染，判断菌种质量。9.3.4共生性检验取少量栽培种，与乌天麻种籽混合拌匀，播种到无菌腐殖土中，22-25℃恒温、避光培养，观察种籽萌发情况，计算萌发率，萌发率不低于75%即为合格，判断菌种与乌天麻种籽的共生性。9.4检验批次与抽样检验批次：以同一菌株、同一培养基配方、同一灭菌批次、同一培养条件生产的菌种为一个检验批次，每个批次单独检验。抽样方法：每个检验批次，随机抽样，母种每批次抽样不少于5支，原种每批次抽样不少于10瓶（袋），栽培种每批次抽样不少于20瓶（袋），抽样需具有代表性，抽样后，及时标记抽样批次、抽样时间、抽样数量等信息。9.5检验结果处理检验合格的菌种：出具菌种质量检验合格证明，标注菌种等级、菌株名称、生产批次、检验日期、检验结果等信息，方可出厂、销售和使用。检验不合格的菌种：立即隔离存放，标记不合格原因（杂菌污染、活力不足、性状变异等），严禁出厂、销售和使用；不合格菌种需及时妥善处置（高温灭菌后深埋或焚烧），防止杂菌扩散和污染环境。检验记录：做好菌种质量检验记录，如实记录检验批次、抽样信息、检验项目、检验结果、不合格原因、处置情况等信息，留存备查，检验记录留存期限不少于5年。10菌种包装、储存与运输10.1菌种包装10.1.1包装材料要求母种包装：采用无菌、透明的玻璃试管，试管口用硅胶塞或棉塞封口，棉塞需包裹一层纱布，外层用parafilm膜缠绕密封，防止杂菌进入和水分流失；试管外套上标签，标注菌种等级、菌株名称、母种编号、分离/接种日期、生产单位、保质期等信息。原种、栽培种包装：采用无菌、透气、防潮、不易破损的玻璃瓶或聚丙烯菌袋，瓶口（袋口）用硅胶塞、棉塞或封口机封口，封口严密；包装容器外标注菌种等级、菌株名称、生产批次、接种日期、保质期、生产单位、联系方式等信息，标签清晰、牢固，不易脱落。包装材料需符合无菌、无毒、环保要求，无异味、无污染，严禁使用破损、污染、过期的包装材料。10.1.2包装操作要求包装操作需在洁净、无菌的环境中进行，操作人员做好无菌防护，避免包装过程中杂菌污染菌种。包装前，再次检查菌种质量，确保菌种合格；包装时，动作轻柔，避免损伤菌丝和包装容器，确保封口严密，防止水分流失和杂菌进入。每个包装容器内的菌种量需均匀，标注信息完整、清晰，便于识别和追溯；包装完成后，将菌种整齐摆放，避免挤压、碰撞。10.2菌种储存10.2.1储存条件母种储存：储存于温度0-5℃、相对湿度50%-60%、干燥、通风、阴凉、避光的储存室中，可放入冰箱冷藏储存；储存期间，保持温度稳定，避免温度波动过大，避免潮湿、光照和杂