枸杞干果中苦参碱和氧化苦参碱残留量的测定 液相色谱-串联质谱法

枸杞干果中苦参碱和氧化苦参碱残留量的测定液相色谱-串联质谱法1范围本规程规定了枸杞干果中苦参碱（matrine）和氧化苦参碱（oxymatrine）残留量的液相色谱-串联质谱测定方法。本规程适用于枸杞干果中苦参碱和氧化苦参碱残留量的定性鉴别和定量测定，其中苦参碱方法检出限为0.002mg/kg，定量限为0.005mg/kg；氧化苦参碱方法检出限为0.003mg/kg，定量限为0.01mg/kg。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有修改单）适用于本文件。GB2763食品安全国家标准食品中农药最大残留限量GB2760食品安全国家标准食品添加剂使用标准GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T27404实验室质量控制规范食品理化检测NY/T761蔬菜和水果中有机磷、有机氯、拟除虫菊酯和氨基甲酸酯类农药多残留的测定GB/T8855新鲜水果和蔬菜取样方法3原理试样中的苦参碱和氧化苦参碱经甲醇-盐酸溶液提取，固相萃取柱净化去除基质干扰后，采用液相色谱-串联质谱仪进行分离和检测，外标法定量。利用两种化合物各自的保留时间和特征离子对进行定性鉴别，根据峰面积与浓度的线性关系，分别计算两者的残留量。苦参碱与氧化苦参碱基本信息：①苦参碱：分子式C15H24N2O，分子量248.36，CAS号519-02-8；②氧化苦参碱：分子式C15H24N2O2，分子量264.36，CAS号16837-52-8。两者均具有特定的母离子和子离子特征，可通过优化质谱条件实现精准分离与检测，有效规避基质干扰。4试剂与材料除非另有说明，所用试剂均为分析纯或色谱纯，实验用水符合GB/T6682中一级水的规定。4.1试剂甲醇（CH3OH）：色谱纯。乙腈（CH3CN）：色谱纯。盐酸（HCl）：分析纯，浓度36%-38%。氨水（NH3·H2O）：分析纯，浓度25%-28%。氯化钠（NaCl）：分析纯，60℃烘干2h，冷却后备用。无水硫酸镁（MgSO4）：分析纯，60℃烘干4h，冷却后备用。苦参碱标准品：纯度≥98.0%，编号、生产厂家及有效期清晰可追溯。氧化苦参碱标准品：纯度≥98.0%，编号、生产厂家及有效期清晰可追溯。盐酸-甲醇溶液（0.1+99.9，v/v）：量取0.1mL盐酸，缓慢加入99.9mL甲醇中，混匀备用，现配现用。氨水-甲醇溶液（5+95，v/v）：量取5mL氨水，加入95mL甲醇中，混匀备用，密封保存。甲醇-水溶液（40+60，v/v）：量取40mL甲醇，加入60mL一级水，混匀备用。4.2标准溶液配制单标储备液（1000μg/mL）：分别准确称取0.0100g苦参碱、氧化苦参碱标准品，各自置于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，置于-18℃冰箱中避光保存，有效期6个月。混合标准中间液（10μg/mL）：准确吸取1.00mL苦参碱、1.00mL氧化苦参碱单标储备液，共同置于100mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，置于4℃冰箱中避光保存，有效期1个月。混合标准工作液：准确吸取适量混合标准中间液，用甲醇-水溶液（40+60，v/v）逐级稀释成浓度为0.005、0.01、0.02、0.05、0.10、0.20μg/mL的混合标准工作液（其中苦参碱浓度涵盖自身定量限，氧化苦参碱浓度同步匹配），现配现用。4.3材料与耗材固相萃取柱：MCX柱（60mg/3mL）或同等性能阳离子交换固相萃取柱，使用前用5mL甲醇和5mL一级水活化。离心管：50mL，聚四氟乙烯材质，耐有机溶剂和酸性试剂。滤膜：0.22μm，有机相针式滤器。研磨机：高速组织研磨机，转速可调节，避免样品发热。离心管：10mL，刻度离心管，耐有机溶剂。移液枪头：1mL、5mL，无酶无杂质，适配移液器。5仪器与设备液相色谱-串联质谱仪（LC-MS/MS）：配备电喷雾离子源（ESI）。高速冷冻离心机：转速≥8000r/min，温度可调控（0-40℃）。高速组织研磨机：转速≥20000r/min，可配备低温研磨功能。电子天平：精度0.1mg（用于标准品称量）和0.001g（用于试样称量）。超声波清洗器：功率≥200W，频率40kHz，可调控温度。氮吹仪：可控温（室温-80℃），氮气纯度≥99.99%，气流可调节。移液器：1mL、5mL、10mL，精度符合A级要求，定期校准。容量瓶：10mL、50mL、100mL，玻璃材质，校准合格，无破损。涡旋振荡器：转速可调节（0-3000r/min），振荡均匀无渗漏。烘箱：可调控温度（室温-200℃），用于试剂烘干和耗材干燥。固相萃取装置：负压可调节（0-0.1MPa），可同时处理多根固相萃取柱。6试样制备与保存6.1试样制备取样：按照GB/T8855的规定，随机抽取代表性枸杞干果试样，取样量不少于1kg，去除杂质、破损粒和霉变粒，充分混匀。粉碎：将混匀后的试样放入高速组织研磨机中，粉碎至均匀粉末（过40目筛），粉碎过程中避免样品发热导致苦参碱、氧化苦参碱降解，粉碎后立即装入洁净的密封容器中，做好标记（注明试样名称、取样日期、制备日期）。分样：将粉碎后的试样分成两份，一份用于检测，一份作为留样，留样量不少于200g，密封保存。6.2试样保存制备好的试样应置于4℃冰箱中避光保存，检测试样应在24h内完成提取，避免长时间存放导致目标物降解；留样保存期不少于6个月，保存过程中应防止样品受潮、污染和目标物残留降解，留样容器应密封完好，标签信息完整。7分析步骤7.1提取准确称取5.00g（精确至0.001g）粉碎后的枸杞干果试样，置于50mL离心管中，加入20mL盐酸-甲醇溶液（0.1+99.9，v/v），涡旋振荡5min，使试样充分浸润，避免试样结块。将离心管放入超声波清洗器中，超声提取20min（温度控制在25±2℃），期间每隔5min涡旋振荡1次，确保苦参碱和氧化苦参碱充分提取。提取完成后，加入3g氯化钠和5g无水硫酸镁，立即涡旋振荡3min，充分混匀，静置10min，使水相和有机相分层，便于后续离心分离。将离心管放入高速冷冻离心机中，8000r/min、4℃条件下离心10min，吸取上清液10mL，置于另一干净的50mL离心管中，待净化；若上清液浑浊，可再次离心后吸取上清液。7.2净化将活化后的MCX固相萃取柱连接至固相萃取装置，调节负压至0.03-0.05MPa，将待净化的上清液缓慢注入固相萃取柱中，控制流速为1-2mL/min，弃去流出液。用5mL一级水冲洗固相萃取柱，控制流速为1-2mL/min，弃去冲洗液；再用5mL甲醇冲洗固相萃取柱，弃去冲洗液，并用氮吹仪将柱内残留液体吹干（氮气流速不宜过大，避免吹干固相萃取柱填料，影响洗脱效果）。用5mL氨水-甲醇溶液（5+95，v/v）洗脱固相萃取柱，控制流速为1-2mL/min，将洗脱液收集于10mL刻度离心管中，洗脱过程中确保洗脱液完全收集，无遗漏。将洗脱液置于氮吹仪中，40℃水浴加热，氮吹至近干（剩余约0.1mL），避免氮吹过度导致目标物损失，加入1.00mL甲醇-水溶液（40+60，v/v），涡旋振荡1min，充分溶解残渣。将溶解后的溶液过0.22μm有机相滤膜，去除微小杂质，滤液置于进样瓶中，供液相色谱-串联质谱仪检测。7.3空白实验除不加入试样外，其余均按照7.1和7.2的步骤操作，制备空白试样溶液，供检测使用，用于扣除空白干扰；空白实验应与试样检测同步进行，确保实验条件一致。7.4加标回收实验取已知不含苦参碱和氧化苦参碱的枸杞干果试样，分别加入低、中、高三个浓度的混合标准工作液，加标浓度如下：低浓度（苦参碱0.005mg/kg、氧化苦参碱0.01mg/kg，均为各自定量限）、中浓度（苦参碱0.05mg/kg、氧化苦参碱0.05mg/kg）、高浓度（苦参碱0.20mg/kg、氧化苦参碱0.20mg/kg），每个浓度做3个平行样，按照7.1和7.2的步骤操作，计算加标回收率，验证方法的准确性和可靠性。8液相色谱-串联质谱条件8.1液相色谱条件色谱柱：C18色谱柱（100mm×2.1mm，1.8μm）或同等性能反相色谱柱，耐酸性流动相。柱温：30℃，保持恒定，避免温度波动影响分离效果。流动相：A相为甲醇，B相为0.1%甲酸水溶液（v/v），梯度洗脱程序见表1，确保苦参碱与氧化苦参碱完全分离，且与基质杂质有效区分。流速：0.3mL/min，恒定流速，避免流速波动导致峰形畸变。进样量：5μL，进样前确保进样瓶洁净、无气泡。运行时间：12min，确保所有目标物和杂质均能流出。进样方式：自动进样，进样针清洗程序为甲醇-水（1:1，v/v）清洗3次，避免交叉污染。时间（min）甲醇（A相，%）0.1%甲酸水溶液（B相，%）0.040604.070308.070308.1406012.04060表1梯度洗脱程序8.2质谱条件离子源：电喷雾离子源（ESI），正离子模式（ESI+），离子源喷雾稳定。扫描方式：多反应监测（MRM），针对苦参碱和氧化苦参碱分别设置特征离子对监测通道。电离电压（IS）：3200V，根据仪器灵敏度适当调整。雾化气压力（GS1）：344.7kPa（50psi）。气帘气压力（CUR）：137.9kPa（20psi），用于去除杂质离子，提高检测灵敏度。辅助气压力（GS2）：344.7kPa（50psi），辅助雾化，增强离子化效率。离子源温度（TEM）：450℃，避免温度过高导致目标物分解。碰撞气：氩气，纯度≥99.99%，碰撞气压力根据仪器要求调整（通常为0.2-0.3MPa）。苦参碱和氧化苦参碱的特征离子对及质谱参数见表2，其中每种化合物选取2对特征离子对，响应值最高的为定量离子对，另一对为定性离子对。化合物名称母离子（m/z）子离子（m/z）去簇电压（DP，V）碰撞能量（CE，eV）离子类型备注苦参碱249.2148.17022碎片离子定量离子对苦参碱249.2134.17028碎片离子定性离子对氧化苦参碱265.2134.17524碎片离子定量离子对氧化苦参碱265.2148.17530碎片离子定性离子对表2苦参碱和氧化苦参碱的MRM监测参数9定性与定量分析9.1定性鉴别在相同的色谱和质谱条件下，试样溶液中出现的色谱峰保留时间，与混合标准工作液中苦参碱、氧化苦参碱的保留时间偏差应在±2.5%以内。对于试样溶液中检出的苦参碱、氧化苦参碱，其各自的两对特征离子对（定量离子对和定性离子对）的峰面积比，与混合标准工作液中对应化合物的离子对峰面积比偏差应在±15%以内。空白试样溶液中，在苦参碱和氧化苦参碱的保留时间窗口内，不得出现与混合标准工作液中对应的特征离子峰；若出现，应排查试剂、耗材、仪器等环节的污染，重新处理试样并检测。只有同时满足上述两项要求，方可定性判定试样中检出对应化合物。9.2定量分析分别以混合标准工作液中苦参碱、氧化苦参碱的浓度（μg/mL）为横坐标（x），对应定量离子对的峰面积为纵坐标（y），绘制两种化合物各自的标准工作曲线，计算回归方程和相关系数（r）。要求两种化合物的相关系数r均≥0.998，确保线性关系良好。根据试样溶液中苦参碱、氧化苦参碱定量离子对的峰面积，分别代入各自的回归方程，计算出试样溶液中两种化合物的浓度（μg/mL）。按公式（1）分别计算枸杞干果中苦参碱和氧化苦参碱的残留量：X=式中：X——试样中苦参碱（或氧化苦参碱）的残留量，单位为毫克每千克（mg/kg）；C——由标准工作曲线计算得到的试样溶液中苦参碱（或氧化苦参碱）的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；C0——空白试样溶液中苦参碱（或氧化苦参碱）的浓度（若有），单位为微克每毫升（μg/mL）；V——试样溶液的最终定容体积，单位为毫升（mL）（本规程中V=1.00mL）；f——试样的稀释倍数（本规程中f=1）；m——称取试样的质量，单位为克（g）（本规程中m=5.00g）；1000——单位换算系数（将微克每毫升换算为毫克每千克）。计算结果保留三位有效数字，当残留量低于对应化合物的定量限时，报告为“未检出（<定量限）”，例如：苦参碱未检出（<0.005mg/kg）、氧化苦参碱未检出（<0.01mg/kg）。10精密度与准确度10.1精密度同一实验室，由同一操作人员使用同一台仪器，对同一枸杞干果试样（含低、中、高三个浓度，分别对应两种化合物的加标浓度）进行6次平行测定，测定结果的相对标准偏差（RSD）应满足：低浓度（定量限水平）：苦参碱RSD≤20%，氧化苦参碱RSD≤20%；中、高浓度：苦参碱RSD≤15%，氧化苦参碱RSD≤15%。10.2准确度低、中、高三个浓度的加标回收率应满足：苦参碱加标回收率在70%-110%之间，氧化苦参碱加标回收率在70%-110%之间；每个浓度3个平行样的回收率相对标准偏差（RSD）≤15%。11检出限与定量限本方法的检出限（LOD）和定量限（LOQ）基于空白试样加标实验确定：苦参碱：检出限（LOD）为0.002mg/kg，定量限（LOQ）为0.005mg/kg；氧化苦参碱：检出限（LOD）为0.003mg/kg，定量限（LOQ）为0.01mg/kg。检出限定义为空白试样中，信噪比（S/N）=3时对应的化合物浓度；定量限定义为空白试样中，信噪比（S/N）=10时对应的化合物浓度，且该浓度下的加标回收率和精密度符合本规程10章的要求。12质量控制与质量保证12.1试剂与标准品控制所有试剂均应符合本规程规定的纯度要求，实验前应对试剂进行空白验证，确保无苦参碱、氧化苦参碱干扰。标准品应从正规渠道采购，纯度≥98.0%，使用前核对标准品的编号、纯度和有效期，标准溶液配制应严格按照操作规程进行，做好配制记录（注明配制日期、人员、浓度等信息）。标准工作曲线应每次实验重新绘制，若标准工作曲线的相关系数r<0.998，应检查试剂、仪器条件或操作步骤，重新配制标准工作液并绘制曲线。盐酸-甲醇溶液、氨水-甲醇溶液等易挥发试剂，应现配现用或密封保存，避免浓度变化影响实验结果。12.2仪器控制液相色谱-串联质谱仪应定期校准，包括色谱柱分离效率、质谱仪灵敏度、离子源稳定性、质量轴准确性等，校准记录应完整可追溯，校准周期不超过1年。实验前应检查仪器的流动相、氮气、氩气（碰撞气）压力，确保仪器正常运行；实验后应按照仪器操作规程，对色谱柱、离子源、进样系统等进行清洗，延长仪器使用寿命。离心计、电子天平、移液器等仪器，应定期检定或校准，确保精度符合要求；超声波清洗器、氮吹仪等设备，应定期检查运行状态，确保参数稳定。12.3实验过程控制每批试样（不超过20个）应至少设置1个空白试样、1个加标试样（中浓度，同时包含苦参碱和氧化苦参碱），用于监控实验过程中的干扰和回收率。空白试样中不得检出苦参碱和氧化苦参碱，若检出，应排查试剂、耗材、仪器等环节的污染，重新处理试样。加标试样的回收率应在70%-110%之间，若回收率超出范围，应重新进行实验，查找原因（如提取不充分、净化效果不佳、仪器参数异常等）并纠正。每个试样应做2个平行样，平行样测定结果的相对标准偏差应符合本规程10.1的要求，若超出范围，应重新测定该试样。实验过程中应做好详细记录，包括试样信息、试剂使用、仪器参数、实验步骤、测定结果等，确保实验过程可追溯。12.4留样控制留样应妥善保存，标签信息完整（包括试样名称、来源、取样日期、制备日期、检测日期、留样人等），保存期不少于6个月，便于后续复检和追溯；留样应置于4℃冰箱中避光保存，避免目标物降解。13安全与环保要求13.1安全要求实验过程中使用的甲醇、乙腈等有机溶剂具有挥发性和毒性，盐酸、氨水具有腐蚀性，应在通风橱内操作，操作人员应穿戴防护服、耐酸碱手套、防护口罩和护目镜，避免直接接触皮肤、黏膜和吸入蒸汽。苦参碱、氧化苦参碱标准品具有一定毒性，称量时应在通风橱内进行，避免洒落，称量后的废液和废渣应妥善处理，不得随意丢弃。实验仪器应按照操作规程操作，避免违规操作导致仪器损坏或人员受伤；离心操作时，应确保离心管平衡，防止离心管破裂；超声波清洗器操作时，避免打开盖子近距离接触超声区域。实验室应配备消防器材、急救药品（如中和剂、消毒棉、碘伏等），操作人员应熟悉消防器材和急救药品的使用方法；若发生试剂接触皮肤或误食，应立即采取急救措施并就医。13.2环保要求实验过程中产生的废液（如提取液、洗脱液、标准溶液废液、盐酸-甲醇溶液废液等），应收集于专用的废液容器中，分类存放（酸性废液、有机废液分开存放），委托有资质的单位进行无害化处理，不得直接排放。实验用过的滤膜、固相萃取柱、离心管等耗材，应分类收集，进行无害化处理后丢弃，避免污染环境；废弃的标准品包装应妥善回收，不得随意丢弃。实验过程中应节约用水、用电，减少试剂浪费，践行绿色实验理念；试剂瓶应密封保存，避免试剂挥发污染环境。14实验报告实验报告应完整、准确、清晰，至少包含以下内容：报告标题：枸杞干果中苦参碱和氧化苦参碱残留量的测定报告。试样信息：试样名称、来源、取样日期、制备日期、留样量、试样状态等。实验依据：本规程编号及名称。试剂与仪器：试剂名称、纯度、生产厂家；仪器名称、型号、校准情况、使用参数。实验步骤：简要描述试样提取、净化、检测的关键步骤，以及液相色谱-串联质谱条件。实验结果：标准工作曲线（回归方程、相关系数）、空白实验结果、试样测定结果（苦参碱和氧化苦参碱残留量、平行样偏差）、加标回收率结果、精密度结果等。定性与定量结论：明确试样中苦参碱和氧化苦参碱残留量是否符合GB2763的规定，若超出限量，应注明超标情况。异常情况：实验过程中出现的异常情况（如仪器故障、试剂污染、回收率异常等）及处理方法、处理结果。实验人员、审核人员、批准人员签字及日期。15附录附录A常见干扰及排除方法基质干扰：枸杞干果中含有糖类、色素、有机酸等基质成分，可能对检测产生干扰，表现为空白试样中出现杂峰、目标物峰形畸变或响应值异常。排除方法：优化MCX固相萃取柱的净化条件，增加冲洗液体积（如将一级水冲洗体积增至8mL）；调整梯度洗脱程序，延长目标物与杂质的分离时间；选用更高纯度的试剂，减少试剂中的杂质干扰；采用基质匹配标准曲线进行定量，减少基质效应的影响。离子抑制/增强效应：质谱检测过程中，基质成分可能导致苦参碱、氧化苦参碱的离子化效率降低（离子抑制）或升高（离子增强），影响定量准确性。排除方法：优化质谱参数（如去簇电压、碰撞能量），提高目标物的离子响应；采用基质匹配标准曲线代替溶剂标准曲线进行定量，有效校正基质效应；优化净化步骤，去除更多基质杂质。试剂污染：试剂中含有微量苦参碱、氧化苦参碱，导致空白试样检出。排除方法：更换试剂批次，选用更高纯度的色谱纯试剂；对所有试剂进行空白验证，合格后方可使用；实验所用耗材（离心管、滤膜等）应提前用甲醇浸泡清洗，晾干后使用，避免耗材污染。目标物降解：实验过程中苦参碱、氧化苦参碱发生降解，导致测定结果偏低。排除方法：试样制备后及时提取，避免长时间存放；