ISO 13319-22023 粒度分布的测定电感区法第2部分可调谐电阻脉冲传感法标准立项发展报告

粒度分布的测定电感区法第2部分：可调谐电阻脉冲传感法标准立项发展报告StandardizationDevelopmentReport:DeterminationofParticleSizeDistribution—ElectricalSensingZoneMethod—Part2:TunableResistivePulseSensingMethod摘要粒度分布是表征颗粒材料物理特性的核心参数，广泛涉及制药、生物技术、材料科学、环境监测及食品工业等领域。本报告基于国际标准ISO13319-2:2023《粒度分布的测定电感区法第2部分：可调谐电阻脉冲传感法》编制，系统阐述了该标准的立项背景、技术原理、核心内容、标准结构、国际协调性及应用前景。可调谐电阻脉冲传感（TunableResistivePulseSensing,TRPS）技术通过可调谐微纳孔径对单个颗粒进行逐个检测，实现了纳米至微米级颗粒的粒径、浓度及表面电荷多参数同步测量，弥补了传统电感区法（如库尔特计数法）在亚微米尺度灵敏度不足的局限。本报告梳理了TRPS技术的工作原理、关键性能指标（包括测量范围、分辨率、重现性等）、与现有标准体系的衔接关系，以及该国际标准对全球颗粒表征技术体系的重要补充价值。本报告同时探讨了TRPS技术在细胞外囊泡表征、纳米药物质量控制、病毒载体监测等前沿领域的应用潜力，并展望了我国在该标准框架下的本土化实施路径与未来标准化工作方向。关键词：粒度分布；电感区法；可调谐电阻脉冲传感；ISO13319-2；颗粒表征；纳米颗粒Keywords:particlesizedistribution;electricalsensingzonemethod;tunableresistivepulsesensing;ISO13319-2;particlecharacterization;nanoparticles1引言颗粒材料的粒度分布直接决定其物理化学性能与应用价值，粒度测量也因此成为制药、化工、电子、环境等众多行业质量控制与科学研究不可或缺的手段。在众多粒度测量方法中，电感区法（ElectricalSensingZoneMethod,ESZ）因其原理直观、计数统计可靠性高而长期占据重要地位，经典的库尔特计数器即为此类方法的代表。然而，随着纳米技术与生物医药技术的迅猛发展，传统电感区法在可测量粒径下限、单颗粒多参数同步表征等方面日益暴露出局限性。在这一技术演进背景下，可调谐电阻脉冲传感（TRPS）技术应运而生。TRPS技术采用可形变的聚氨酯微孔膜，通过机械拉伸调控孔径大小，使得单一传感孔可在数十纳米至数微米的宽范围内实现粒径可调测量，同时一一记录每个颗粒通过纳米孔时产生的电阻脉冲信号，从而同步获取颗粒的粒径、浓度与表面电荷信息。这项技术自21世纪初商业化以来，在细胞外囊泡（EV）表征、纳米药物递送系统分析、病毒与细菌检测、胶体稳定性评估等应用中展现出独特优势。为将这一先进方法上升为国际公认的标准测试程序，国际标准化组织（ISO）在ISO13319系列框架下启动了第2部分的编制工作。经过多年技术验证与多轮国际协商，ISO13319-2:2023于2023年9月正式发布。该标准的出台不仅填补了TRPS技术在粒度分析标准体系中的空白，也为纳米颗粒表征提供了首个基于单颗粒电阻脉冲原理的国际通用规范。2标准制定背景与过程2.1电感区法标准体系的发展沿革ISO13319系列标准是ISO/TC24/SC4（粒度分析与筛分技术委员会）下属的核心标准之一。首版ISO13319:2007《粒度分布的测定电感区法》以传统库尔特原理为基础，规定了使用电解液中的小孔对悬浮颗粒进行计数与体积测量的方法。该标准在微米级颗粒表征领域发挥了重要作用，被广泛应用于血液细胞计数、乳剂粒径评价、磨料粒度检验及地质样品分析等场景。然而，ISO13319:2007所适用的测量下限通常止于0.6µm左右，对于当下热点研究领域——如细胞外囊泡（直径约50–1000nm）、功能化纳米颗粒（直径20–500nm）及脂质体药物载体（直径约50–300nm）——该方法的灵敏度明显不足。此外，传统电感区法无法在计数同时对颗粒表面电荷进行量化评估，这在一定程度上制约了其在胶体科学和生物医学中的深入应用。2.2TRPS技术的标准化需求TRPS技术最初源于20世纪90年代末的电阻脉冲传感基础研究，后经商业化发展形成了较成熟的仪器平台。与传统的固定孔径电感区法相比，TRPS技术具备以下独特性：-孔径可调：通过拉伸弹性膜改变孔径尺寸，实现同一平台上从纳米到微米的宽测量跨度；-单颗粒逐一测量：每个颗粒通过孔径时产生独立的电阻脉冲，可实现高分辨率的粒度分布统计；-多参数同步获取：脉冲幅度对应粒径大小，脉冲频率换算出颗粒浓度，脉冲的半宽信息与表面电荷密度相关联，实现"一次测量、多参数输出"。基于上述特点，TRPS技术在生物颗粒表征领域迅速获得重视。2010年前后，细胞外囊泡研究呈现爆发式增长，而传统的NTA（纳米颗粒追踪分析）和动态光散射（DLS）方法在浓度精确度和单颗粒分辨率方面存在固有局限。TRPS以其绝对计数能力和粒径高通量分辩优势，逐步成为细胞外囊泡表征的重要参考方法。技术的不断发展对标准化提出了迫切需求：不同实验室间的TRPS测量结果缺乏可比性，仪器校准方法、样品制备流程以及数据处理准则亟需统一。正是在此背景下，ISO/TC24/SC4于2016年前后启动TRPS标准化预研工作，并于2018年正式立项编制ISO13319-2。2.3编制历程ISO13319-2:2023的编制历经约五年的技术讨论与验证。起草工作主要由德国、中国、美国、日本、英国等成员体的专家共同承担。标准编制过程中，专家组围绕以下关键议题进行了深入探讨：1.校准物质的选择与溯源：确立了使用NIST可溯源标准聚苯乙烯乳胶微粒进行粒径校准的程序；2.电解质溶液配方的标准化：规范了溶液的电导率范围、表面活性剂添加种类及浓度，以降低颗粒团聚和膜润湿不稳定性的影响；3.孔径可调性与测量条件之间的耦合关系：明确了在不同膜拉伸条件下各测量参数（如施加电压、压力、频率）的适宜范围；4.浓度测量不确定度的评定方法：确立了基于泊松计数统计和仪器采样体积校准相结合的不确定度评估框架。经过工作组草案（WD）、委员会草案（CD）、国际标准草案（DIS）和最终国际标准草案（FDIS）各阶段评审和投票，标准于2023年9月19日正式发布。3标准主要内容解析3.1标准范围与适用对象ISO13319-2:2023适用于采用可调谐电阻脉冲传感技术对悬浮于电解质溶液中的颗粒进行粒径分布及颗粒浓度测定的场景。标准所覆盖的典型粒径范围为50nm至10µm，但这一范围并非绝对边界——通过选择合适的膜孔径和仪器配置，可将测量范围进一步扩展至数十纳米以下或数十微米以上。标准适用于但不限于以下样品类型：-细胞外囊泡（外泌体、微囊泡等）；-病毒样颗粒及腺相关病毒（AAV）载体；-脂质体、聚合物纳米粒和乳剂；-无机纳米颗粒（如二氧化硅、氧化铁、金纳米颗粒）；-细菌和亚微米级微生物。3.2术语和定义该标准对以下关键术语进行了明确定义：-可调谐电阻脉冲传感：一种基于弹性膜微孔的电感区测量技术，通过调节膜拉伸程度改变孔径大小，从而实现粒径范围可调的测量；-脉冲幅度：颗粒通过传感孔时产生的电阻变化量，与颗粒体积成正比；-阻塞幅度：基线电流瞬时减少的比例，是粒径计算的基础物理量；-颗粒浓度：由单位时间内的脉冲计数频率与已知流量率计算得出的每单位体积颗粒数。3.3方法原理TRPS的测量原理可归结为库尔特原理的纳米化、柔性化延伸。其核心构件是一张厚度约数十微米的弹性聚氨酯膜，膜上通过可控击穿方式制备一个纳米至亚微米级的小孔。测量时，膜两侧充满电解质溶液，施加恒定电压后电流经小孔流过。当颗粒随液流通过小孔时，由于颗粒的电导率通常低于电解质溶液，孔的等效电阻增大，进而产生一个瞬时的电流下降脉冲——即电阻脉冲。TRPS方法的独特之处在于膜的可拉伸结构设计——通过精密机械装置对弹性膜施加可控制的机械张力，改变膜的平面内形变从而调控孔径大小。当膜被拉伸时，孔的截面积增大，允许更大粒径的颗粒通过；反之，减小拉伸量可恢复较小孔径。这种"可调谐"能力使仪器无需更换传感装置即可对较宽粒径范围进行连续扫描测量。在该标准中，测量条件如施加压力（通常为0.1–10kPa）、电压（通常为1–10V）和膜拉伸比需要经过系统优化，方可在避免颗粒剪切损伤的前提下获得稳定且高信噪比的脉冲信号。标准推荐了一条结构化优化路径，包括：预实验确定适宜脉冲幅值范围、选择适当的稀释倍数（避免颗粒聚集和重合事件）、评估压力对浓度测量准确性的影响等。3.4仪器要求与校准标准对TRPS仪器的性能指标提出了明确要求，包括：-粒径分辨力：标准要求仪器对单分散标准颗粒的粒径测量变异系数（CV）不得超过5%；-浓度线性度：在仪器标称测量范围内，颗粒浓度测量的线性相关系数应不低于0.99；-计数效率稳定性：长时间连续测量过程中的计数漂移应控制在±3%以内。仪器校准方面，标准规定采用直径分别为100nm、200nm、400nm及800nm的NIST溯源聚苯乙烯微粒（或同等标准物质）构建校准曲线。每种标准颗粒需在至少三个不同膜孔径设定下进行测量，以验证粒径测量在不同孔径条件下的系统一致性。3.5样品制备与测量步骤样品制备是影响TRPS测量质量的核心环节。标准从以下方面给出了具体规范：1.分散介质：推荐使用过滤后的电解质溶液（典型为含0.01%~0.1%Tween20的磷酸盐缓冲液），以最大限度减少背景颗粒干扰；2.样品稀释：应根据预计颗粒浓度将样品稀释至每毫升约10⁶–10⁸个颗粒的水平，以避免重合事件导致的浓度低估和粒径偏移；3.超声分散：对于易团聚的无机纳米颗粒，建议测量前采用低功率超声浴处理1–5分钟；4.脱气处理：消除溶液中溶解气泡对脉冲信号的影响；5.测量时长：建议根据颗粒浓度设定测量时长，使累计脉冲数不低于1000个，以保证粒度分布的统计代表性。3.6数据处理与结果报告标准规定了TRPS数据的计算公式、粒度分布表示方式以及结果报告的格式要求。关键内容包括：-粒径-脉冲幅度校正曲线的线性回归及不确定度传递计算；-基于脉冲持续时间和半宽度信息的表面电荷（ζ电位）估算方法；-粒度分布的表示方式——推荐以体积加权分布和数量加权分布两种形式同时呈现；-结果报告需包含：测量温度、电解质溶液组成、膜孔径设定、校准物质信息、测量颗粒数、粒径分布特征值（D10、D50、D90）及扩展不确定度。4标准的技术先进性与应用价值ISO13319-2:2023的发布在粒度分析标准化进程中具有里程碑式的意义，主要体现在以下几个层面。第一，填补了纳米尺度单颗粒计数标准的空白。在ISO13319-2发布前，纳米颗粒的粒度分布测量尚无基于电阻脉冲原理的国际标准。DLS（ISO22412）虽可覆盖纳米粒径范围，但仅能提供强度加权平均粒径及多分散信息，无法获得准确的颗粒浓度；NTA（ISO19430）虽可提供单颗粒信息，但受限于光学衍射极限和荧光标记需求。TRPS标准提供了独立于光学检测原理的单颗粒电学计数方案，与现有标准形成了很好的互补。第二，建立了"粒径-浓度-电荷"三参数同步测量的标准化范式。传统粒度标准多聚焦于粒径分布的测定，而ISO13319-2首次将颗粒浓度作为同等重要的输出量纳入标准规范，并对基于脉冲频率的绝对浓度测量方法给出了系统的不确定度评定指南。这对纳米药物制剂（如脂质体、聚合物纳米粒）的载药量均一性评价、细胞外囊泡的临床定量检测等场景具有直接的应用价值。第三，显著提升了复杂生物样品测定的可靠性。细胞外囊泡、脂质体等样品往往粒径分布宽、颗粒浓度跨度大且易受杂质蛋白聚集体干扰。TRPS的单颗粒逐次测量原理天然免疫于小颗粒散射光的干扰，其对亚微米颗粒的高分辨区分能力使外囊泡亚群（如外泌体与微囊泡的区分）的定量分析成为可能。5科研应用与产业化前景5.1细胞外囊泡研究细胞外囊泡作为细胞间通讯的重要介质，近年来成为液体活检和新一代药物递送载体的研究热点。ISO13319-2标准为外囊泡的粒径分布、浓度及表面电荷表征提供了标准化技术依据。在国际细胞外囊泡学会（ISEV）发布的最新指南中，TRPS已被推荐为外囊泡表征的补充方法之一。随着标准发布，外囊泡研究的跨实验室数据可比性将大幅提升，为临床转化研究奠定方法论基础。5.2纳米药物质量评价纳米药物（如脂质体、白蛋白纳米粒、聚合物胶束等）的粒径和粒度分布直接关系到药物的体内分布、靶向效率和安全性。各国药典及监管机构日益重视纳米药物的粒度表征方法验证。ISO13319-2所规定的浓度同步测量能力，为纳米药物的"批间一致性"评价提供了有力的补充手段。尤其是对于基因治疗载体（如脂质纳米粒LNP-mRNA疫苗），TRPS能够在完整颗粒（装载核酸）与空囊泡之间提供一定的区分能力，这对产品质量属性的精细评价具有特殊价值。5.3病毒载体与疫苗分析腺相关病毒（AAV）载体的完整衣壳与空衣壳的区分是基因治疗药物生产中关键的质控指标之一。虽然TRPS尚不能直接区分核酸装载量的微小差异，但其高精度的粒径测量能力和对完整颗粒的绝对计数能力，为病毒载体制剂的聚集倾向监测和粒径稳定性评估提供了有效工具。未来结合阻抗谱分析技术，TRPS有望实现病毒载体完整性评价的更高维度区分。5.4标准化的产业辐射ISO13319-2的发布将带动以下产业链环节的标准化升级：-TRPS仪器制造商按照标准要求提升出厂校准流程和性能指标验证方法；-制药企业（尤其是纳米药物和基因治疗领域）可将该标准作为质量研究与控制（QbD）体系中的方法学依据。6主要标准制定参与单位介绍6.1中国参与单位在中国，ISO/TC24/SC4的国内对口技术单位为全国颗粒表征与筛分及筛网标准化技术委员会（SAC/TC168），秘书处设于北京市理化分析测试中心。该委员会自TRPS标准预研阶段即派遣专家参与工作组，持续跟踪标准编制进展。北京市理化分析测试中心是北京市科学技术研究院下属的综合性分析测试研究机构，长期从事颗粒表征技术研发与标准物质研究。中心建有国家食品质量安全检测重点实验室和北京市理化分析测试中心标准物质研究所，在纳米颗粒粒度标准物质研制、颗粒测量方法验证及标准制定方面积累了丰富经验。作为SAC/TC168的秘书处承担单位，中心组织国内相关科研院所和企业多次召开TRPS标准研讨会议，组织开展TRPS测量比对试验，形成的技术意见有效输出到了ISO国际标准草案中。6.2国际主要起草单位从国际层面来看，ISO13319-2的起草工作主要由以下机构深度参与：-德国联邦材料研究与测试研究所（BAM）：作为德国标准化协会（DIN）技术委员会的核心成员，BAM在TRPS标准物质的验证、测量不确定度评估方法方面贡献了大量实验数据和方法学建议。BAM研制的单分散纳米颗粒标准物质在标准制定中作为参考物质使用；-英国国家物理实验室（NPL）：NPL在纳米颗粒测