自身抗体实验室检测河南专家共识

自身抗体实验室检测河南专家共识摘要：随着对自身免疫性疾病（ＡＩＤ）的机理研究逐步深入，ＡＩＤ和自身抗体检测及应用越来越得到临床重视，但基层医院临床医生对ＡＩＤ的认识不足，基层医院检验科开展的相应检测项目也较少。为促进河南省临床免疫学科发展，河南省医学会微生物学与免疫学分会联合河南省微生物学会临床微生物专业委员会组织专家编写了本共识。共识涵盖自身抗体检测方法学、性能验证与质量控制和临床意义及结果解读三部分，因篇幅有限，本共识主要介绍了不同检测方法的特点及差异性，为河南省各级医院尤其是基层医院自身抗体实验室检测提供了推荐意见，以便各级医院规范使用，更好地服务患者。关键词：自身抗体实验室检测；自身免疫性疾病；专家共识自身免疫性疾病（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅｄｉｓｅａｓｅ，ＡＩＤ）是指由于机体免疫功能紊乱，产生针对自身抗原的病理性免疫应答反应，从而引起器官或者系统性损伤的一类疾病。其病因和发病机制目前尚未完全清楚。在全球范围内，ＡＩＤ总体的发病率和患病率分别为０.０９％［１］和７.６％～９.４％［２］，且呈逐年增长的趋势［３－４］。自身抗体是ＡＩＤ的重要生物学标志物，在相应的临床症状出现前数月甚至数年前即可检测到，且不同疾病所产生的抗体种类有所不同［５］。因此自身抗体检测不仅有助于ＡＩＤ早期筛查，而且在疾病诊断、病情判断、治疗评价和预后评估等方面也有重大意义。河南省为人口大省，自身免疫性疾病患者群体庞大，但基层医疗机构实验室检测能力与临床需求存在显著差距。本共识调查数据显示，省内三级公立医院自身抗体检测开展率为６８.５９％，而二级公立医院普及率仅达４０.００％。在已开展检测的实验室中，４６.５５％的机构检测项目不足２０项，室内质控体系尚未实现全覆盖，且国家卫生健康委员会临检中心室间质评参评率仅为６７.２４％。这种检测项目单一化、质量控制薄弱化、标准化程度不足的现状，严重制约着临床诊疗质量的提升。基于基层医院自身抗体检测开展率较低、项目数量较少、室内质控及室间质评未引起足够重视。本共识着重强调自身抗体实验室检测技术要点，旨在帮助河南省各级医院根据自身情况进行方法学的选择，以期实现河南省各级医院自身抗体检测工作的标准化和同质化，为检查检验结果互认奠定基础，助力降低患者的经济负担及医保支出。１自身抗体检测方法学自身抗体实验室检测对ＡＩＤ的诊断和疾病分类具有重要意义。目前，自身抗体的实验室检测方法主要包括以天然细胞或组织作为抗原的间接免疫荧光法（ｉｎｄｉｒｅｃｔｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅａｓｓａｙ，ＩＩＦ）和以纯化或重组蛋白作为抗原的靶抗原确认两大类。１．１ＩＩＦＩＩＦ是进行抗核抗体筛选检测的最有效方法之一。自２０世纪５０年代用于检测抗核抗体以来［６］，已成为抗核抗体检测的参考方法［７］。ＩＩＦ通过荧光显微镜观察特定位置的荧光强度及分布，结果通常包含荧光模式、滴度等信息。目前，其不仅广泛用于非组织器官特异性自身抗体的检测，如抗核抗体和抗中性粒细胞胞浆抗体等，同时在皮肤及消化系统等组织器官特异性自身抗体的检测中也得到了广泛应用。ＩＩＦ在实验室应用过程中存在一定优势及局限性，如干扰因素可能导致结果判读偏差，见表１，且不同方法学之间存在共性问题及优劣势［８－９］。近年来，ＩＩＦ检测自身抗体的自动化技术逐步应用于临床实验室，包括图像采集与分析、深度学习在内的自动化判读等［１０］。自动化判读可以提高检测效率，降低人工操作引起的误差［１１－１２］，如遇到复杂荧光核型等情况，建议采用双人独立阅片，不一致时由两人讨论、查阅病历或与临床沟通后进行结果报告［１３］。１．２靶抗原确认试验ＩＩＦ检测作为参考方法的核心是它的天然构象中包含最多的抗原，但该方法学不能明确具体的靶抗原种类，而靶抗原确认试验是将已知靶抗原纯化或合成后，通过各种体系检测待测标本中相应抗体的方法。随着技术的不断进步，越来越多的靶抗原确认试验应用于自身抗体的实验室检测。１．２．１酶联免疫吸附法酶联免疫吸附法（ｅｎｚｙｍｅｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ，ＥＬＩＳＡ）于１９７１年被报道，１９８０年后应用于自身抗体检测，广泛用于多种自身抗体的定量检测。根据抗原抗体特异性反应原理，通过底物显色测定ＯＤ值，参照标准曲线计算确定样品中待测物质水平的试验［１４］。ＥＬＩＳＡ因操作简单易掌握等特点，在体外诊断中有着广泛应用［１５－１６］。中国免疫学会临床免疫分会制订的《自身免疫病诊断中抗体检测方法的推荐意见》将ＥＬＩＳＡ与线免疫印迹法、化学发光免疫分析（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ＣＬＩＡ）共同推荐为靶抗原的建议检测方法［１７］。因酶标板内壁面积有限、所包被生物分子不足及空间位阻［１８］等因素的限制，致使ＥＬＩＳＡ检测在实际应用中存在一些问题，具体问题及推荐处理方案见表２。随着全自动免疫检测技术的优化更新，ＥＬＩＳＡ在自身抗体实验室检测方法学中的占比有下降趋势。据国家皮肤与免疫疾病临床医学研究中心（简称ＮＣＲＣ）自身抗体检测室间质评工作统计数据而得，ＥＬＩＳＡ占比已从２０１８年的２９.６％降至２０２２年的１５.２％。为避免ＥＬＩＳＡ方法学的弊端，在选择ＥＬＩＳＡ方法进行自身抗体检测时，应根据具体需求选择检测项目和试剂盒［１３］。在操作过程中，应严格按照说明书和标准操作规程进行，确保实验结果的准确性和可靠性；对于疑似阳性的样本，建议其他方法进行验证［１９］。１．２．２化学发光法ＣＬＩＡ是特异性抗原抗体免疫反应与高度灵敏的化学发光法相结合的定量检测方法，是继放射免疫、酶联免疫、荧光免疫和时间分辨荧光免疫等传统免疫分析法之后开发的新型免疫法，在疾病疗效监测上也发挥着重要作用［２０－２１］。光激化学发光免疫检测是一种均相免疫检测技术，有免清洗、高通量、高灵敏和操作简单的特点［２２］，但是研发难度大。ＣＬＩＡ根据标志物不同可分为直接化学发光免疫分析法（ｄｉｒｅｃｔｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ＤＣＬＩＡ）、化学发光酶免疫分析法（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｅｎｚｙｍｅｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ＣＬＥＩＡ）和电化学发光免疫分析法（ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ＥＣＬＩＡ）。三类分析方法在检测原理、方法学优势与劣势等比较见表３，在实验室检测过程中可能遇到的问题及解决方法，见表４。此外，自建微阵列化学发光免疫分析法、微孔系列化学发光免疫分析和小型即时检验系列化学发光免疫分析等不同技术与ＣＬＩＡ相结合的检测方法也在逐渐走向临床实验室［２３－２５］。ＣＬＩＡ检测自动化程度高，速度快，结果可定量，有助于实现自身抗体检测的标准化。鉴于方法学的显著优势，ＣＬＩＡ将在自身抗体的定量检测中发挥着越来越重要的作用［２５］。１．２．３免疫印迹法免疫印迹法（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ，ＩＢＴ）主要应用于蛋白质的定性或半定量检测［２６］，具有操作简单、成本低、无需特殊设备的优势，基层单位进行自身抗体谱检测时可优先考虑。此外，ＩＢＴ亦存在检测项目固定、批量检测、难以实现随机上样等劣势，限制了该技术的广泛应用［２７－３１］。在临床检测工作中，ＩＢＴ法已从传统手工操作向半自动或全自动免疫印迹分析仪转变。ＩＢＴ检测过程中可能存在的干扰性因素，会出现与临床症状不一致的结果，需分析原因并采取干预措施［３２－３４］，见表５。ＩＢＴ检测结果判读采用传统目测法或软件扫描条带灰度值分析法。目测法处于可疑区间的结果需复审或复检。软件分析法可提供条带灰度值，有利于判读［３５］。１．２．４流式荧光法流式荧光免疫法又称为多重微球流式荧光免疫法，是一种高通量的流式免疫学检测方法。这种方法采用分类荧光素标记的磁性微球形成微球阵列，根据不同荧光素颜色包被不同特异性抗原，同一份试剂根据检测需要放置多种颜色微球，可实现一次分析多项指标，具有高通量和随时待检等优势［３６］。目前流式荧光免疫法在自身抗体检测方面仍存在一些问题，见表６。推荐采用与ＩＩＦ联合检测、多种抗体和标志物联合检测以提高ＡＩＤ诊断的敏感度和特异度。该方法为自身抗体检测的拓展和深入研究提供了可能，具有较好的应用前景。１．２．５数码液相芯片法数码液相芯片法是一种全自动多重液相芯片免疫检测法，主要利用电子芯片制造领域的多层材料复合技术、光刻技术以及高分子表面修饰技术制造而成，实现定量或定性检测多种不同的生物分子［３９］。数码液相芯片法作为近年来自身抗体多重指标联检的新兴技术，具有明显优势［４０］。其在实验室检测过程中可能遇到的问题及改进措施，见表７。数码液相芯片法因近几年才开始应用于自身抗体检测，还有待大量临床数据的验证。１．２．６不同方法学共性问题及方法学比较临床免疫检测过程中经常遇到干扰物质，包括抗凝剂、溶血、嗜异性抗体、自身抗体和人抗动物抗体等，导致检测结果呈假阳性或假阴性。不同方法学之间确实存在一些共性问题对临床实验室检测造成一定程度的干扰。此外，不同靶抗原确认试验之间也存在一些共性问题，见表８。自身抗体检测方法学优缺点比较，见表９，推荐实验室采用ＩＩＦ法联合靶抗原确认试验进行组合检测，实验室可根据实际需求选择适合的靶抗原确认试验进行检测。此外，定量检测方法正逐渐在临床应用，为疾病的诊断和治疗监测提供更有力的支持。２性能验证与质量控制２．１性能验证为保证实验室所使用的检测试剂／系统在实际使用条件（人员、仪器、标准操作程序、环境）下呈现出符合试剂盒说明书所宣称的检测性能，实现其确定的临床预期用途，必须在开展临床检测前选用参考品或真实临床样本，通过简化的重复性及方法学比较实验对检测系统整体的精密度和准确度等分析性能进行验证［４１］。２．１．１自身抗体定性项目的性能验证自身抗体定性检验程序的分析性能验证内容至少应包括符合率（如方法比对符合率、人员比对符合率等），检出限、临界值、重复性、抗干扰能力等［４２］。例如线免疫印迹法结果判读仅依据膜条显色情况判断阴性和阳性２种结果，在性能验证时，实验室可使用日常检测中收集到的结果明确的临床样本，对其中几种最常见的（如抗核抗体谱中的抗ｄｓＤＮＡ抗体）、最具有临床意义的（如抗核抗体谱中的抗Ｓｍ抗体）以及最难以检测的（如抗核抗体谱中的抗Ｊｏ－１抗体）自身抗体进行检测精密度和准确度的评估。对于ＩＩＦ等半定量检测方法，由于其除阴阳性结果外还具有对核型和抗体滴度的判断，因此在精密度及准确度的性能验证时实验室不仅需对检测的定性符合率进行评估，还需根据判读得到的核型和抗体滴度进行进一步分析。具体操作可参照彭绒雪等［４１］《临床实验室自身抗体检测性能验证与质量控制》及卫生行业标准ＷＳ／Ｔ５０５［４３］等。２．１．２自身抗体定量项目的性能验证自身抗体定量项目的性能验证可参考使用临床化学定量检验方法的性能验证指南。定量检验程序的分析性能验证内容至少应包括正确度、精密度和可报告范围［４２］。具体操作可参照卫生行业标准ＷＳ／Ｔ４２０［４４］以及ＣＮＡＳ相关指南ＣＮＡＳ－ＧＬ０３７［４５］等。２．２质量控制２．２．１室内质量控制２．２．１．１质控品的来源质控品的来源主要有３种途径：第三方商品化的质控品、试剂厂商配套使用的质控品和自制质控品。优先选择第三方质控品，但应考虑系统兼容性，以确保结果准确性。如无合适的第三方质控品，可考虑厂家配套质控品或实验室自制，并根据质控品说明书或实验室检测方法进行验证。自制质控品需要遵循一定的原则和方法，如选择人血清基质、添加剂尽可能少、均匀性好、稳定性好等。使用自制质控品时应建立相应的操作及验证程序，并对自制质控品进行稳定性及均一性评价。２．２．１．２室内质控的操作原则无论定性或定量项目，应至少保证两个水平的质控，即阴性和弱阳性。定量质控应使用实验室现行检测方法确定靶值和标准差。对于用滴度、数值判定结果的实验，可统计弱阳性质控品的定量检测数值（如滴度值、Ｓ／ＣＯ值、检测浓度等），计算均值、标准差及变异系数，以进行检测精密度（包括重复性及中间精密度）的持续验证，并绘制Ｌｅｖｅｙ－Ｊｅｎｎｉｎｇｓ质控图，以更加直观地进行观测。每月进行质控结果汇总分析，获得重复性的验证数据及中间精密度及再现性的验证数据。当质控品批号更换时，应建立新的均值和标准差。２．２．１．３室内质控失控的处理室内质控发生失控后应立即停止实验、寻找原因，确定失控原因后应采取相应的纠正措施，并评估是否影响检测结果，必要时应追回已发检测报告，并针对造成失控的原因制定相应的预防措施。２．２．２室间质量评价实验室应参加由国家卫健委临检中心、省市级临检中心及ＮＣＲＣ组织的室间质量评价。收到室间质评成绩后应进行总结和分析，对不合格的项目应及时分析原因并采取纠正措施。２．２．３实验室内部比对实验室内部应定时进行比对，内容包括：人员比对，相同项目使用不同检测系统之间的比对，同一检测系统不同的模块之间的比对等。人员比对的频率一般每年不少于２次，仪器间的比对一般每年不少于１次。比对结果不合格时应及时分析原因并采取纠正措施。３临床意义及结果解读自身抗体检测的临床意义主要包括以下几个方面。（１）早期预警：在症状尚未明显时，自身抗体的出现可能是ＡＩＤ的早期信号。如抗核抗体及其针对靶抗原的特异性自身抗体抗干燥综合征抗原Ａ抗体、抗干燥综合征抗原Ｂ抗体等可在系统性红斑狼疮或干燥综合征患者出现临床症状前数年检测到［４６］。（２）诊断和鉴别诊断：不同的ＡＩＤ具有特定的自身抗体谱，有助于区分相似症状的疾病，部分自身抗体谱检测策略已纳入疾病的诊断或分类标准［４７］。（３）监测病情和治疗效果：自身抗体水平的变化与某些ＡＩＤ活动度密切相关，可反映疾病进展和治疗效果。例如，在系统性红斑狼疮中，抗ｄｓＤＮＡ抗体的水平变化可以反映疾病的活动性，可作为系统性红斑狼疮患者疗效监测和预后评价的重要标志物，并与系统性红斑狼疮患者的肾损害程度具有相关性［４７］。对系统性红斑狼疮的疾病活动性进行监测时，应定期使用同种定量检测方法进行抗ｄｓ－ＤＮＡ抗体的检测［４８－４９］。由于ＡＩＤ的发生涉及复杂的病理生理机制，ＡＩＤ的诊断和治疗目前仍较困难［３］。自身抗体的存在与ＡＩＤ并无绝对对应关系［４６］，ＡＩＤ的诊断需要综合考虑临床表现、实验室检查结果及影像学资料等多方面信息。ＡＩＤ具有高度异质性，同种疾病可有不同种类的自身抗体，同种自身抗体也可见于不同疾病［４９］，而且，不同患者的自身免疫反应各异，导致自身抗体在诊断ＡＩＤ时的敏感度和特异度不稳定，限制其临床价值。自身抗体与ＡＩＤ临床相关性的研究存在多维差异，如检测方法、疾病特征、种族等［５０］。此外，ＡＩＤ患者体内往往存在多种自身抗体，采用多种自身抗体谱联合检测可显著提高诊断的灵敏度和特异度。实验室可以根据具体情况开展相关多种自身抗体联合检测，如抗核抗体谱、抗磷脂综合征抗体谱、自身免疫性肝炎抗体谱等，并遵循专家共识和建议进行规范化操作与质量控制。参考文献[1]CooperGS,StroehlaBC.Theepidemiologyofautoimmunediseases[J].AutoimmunRev,2003,2(3):119-125.[2]CooperGS,BynumML,SomersEC.Recentinsightsintheepidemi-ologyofautoimmunediseases:improvedprevalenceestimatesandunderstandingofclusteringofdiseases[J].JAutoimmun,2009,33(3/4):197-207.[3]MillerFW.Theincreasingprevalenceofautoimmunityandautoim-munediseases:anurgentcalltoactionforimprovedunderstanding,diagnosis,treatment,andprevention[J].CurrOpinImmunol,2023,80:102266.[4]BoweB,XieYan,Al-AlyZ.PostacutesequelaeofCOVID-19at2years[J].NatMed,2023,29(9):2347-2357.[5]ChauhanR,RainaV,NandiSP.Prevalenceofautoimmunediseasesanditschallengesindiagnosis[J].CritRevImmunol,2019,39(3):189-201.[6]HolborowEJ,WeirDM,JohnsonGD.Aserumfactorinlupusery-thematosuswithaffinityfortissuenuclei[J].BrMedJ,1957,2(5047):732-734.[7]Agmon-LevinN,DamoiseauxJ,KallenbergC,etal.Internationalrec-ommendationsfortheassessmentofautoantibodiestocellularantigensreferredtoasanti-nuclearantibodies[J].AnnRheumDis,2014,73(1):17-23.[8]DamoiseauxJ,AndradeLEC,CarballoOG,etal.ClinicalrelevanceofHEp-2indirectimmunofluorescentpatterns:theInternationalCon-sensusonANApatterns(ICAP)perspective[J].AnnRheumDis,2019,78(7):879-889.[9]CoppleSS,GilesSR,JaskowskiTD,etal.ScreeningforIgGantinu-clearautoantibodiesbyHEp-2indirectfluorescentantibodyassaysandtheneedforstandardization[J].AmJClinPathol,2012,137(5):825-830.[10]PetersonLK,TeboAE,WenerMH,etal.Assessmentofantinuclearantibodiesbyindirectimmunofluorescenceassay:reportfromasurveybytheAmericanAssociationofMedicalLaboratoryImmunologists[J].ClinChemLabMed,2020,58(9):1489-1497.[11]SackU,ConradK,CsernokE,etal.AutoantibodydetectionusingindirectimmunofluorescenceonHEp-2cells[J].AnnNYAcadSci,2009,1173:166-173.[12]曾俊祥，姜文琪，徐井旭，等．深度学习在抗核抗体荧光核型识别中的应用初探[J].中华检验医学杂志，2023,46(10):1094-1098.[13]周仁芳，胡朝军．抗核抗体的实验室检测进展[J].中华检验医学杂志，2021,44(2):163-166.[14]毕胜利，曾常茜．临床免疫学[M].科学出版社，2010:231-232.[15]潘新兰，李志军，江超，等．全自动免疫分析法检测抗核抗体谱诊断系统性红斑狼疮的价值[J].中华临床医师杂志（电子版），2019,13(10):736-739.[16]彭玲，王开正．自身抗体临床应用及实验诊断研究进展[J].国际检验医学杂志，2015,36(10):1425-1428.[17]中国免疫学会临床免疫分会专家组．自身免疫病诊断中抗体检测方法的推荐意见[J].中华检验医学杂志，2020,43(9):878-888.[18]PanYanhong,WangLei,DengYing,etal.Asimpleandsensitivemethodforexosomedetectionbasedonsterichindrance-controlledsignalamplification[J].ChemCommun(Camb),2020,56(89):13768-13771.[19]聂影．不同检测技术检测抗核抗体对自身免疫性疾病的诊断价值[J].医学食疗与健康，2020,18(10):182-183.[20]CinquantaL,FontanaDE,BizzaroN.Chemiluminescentimmunoassaytechnology:Whatdoesitchangeinautoantibodydetection?[J].AutoImmunHighlights,2017,8(1):9.[21]ShangXiaoying,RenLisheng,SunGuirong,etal.Anti-dsDNA,anti-nucleosome,anti-C1q,andanti-histoneantibodiesasmarkersofactivelupusnephritisandsystemiclupuserythematosusdiseaseactivity[J].ImmunInflammDis,2021,9(2):407-418.[22]张嘉懿，郭文伟，沈永明，等．光激化学发光法检测儿童乙型肝炎核心抗体最佳临界值探讨[J].检验医学，2023,38(3):291-293.[23]何成山，姚晓阳，蒋秀娣，等．自建微阵列化学发光免疫分析法定量检测心肌肌钙蛋白I自身抗体及其初步临床应用[J].检验医学，2021,36(3):318-324.[24]徐庆宇．微孔系列与小型POCT系列化学发光免疫分析仪的比较研究[J].中国设备工程，2024(S2):340-342.[25]陈小奇，蔡建军．重视自身抗体的精准定量检测[J].中华检验医学杂志，2021,44(11):987-990.[26]SuleR,RiveraG,GomesAV.Westernblotting(immunoblotting):history,theory,uses,protocolandproblems[J].Biotechniques,2023,75(3):99-114.[27]谢剑波，王光彦，郑国燕，等．自身抗体分析的方法学比较及临床意义[J].医疗装备，2021,34(23):59-61.[28]TaylorSC,PoschA.Thedesignofaquantitativewesternblotexperi-ment[J].BiomedResInt,2014,2014:361590.[29]MeftahiGH,BahariZ,ZareiMahmoudabadiA,etal.Applicationsofwesternblottechnique:frombenchtobedside[J].BiochemMolBiolEduc,2021,49(4):509-517.[30]康欢欢．化学发光法与免疫印迹法对1型糖尿病相关胰岛自身抗体的检测效能评价[D].沈阳：中国医科大学，2019.[31]谢洁雯，吴中鸣，魏秋静，等．间接免疫荧光法、免疫印迹法和多重微珠免疫法检测抗核抗体的比较和评价[J].中华临床实验室管理电子杂志，2021,9(4):200-204.[32]章晓霞，李发爵，李湘成，等．欧蒙免疫印迹法(ANA谱3)模条本底颜色变深对结果影响2例分析[J].实验与检验医学，2023,41(4):530-532.[33]王志国，张静，麻全慧，等．基于风险管理的质量控制策略在自身抗体检测领域的策划[J].临床检验杂志，2023,41(12):933-936.[34]叶朝付，董沁芳，何蕊．抗核抗体检测试剂审评要点概述[J].中国医疗器械信息，2019,25(19):10-11.[35]武永康，王兰兰，蔡蓓，等．EUROlineScan分析软件在免疫印迹法检测自身抗体中的应用探讨[J].中国实验诊断学，2007(12):1615-1617.[36]中国医师协会风湿免疫科医师分会自身抗体检测专业委员会．抗核抗体检测的临床应用专家共识[J].中华检验医学杂志，2018,41(4):275-280.[37]徐晓雪，户乃丽，邹林樾，等．流式微球捕获蛋白定量检测技术的原理与应用[J].继续医学教育，2022,36(9):129-132.[38]牛广华，高玉洁，张程，等．流式免疫多重微球芯片技术检测干燥综合征自身抗体的评价及应用[J].检验医学与临床，2016,13(14):1911-1913.[39]QinYan,FanChun