蛋白质的定量测定实验

蛋白质的定量测定实验（Lowry法、考马氏

亮蓝G-250染色法、紫外分光光度法和双

缩眠法）

2010-04-0409:45:31来源：易生物浏览次数:1431网友评论0条

一、Folin-酚试剂法（又名Lowry）法二、考马氏亮蓝G-250染色法三、紫外

分光光度法四、双缩服法

关键词：马氏染色法亮蓝蛋白质定量测定Lowry法考马氏亮蓝G-250染色法紫外分

光光度法双缩眠法）

蛋白质的

定量分析

是生物化

学和其它

测定范

生命学科不同种类

围最大吸收

最常涉及蛋白的差特点

（pg/波长（nm）

的分析内异

ml）

容，是临

床上诊断

疾病及检

查康复情

况的重要

指标,也

是许多生

物制品，

药物、食

品质量检

测的重要

指标。在

生化实验

中，对样

品中的蛋

白质进行

准确可靠

的定量分

析，则是

经常进行

的一项非

常重要的

工作。

蛋白质是

一种十分

重要的生

物大分

子：它的

种类很多，

结构不

均一，分

子量又相

差很大，

功能各异，

这样就

给建立一

个理想而

又通用的

蛋白质定

量分析的

方法代来

了许多具

体的困

难。目前

测定蛋白

质含量的

方法有很

多种，下

色法、银

染法

其他性

质：荧光

法

蛋白质测

定的方法

很多，但

每种方法

都有其特

点和局限

性，因而

解各种方

法的基础

上根据不

同情况选

用恰当的

方法，以

满足不同

的要求。

例如凯氏

定氮法结

果最精确，

但操作

复杂，用

于大批量

样品的测

试则不太

合格；双

缩眠法操

作简单，

线性关系

好，但灵

敏度差，

样品需要

量大，测

量范围窄，

因此在

科研上的

应用受到

限制;而

酚试齐法

弥补了它

的缺点，

因而在科

研中被广

泛采用，

但是它的

干扰因素

多；考马

氏亮兰染

色法因其

灵敏而又

简便开始

重新受到

关注；BC

A法又以

其试剂稳

定，抗干

扰能力较

强，结果

稳定，灵

敏度局।而

受到欢

迎；胶体

金法具有

较高的灵

敏度,可

啰1」毫微

克水平，

用于微量

蛋白的测

定。

常用的测

定蛋白质

含量方法

的比较

方法

标准方法，准确，操作麻烦，费时，灵

凯氏定氮

小敏度彳氐适用于标准的测定

法

灵敏，快速，不消耗样品，核酸芟物质

^^卜分光100—280

大有影响

光度法1000205

重复性、线性关系好，灵敏度低，测定

双缩腺法1000小540

范围窄，样品需要量大

—100

00

Folin-酚20—5灵敏费时较长，干扰物质多

大750

试剂法00

灵敏度高，稳定，误差较大，颜色会转

考马氏亮50—5

大595移

蓝G-25000

灵敏度高，稳定，干扰因素少，费时较

50—5

BCA大562

00

由于凯123456

氏定氮

法的操

作作过

于复杂，

双缩服

法的灵

敏度又

太低，下

面介绍

Folin一

酚试剂

法，考马

氏亮蓝G

—250染

色法，紫

外分光

光度法、

胶体金

法等几

种最常

用使用

的方法。

、

Folin-

酚试剂

法（又名

Lowry)

法

目前实

验室较

多用用

Folin-酚

法测定

蛋白质

含量，此

法的特

点是灵

敏度高，

较双缩

腺高两

个数量

级，较紫

外法略

高，操作

稍微麻

烦，反应

约在15

分钟有

最大显

色，并最

少可稳

定几个

小时其

不足之

处是干

扰因素

较多，有

较多种

类的物

质都会

影响测

定结果

的准确

性。

[原

理】

蛋白质

中含有

酚基的

酪氨酸，

可与酚

试剂中

的磷铝

锯酸作

用产生

兰色化

合物，颜

色深浅

与蛋白

含量成

正比。

【操

作】

1.标准曲

线的制

备：

按下表

操作，在

试管中

分别加

入0、

0.2.0.4.0

.6.0.8、

1ml蛋白

标准溶

液，用生

理盐水

补足到

1mL加

入5ml的

碱性酮

试剂，混

匀后室

温放置

20分钟

后，再加

入0.5ml

酚试剂

混匀。

-编TIHJ

号

蛋白标00.20.40.60.81.0

准(ml)

0.9%1.00.80.60.40.20

NaCI

(ml)

碱性酮555555

试剂

(ml)

混匀后室温(25℃)放置20分钟

酚试剂0.50.50.50.50.50.5

（ml）

30分钟后，以第1管为空白，在650nm波长比色，淡出吸光度，以各客的标准蛋白浓

度为横坐标，以其吸光度为纵坐标绘出标准曲线。

2、血清测定管标准管空白管

蛋白质

测定。

稀释血

清（或其

它蛋白

样品浓

度）：准

确吸取

0.1ml血

清，置于

50ml容

量瓶中，

用生理

盐水释

释至刻

度（此为

稀释500

倍，其它

蛋白样

品酌情

而定)。

再取三

只试管，

分别标

以1、2、

3号，按

下表操

作：

编

号

稀释标0.2——

本(ml)

稀释标—0.2—

准液(ml)

0.9%Na——0.2

Cl(ml)

碱性酮1.01.01.0

液(ml)

混匀后于室温放置20分钟

酚试剂0.10.10.1

(ml)

混匀各管，30分钟后，在波长650nm比色，读取吸光度。

【计算】

1.以测定管读数查找标准曲线求得血清蛋白含量。

2.无标准曲线时，可以与测定管同样操作的标准管按下式计算蛋白含量:

血清蛋白含量(g%)二口

【试

剂配

制】

1、碱

性酮

溶液：

甲液：123456

Na2C

032g

溶于0.

lmol/

LNa

OH1

00ml

溶液

中。

乙液：

CuSO

4・5H2

00.5

克溶

于1%

酒石

酸钾1

00ml

中。

取甲

液50

ml,乙

液1ml

混合。

此液

只能

临用

前配

制。

2、酚

试剂：

取Na

2W0

4・2H2

010

0g和

Na2M

oO3・

2H2O

25g,

溶于

蒸播

水700

ml中，

再加

85%H

3PO4,

50ml

和HCI

（浓）

100m

L将

上物

混合

后，置

1500

ml园

底烧

瓶中

温和

地回

流10

小时

再加

献

锂（LI

2SO2

•H2

0)15

0g,水

50ml

及演

水数

滴，继

续沸

腾15

分钟

以除

去剩

余的

%冷

却后

稀释

至100

0ml,

然后

过滤，

溶液

应呈

黄色

（如

带绿

色者

不能

用），

置于

棕色

瓶中

保存。

使用

标准N

aOH

滴定，

以酚

猷为

指示

液，而

后稀

释约

T髭

使最

后浓

度为1

N。

3、蛋

白标

准液

(0.1

mg/m

1)

准确

称取1

Omg

牛血

清蛋

白，在

100ml

容量

瓶中

加生

理盐

水至

刻度。

溶后

分装，

放于

-2

0。（2冰

箱保

存。

【注

意事

项】

1、Tri

s缓冲

液、蔗

糖、硫

酸胺、

基化

物、酚

类、柠

檬酸

以及

高浓

度的

尿素、

服、硫

酸钠、

三氯

乙酸、

乙醇、

丙

SIR]......

等均

会干

扰Foli

n-酚

反应。

2、当

酚试

剂加

入后，

应迅

速摇

匀（加

一管

摇一

管）以

免出

现浑

浊。

3、由

于这

种呈

色化

组成

尚未

确立，

它在

可见

光红

外光

区呈

现较

宽吸

收峰

区。不

同实

验室

选用

不同

波长，

有选

用500

或54

Onm,

有选

用640

nm,7

00或7

50n

m。选

用较

高波

长样

品呈

现较

大的

光吸

收本

实验

选用

波长6

50n

mo

二、考

马氏

亮蓝G

-250

雉

法

此方

法是1

976年

Bradf

orm

建立。

蝴

结合

法测

定蛋

白质

的优

点是

灵敏

度较

局/可

检测

到微

量蛋

白，操

作简

便、快

迅试

剂配

制极

简单，

重复

螭

但干

扰因

素多。

【原

理】

考马

氏亮

蓝G-

250具

有红

色和

青色

两种

色调、

在酸

性溶

液中

游离

状度

下为

棕红

色，当

它通

过疏

水作

用与

蛋白

质结

合后，

变成

蓝色，

最大

吸收

波长

从465

nm转

移到5

95nm

处在

一定

的范

围内，

蛋白

质含

量与

595n

m的

吸光

度成

正比，

测定5

95nm

处光

密度

值的

增加

即可

进行

蛋白

质的

定量。

【操

作步

骤】

1、标

准曲

线的

制备：

按下

表操

作,在

试管

中分

别加

入0、2

0、40、

80、1

00微

克蛋

白标

准溶

液，用

水补

足到1

00微

升,加

入3ml

的染

色液，

混匀

后室

温放

置15

分钟。

编

号

蛋白

标准00.020.040.060.080.10

（ml）

蒸储

0.100.080.060.040.020

水（ml）

雉

333333

液(ml)

在595nm波长比色，读出吸光度，以各管的标准蛋白浓度为横坐标，以其吸光度为纵

坐标绘出标准曲线。

2、血清

蛋白质

测定

稀释血

1（空白管）2（标准管）3（样品管）

清（或其

它蛋白

样品溶

液），准

确吸取0.

1ml血

清，置入

50ml容

量瓶中，

用生理

盐水稀

释至刻

度（此为

稀释500

倍,其它

蛋白样

品酌情

而定1

再取三

只试管，

分别标

以1、2、

3号，按

卜表操

作。混匀

后室温

•15

分钟,在

595nm

波长比

色，计算

蛋白质

浓度。

试齐（J（亳

蒸储

0.1——

水

蛋白质

—0.1—

标准

稀释血

—0.1

清

染色

333

液

【计算】

生X0.一用篝浮=-X5

每100毫升血清中蛋白质的含量(g%)=4H1000加

【试核酸FA280/A2核酸(%)F

剂】(%)60

1.考

马氏

亮蓝

G-

250

染色

液：

称取

100m

g考

马氏

亮蓝

G-

250

溶解

于50

毫升

95%

的乙

醇中，

加入

100

毫升

85%

的磷

酸，

加入

稀释

到1

升。

2.蛋

白标

准

(0.1

mg/

ml)

准确

称取

10m

g牛

血清

白蛋

白，

在

100m

1容量

瓶中

加生

理盐

水至

刻度，

溶后

分装，

20℃

冰箱

保存。

［注

意事

项】

1.常

用试

剂的

干扰:

有些

常用

试剂

在测

中

会受

到不

同程

度的

干扰。

Tris、

筑基

乙醇、

蔗糖、

甘油、

EDTA

及少

量去

垢剂

有较

少影

响，

而1%

SDS、

1%

Trito

nX-1

00及

1%

Hem

osol

的干

扰严

重。

2.显

色结

果受

时间

与温

度影

响较

大，

须注

意保

证样

品与

标准

的测

控

制在

同—

条件

下进

行。

3.考

马氏

亮蓝

G-

250

染色

能力

很强,

特别

要注

意比

色杯

的清

洗。颜

色的

吸附

对本

次测

定影

响很

大。可

将测

量杯

在

0.1m

ol/L

HCI

中浸

泡数

小时，

再冲

洗干

净即

可。

三、紫

外分

光光

度；去

紫外

光谱

吸收

法测

定蛋

白质

含量

是将

蛋白

质溶

液直

接在

紫外

分光

光度

计中

测

的方

法f

不需

要任

何试

剂1

操作

很简

便f

而且

样品

可以

回收。

[原

理】

蛋白

质溶

液在

280n

m附

近有

强烈

的吸

收f

这是

由于

蛋白

质中

酪氨

酸、色

氨酸

残基

而引

起1的,

所以

光密

度受

这两

种氨

基酸

含量

的支

配。另

外核

蛋白

或提

取过

程中

杂有

的核

酸对

测定

结果

引起

极大

误;连,

其最

大吸

收在

260n

mo所

以同

时测

280

及

260n

m两

种波

长的

吸光

度，

通过

计算

可得

较为

正确

的蛋

白质

含量。

［操

作】

将待

测蛋

白质

溶液

适当

稀释

K倍,

在紫

外分

光度

计中

分别

测定

样品

在

10m

m光

径石

英比

色皿

中，

分别

在

280n

m及

260n

m两

种波

长下

的吸

光度

值

A280

和

A260

O

［计

算】

1.当

蛋白

样品

的吸

光收

比值

A280

/

A260

约为

1.8,

可用

下面

的公

试进

行计

算：

蛋白

质浓

度

(mg

/ml)

(L4

5A28

0-

0.74A

260)

xK

2.也

可以

先计

算出

A280

/

A260

的比

值后

从下

表中

查出

校正

因子

"F〃

值，

由下

面的

经验

公式

计算

出溶

液的

蛋白

质浓

度。同

时从

表中

还可

以a

出样

品中

混杂

的核

酸的

百分

名里・

蛋白

质浓

度

(mg

/ml)

二Fx

A280

xK

A280

/A26

0

1.750.001.1160.8465.500.656

1.630.251.0810.8226.000.632

1.520.501.0540.8046.500.607

1.400.751.0230.7847.000.585

1361.000.9940.7677.500.565

1301.250.9750.7538.000.545

1.251.500.9440.7309.000.508

1.162.000.8990.70510.000.478

1.092.500.8520.67112.000.422

1.033.000.8140.64414.000.377

0.9793.500.7760.61517.000.322

0.9394.000.7430.59520.000.278

0.8745.000.682

注：一般纯净蛋白质的光吸收比值A280/A260约为1.8,而核酸A280/A260的比值约

为0.5。

【方法评价】

操作简便、样品溶液可回收，同时可估计核酸含量。但核酸含量小于20%或溶液混浊、

则测定结果误差较大。在使用上表和公式计算时也应注意各种蛋白质和各种核酸在

280nm及260nm处的光吸收值也不尽相同，故计算结果有一定误差。

四、双缩眼法

【原理】

利用半饱和硫酸筱或27.8%硫酸钠一亚硫酸钠可使血清球蛋白沉淀下来，而此时血

清白蛋白仍处于溶解状态，因此可把两者分开，这种利用不同浓度的中性盐分离蛋白的

方法称为盐方法。盐析分离蛋白质的方法不仅用于临床医学，而且还广泛地用于生物化

学研究工作中，如一些特殊蛋白质一酶、蛋白激素等的分离和纯化。

蛋白质和双缩眠一样，在碱性溶液中能与铜离子形成紫色络合物（双缩眠反应），且其

呈色深浅与蛋白质的含量成正比，因此可于蛋白质的定量测定。

但必须注意，此反应并非蛋白质所特有，凡分子内有两个或两个以上的肽键的化合物

以及分子内有口一CH2-NH2等结构化合物，双缩膈反应也呈阳性。本实验用27.8%

硫酸钠一亚硫酸钠溶液稀释血清，取出一部分用双缩版反应测定蛋白质的含量，剩余部

分则用滤纸过滤，使析出的球蛋白与白蛋白分离，取出灌液用同一反应测定白蛋白的含

量。总蛋白与白蛋白含量之差即球蛋白的含量。白蛋白与球蛋白之比即所谓的白/球比

值。

【操作】

1、取中试管4支,分别标以T、“2"、"3"、"4",吸取27.8%硫酸钠一亚硫酸钠

1ml,置“1"管中备用。

2、吸取血清0.2ml于另一试管中，加27.8%硫酸钠一亚硫酸钠4.8ml,用拇指压住管

口倒转混合5〜6次，放置约15秒，用1ml刻度管吸取1ml置于管"4"中（总蛋白

测定管I

3、将剩余的血清混悬液（如滤液不清，可重复过滤，直至澄清为止），用另一支1ml

刻度吸管取此液1ml,置于管“3”（白蛋白测定管X

4、另用一支1ml刻度吸管吸取标准血清1ml,置管“2”中（标准管工

5、于上述4支试管中分别加入双缩版试剂4ml,混匀。

6、在室温下放置10分钟后，以