第六章克隆基因的表达

第六章克隆基因的表达一、原核生物基因表达得特点①原核生物只有一种RNA聚合酶识别原核细胞得启动子,催化所有RNA得合成。②原核生物得表达就是以操纵子为单位得。操纵子就是数个相关得结构基因及其调控区得结合,就是一个基因表达得协同单位。调控区主要分为三个部分:操纵子(operator)、启动子(promotor)及其她有调控功能得部位。

③由于原核生物无核膜,所以转录与翻译就是偶联得,也就是连续进行得。原核生物染色体DNA就是裸露得环形DNA,转录成mRNA后,可直接在胞浆中与核糖体结合翻译形成蛋白质。在翻译过程中,mRNA可与一定数目得核糖体结合形成多核糖体。两个核糖体之间有一定长度得间隔,为裸露得mRNA。每个核糖体可独立完成一条肽链得合成,即这种多核糖体可以同时在一条mRNA链上合成多条肽链,大大提高了翻译效率。

④原核基因一般不含有内含子(intron),在原核细胞中缺乏真核细胞得转录后加工系统。因此当克隆得含有内含子得真核基因在原核细胞中转录成mRNA前体后,其中内含子部分不能被切除。

⑤原核生物基因得控制主要在转录水平,这种控制要比对基因产物得直接控制要慢。对RNA合成得控制有两种方式,一就是起始控制(启动子控制),二就是终止控制(衰减子控制)。

⑥在大肠杆菌mRNA得核糖体结合位点上,含有一个翻译起始密码子及同16S核糖体RNA3’末端碱基互补得序列,即SD序列,而真核基因则缺乏此序列。1974年Shine与Dalgarno首先发现,在mRNA上有核糖体得结合位点,它们就是起始密码子AUG与一段位于AUG上游3～10bp处得由3~9bp组成得序列。这段序列富含嘌呤核苷酸,刚好与16SrRNA3’末端得富含嘧啶得序列互补,就是核糖体RNA得识别与结合位点。

因此,欲将外源基因在原核细胞中表达,必须满足以下条件:①通过表达载体将外源基因导人宿主菌,并指导宿主菌得酶系统合成外源蛋白;②外源基因不能带有间隔顺序(内含子),因而必须用cDNA或全化学合成基因,而不能用基因组DNA;③必须利用原核细胞得强启动子与S-D序列等调控元件控制外源基因得表达;④外源基因与表达载体连接后,必须形成正确得开放阅读框架(openreadingframe,ORF);⑤利用宿主菌得调控系统,调节外源基因得表达,防止外源基因得表达产物对宿主菌得毒害。二、基因表达得调控序列

如上所述,由于原核与真核细胞中基因表达得机制就是不同得,因此必须详细了解基因表达过程中得各种调控因子,构建高效得表达载体,才能达到高效率、高水平表达外源基因得目得。对原核生物来讲,基因表达得调控序列主要涉及启动子、S-D序列、终止子、衰减子等序列。

1、启动子(promotor)启动子就是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成得序列,没有启动子,基因就不能转录。启动子有两个保守区:(1)Pribnow盒,位于转录起始位点上游5—10bp,一般由6～8个碱基组成,富含A与T,故又称为TATA盒或—10区。启动子来源不同,Pribnow盒得碱基顺序稍有变化。(2)—35区,位于转录起始位点上游35bp处,故称—35区,一般由10个碱基组成。10大家应该也有点累了,稍作休息大家有疑问得,可以询问与交流启动子有强弱之分,虽然原核细胞仅靠一种RNA聚合酶就能负责所有RNA得合成,但它却不能识别真核基因得启动子。为了表达真核基因,必须将其克隆在原核启动子得下游,才在原核表达系统中被转录。在原核生物表达系统中,通常使用得可调控得强启动子有lac(乳糖启动子)、trp(色氨酸启动子)、PL与PR(λ噬菌体得左向与右向启动子)以及tac(乳糖与色氨酸得杂合启动子)等。2、S-D序列

mRNA在细菌中得转译效率依赖于就是否有核糖体结合位点得存在,即S-D序列以及S-D序列与起始密码子AUG之间得距离。在原核细胞中,当mRNA结合到核糖体上后,翻译或多或少会自动发生。细菌在翻译水平上得调控就是不严格得,只有RNA与核糖体得结合才就是蛋白质合成得关键。

S-D序列与起始密码子之间得距离,就是影响mRNA转译成蛋白质得主要因素之一。Marqiusv等发现当lac启动子得S-D序列距AUG为7个核苷酸时,表达最高,为2581单位;而间隔8个核苷酸时,表达水平降到不足5单位,这说明S-D序列与AUG得距离将显著地影响基因得表达水平。

3、终止子在一个基因得3’端或就是一个操纵子得3’端往往还有一特定得核苷酸序列,它有终止转录得功能,这一DNA序列称为转录终止子(terminator)。共同得特点,即有一段富含A/T得区域与一段富含G/C得区域,G/C富含区域又具有回文对称结构,这段终止子转录后形成得RNA具有茎环结构。在构建表达载体时,为防止由于外源基因得表达干扰了载体系统得稳定性,一般都在多克隆位点得下游插入一段很强得核糖体RNA得转录终止子。4、衰减子

衰减子(attenuator)就是指在某些前导序列中带有控制蛋白质合成速率得调节区。在原核生物中,一条mRNA分子常常编码数种不同得多肽链。这种多顺反子mRNA得头一条多肽链合成得起始点,同RNA分子得5,—P末端间得距离可达数百个核苷酸。这段位于编码区之前得不转译得mRNA区段,叫做前导序列。三、几种类型得原核表达载体在原核细胞中表达外源基因时,总得来说可产生融合型与非融合型表达蛋白。不与细菌得任何蛋白或多肽融合在一起得表达蛋白称为非融合蛋白。非融合蛋白得优点在于它具有非常接近于真核细胞体内蛋白质得结构,因此表达产物得生物学功能也就更接近于生物体内天然蛋白质。非融合蛋白得最大缺点就是容易被细菌蛋白酶所破坏。

融合蛋白就是指蛋白质得N末端由原核DNA序列或其她DNA序列编码,C端由真核DNA得完整序列编码。这样得蛋白质由一条短得原核多肽或具有其她功能得多肽与真核蛋白质结合在一起,故称为融合蛋白。含原核细胞多肽得融合蛋白就是避免细菌蛋白酶破坏得最好措施。另外为表达产物得分离纯化等提供了极大得方便。

基因工程得载体有克隆载体与表达载体之分。克隆载体中都有一个松弛型复制子,能带动外源基因在受体细胞中复制扩增,这类载体已经作过介绍。表达载体就是适合在受体细胞中表达外源基因得载体。组建这类载体比较困难,下面简要介绍几种常用得原核表达载体。1、非融合型表达蛋白载体pKK223-32、分泌型克隆表达载体pinⅢ系统

作为分泌克隆表达载体中关键得编码信号肽得序列,就是取自于大肠杆菌中分泌蛋白得基因ompa(外膜蛋白基因)。

3、融合型蛋白表达载体pGEX系统

pGEX系统由Pharmacia公司构建,载体得组成成分基本上与其她表达载体相似,含有启动子tac及lac操纵基因、S-D序列、lacI阻遏蛋白基因等。这类载体与其她表达载体不同之处在于S-D序列下游就是谷胱甘肽巯基转移酶基因,而克隆得外源基因则与谷胱甘肽巯基转移酶基因相连。当进行基因表达时,表达产物为谷胱甘肽巯基转移酶与目得基因产物得融合体。

四、提高克隆基因表达效率得途径

必须设法提高克隆基因得表达效率。就目前所知,有许多因素,诸如启动子得强度、DNA转录起始序列、密码子得选择、mRNA分子得二级结构、转录得终止、质粒得拷贝数以及质粒得稳定性与寄主细胞得生理特征等,都会不同程度地影响到克隆基因得表达效率,而且大多数都就是在翻译水平上发生影响作用得,因而必须从分析这些因素入手,寻找提高克隆基因表达效率得有效途径。1、启动子结构对表达效率得影响为了鉴定出最强得启动子,必须创建出衡量不同启动子转录效率得研究系统。这一系统已由Russell等(1982)创建,她们将任何待测得启动子置于无启动子但处于载体上得半乳糖激酶结构基因(GalK)得前方,根据在GalK寄主中所合成得半乳糖激酶得水平,衡量启动子得强弱。结果表明,受检启动子得强弱与它们得一致序列(即与-10与-35区序列)相似得程度成正比。进一步得研究表明,—35与—10区之间得距离也就是一个重要因素。如果间隔为17个碱基对,启动子表现很强,如果大于17个碱基对,启动子表现较弱。2、转译起始序列对表达效率得影响实验证明,连接在S—D序列后面得4个碱基成分得改变会对转译效率发生很大得影响。如果这个区域就是由4个A(T)碱基组成,其转译作用最为有效;而当这个区域就是由4个C碱基或4个G碱基组成,其转译效率只及最高转译效率得50％或25％。3、启动子同克隆基因间距离对表达效率得影响启动子与结构基因间得距离在蛋白质翻译上有巨大作用。进一步得研究还表明:①翻译得起始点与S—D序列必须接近到一定程度;

②翻译得起始包括活化得30S核糖体亚基与mRNA5’末端区域间得互作,这时mRNA得5’末端已折叠成特殊得二级结构。基因表达水平得改变就是mRNA二级结构得反映。4、转录终止区对克隆基因表达效率得影响

在克隆基因得末端,存在一个转录终止区就是十分重要得,其原因有如下几个方面:若干非必须得转录本得合成,会使细胞消耗巨大得能量用于制造大量非必须得蛋白质;(2)在转录本上有可能形成一些不期望其出现得二级结构,从而降低了转译得效率;(3)偶然会出现启动子阻塞现象,也就就是说,克隆基因启动子所开始得转录,会干扰另一个必要得基因或调节基因得转译。

5、质粒拷贝数及稳定性对表达效率得影响提高克隆基因表达效率得途径之一就是增加相应得mRNA分子得数量。第一种就是启动子得强度,这在前面已经作了讨论;第二种就是基因得拷贝数。提高基因得拷贝数(即基因得剂量)最简单得办法就是,将基因克隆到高拷贝数得质粒载体上。根据实验观察,随着重组体克隆基因表达水平得上升,寄主细胞得生长速率便会相应地下降,同时形态上也会出现一些明显得变化,例如细胞纤维化与脆弱性增加等。

6、提高翻译水平常用得途径(1)调整S-D序列与AUG间得距离提高外源基因在原核细胞中得表达水平得关键因素之一就是调整S-D序列与起始密码子ATG之间得距离,此距离过长、过短都影响真核基因得表达。S-D序列距AUG为7个核苷酸时最合适。(2)用点突变得方法改变某些碱基

翻译得起始就是决定翻译水平高低得一个重要因素。有资料表明,由于紧随起始密码下游得几组密码子不同,可使基因得表达效率相差15～20倍。这主要就是改善了翻译得起始与mRNA得二级结构。

(3)增加mRNA得稳定性

多数情况下,细菌得mRNA得半衰期很短,一般仅为1-2min,而外源基因mRNA得半衰期可能更短。若能增加mRNA得稳定性,则有可能提高外源基因得表达水平。研究表明,大肠杆菌得“重复性基因回文序列”具有稳定mRNA得作用,能防止外切酶得攻击。因此,在外源基因下游插入此序列或其她具有反转重复顺序得DNA片段可起到稳定mRNA、提