细胞免疫荧光实验顺序

细胞免疫荧光实验顺序

JennywascompiledinJai

细胞爬片免疫荧光实验步骤

第一天：

1.在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3min；

2.用4%的多聚甲醛固定爬片15min,PBS浸洗玻片3次，每次3min；

3.0.5%TritonXT00（PBS配制）室温通透20min（细胞谟上表达的抗原省略此步躲）；

4.PBS浸洗玻片3次，每次3min,吸水纸吸干PBS,在玻片上滴加正常山羊血清，室温封

闭30min；

5.吸水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗并放入湿盒，4C孵育

过夜；

第二天：

6.加荧光二抗：PBST浸洗爬片3次，每次3min,吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释

好的荧光二抗，湿盒中20-37℃孵育lh,PBST浸洗切片3次，每次3min；注意：从加荧

光二抗起，后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行。

7.复染核：滴加DAPI避光孵育5min,对标本进行染核，PBST5minX4次洗去多余的

DAP1；8.用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微

镜下观察采集图像。

细胞免疫荧光步骤

1.在24孔板里加500微升培养基，放爬片，接种细胞(做实验以30-50%汇合度较好。

10000-30000左右2.给药处理24ho3.PBS洗三遍。

8.收集一抗，PBS洗三遍，每次5min,摇床。孵育二抗AlexaFluor488(1:1000)，室温

60min(避光)

9.回收二抗,PBS洗三遍,摇床,每次5min。

10.0.5ug/mLDAPI(5%BSA配，2滴/ml)染核15min。(避光)

H.PBS洗三遍，每次5min,摇床。

12.取载玻片，滴加10uL抗荧光衰减封片剂，将爬片有细胞面盖在封片剂上，指甲油封片

子的对角线。

AllstepsforIF

1)RemoveculturemediumandfixcelIs(acommonfixativeis4%

formaldehydeinPBS,fori5minutes)

2)WashwellinPBS(3x5minutesistypical)

3)Permeabilizethecells(acommonpermeabilizationreagentisO.2%TritonX-

100inPBSfor30minutes)

4)WashwellinPBS

5)(optional:Blockfornon-specificdyebindingusingtheImage-

iTFXImageEnhancerSolution,136933)

6)Blockfornon-specificantibodybinding30-

60minutes(acommonb1ockingso1utionwouldbe3-

6%bovineserumalbumin/5%normalgoatserum/PBS,orcommercialblockingreagentslikeour

BlockAid,productB10710)

7)Incubateinprimaryantibodyfor30-

60minutes,inblockingsolutionorovernightat4degrees(antibodyconcentrationsvary,b

utusuallybetweenO.5-10ug/mL)

8)WashwellinPBS

9)Tncubateinsecondaryantibodyfor30-60minutes,in3"

6%bovineserumalhumin/PBS(agoodstartingantibodyconcentrationis5ug/mL)10)Washwel

linPBS

11)Counterstainasneeded(suchaswithDAPI,DI306)

12)Mountinappropriatemountingmedium