《现代农业生物技术》课件-5 6 7 -植物基因工程基础知识与技术

第三章植物基因工程基础知识与技术Chapter3BasicPrinciplesandTechniquesofGeneticEngineering基因工程的概念基因工程GeneticEngineering是指按照人类的愿望，利用DNA体外重组或PCR扩增技术从某种生物基因组中分离感兴趣的基因，或是用人工合成的方法获取基因，然后经过一系列切割，加工修饰，连接反应形成重组DNA分子，再将其转入适当的受体细胞，获得基因表达，改变生物原有的遗传特性，获得新品种、生产新产品或是研究基因的结构和功能的一门学科。又称遗传工程（geneticengineering）、重组DNA技术（recombinationDNAtechnique）。GeneticEngineeringreferstotheuseofDNAinvitrorecombinationorPCRamplificationtechniquestoisolateageneofinterestfromthegenomeofacertainorganismortoobtainagenebysyntheticmethodsaccordingtohumanwishes,andthentoformarecombinantDNAmoleculethroughaseriesofcutting,processing,modificationandligationreactions,andthentotransferitintotheappropriaterecipientcellstoobtainGeneexpression,changetheoriginalgeneticcharacteristicsoforganisms,obtainnewvarieties,producenewproducts,orstudythestructureandfunctionofgenesisadiscipline.ItisalsoknownasgeneticengineeringandrecombinationDNAtechnique.1972年，美国的Berg和Jackson等人将猿猴病毒基因组SV40DNA、λ噬菌体基因以及大肠杆菌半乳糖操纵子在体外重组获得成功。1973年，美国斯坦福大学的Cohen和Boyer等人在体外构建出含有四环素和链霉素两个抗性基因的重组质粒分子，将之导入大肠杆菌后，重组质粒得以稳定复制，并赋予受体细胞抗性，由此宣告了基因工程的诞生。基因工程的诞生理论上的三大发现1928年

肺炎双球菌的转化实验（格里菲思）1944年

肺炎双球菌中转化因子的确定实验（艾弗里）1952年

噬菌体侵染细菌实验（赫尔希）证实DNA是生物的遗传物质1950年鲍林等人提出DNA分子并非单链结构1952年威尔金斯和富兰克林推算出DNA分子的双链同轴排列螺旋结构1953年沃森和克里克利用碱基互补配对方案建立了DNA分子双螺旋结构1958年米西尔森和斯旦尔通过15N同位素培养大肠杆菌，离心测定DNA复制时的密度变化，证实了DNA的半保留复制DNA的双螺旋结构及半保留复制1954年伽莫夫提出了三个碱基决定一个氨基酸的构想1957年克里克提出了遗传信息传递的“中心法则”1961年布伦纳发现了遗传密码定位于mRNA1961年尼伦伯格等人证明了赖氨酸、脯氨酸和甘氨酸的密码子，并于1964年完全破译1965年布伦纳发现了三个终止密码子1966年A.J.Clark等发现了起始密码子遗传密码破译及遗传信息的传递方式技术上的三大发明1952年微生物的限制修饰现象被发现1968年Me-Selson和Yuan纯化获得了大肠杆菌K12的限制性内切酶，该酶具有识别位点功能，但无切割功能1970年H.Smith从流感嗜血杆菌中发现HindII限制性内切酶并找到了该酶的识别位点和切割位点截止1986年发现615种限制酶；到2005年，共发现3861种，商业化的有588种限制性内切酶的发现与DNA的切割1967年DNA连接酶同时在三个实验室发现，它是一种借助ATP或NAD水解提供能量催化DNA链的5’与另一DNA链的3’生成磷酸二酯键。主要种类：大肠杆菌DNA连接酶噬菌体T4DNA连接酶DNA连接酶的发现与DNA片段的连接1946年J.Lederberg和E.L.Tatum发现了大肠杆菌K12可以传递的遗传因子，初次被称之为致育因子，之后改为质粒1972年前后使用小分子量的细菌质粒和λ噬菌体作为载体1972-1976年五年时间对载体和受体系统进行有效安全性改造，并建立了一套严格的DNA重组实验设计与操作1965年人工牛胰岛素合成；1994年，中国抗虫棉基因工程载体的研究与应用主要内容001002基因工程的分子生物学基础基因、基因家族和基因组真核基因的结构与相关概念真核生物基因表达调控基因工程的分子生物学基础核酸的分离电泳技术PCR技术分子杂交技术生物芯片技术高通量测序技术核酸与蛋白质的互作技术第一节基因工程的分子生物学基础一、基因、基因家族和基因组1基因的概念Gene基因是一段具有遗传功能的特定核苷酸（DNA/RNA）序列，它指导合成一种功能性肽链，是遗传物质最小的功能单位。geneisaspecificsequenceofnucleotides（DNA/RNA）withageneticfunctionthatdirectsthesynthesisofafunctionalpeptidechainorRNAmolecule,whichisthesmallestfunctionalunitofgeneticmaterial.2基因的特点不同基因具有相同的物质基础；基因是可以切割的；基因是可以转移的；多肽和基因之间存在对应关系；基因的遗传密码是通用的；基因可以通过复制把遗传信息传给下一代。（1）不同基因具有相同的物质基础Watson、Crick的DNA双螺旋结构（2）基因是可切割的限制性内切酶（3）基因是可以转移的（4）多肽和基因之间存在对应关系（5）遗传密码是通用的生命的语言所谓“中心法则”，是指遗传信息在细胞内的生物大分子之间转移或传递的基本法则。

"Centraldogma",referstothebasiclawoftransferortransmissionofgeneticinformationbetweenbiologicalmacromoleculeswithinacell.（6）基因可以通过复制把遗传信息传给下一代DNA结构的探索过程1953年沃森和克里克提出DNA双螺旋结构2018年丹尼尔·克莱斯特发现‘I-基序’是一种DNA四链结。嵌入基序（i-motif）结构。2019年10月巨型DNA结构（Borgs）JillBanfield发现了第一个Borgs，并于2021年7月10日发表。2019年2月史蒂文·本纳发现新型人造DNA结构。由8个字母组成，信息存储密度加倍。2020年上海交通大学化学化工学院樊春海院士团队与美国亚利桑那州立大学HaoYan（颜颢）教授团队合作通用的“元DNA”（M-DNA）策略，研制出了一种新型元DNA结构。2021年AnjanaRao教授和VipulShukla博士等，发现了不寻常的DNA结构，称为G-四链体和R-环。3基因家族概念基因家族是来源于同一个祖先，由一个基因通过基因重复而产生两个或更多的拷贝而构成的一组基因，它们在结构和功能上具有明显的相似性，编码相似的蛋白质产物，同一家族基因可以紧密排列在一起，形成一个基因簇，但多数时候，它们是分散在同一染色体的不同位置，或者存在于不同的染色体上的，各自具有不同的表达调控模式。Genefamilyisagroupofgenesderivedfromthesameancestor,whichiscomposedoftwoormorecopiesofageneproducedbygenerepetition.Theyhaveobvioussimilaritiesinstructureandfunction,encodesimilarproteinproducts,andthegenesofthesamefamilycanbecloselyarrangedtogethertoformagenecluster,butmostofthetime,theyarescatteredindifferentpositionsofthesamechromosome.Orexistondifferentchromosomes,eachhasadifferentmodeofexpressionregulation.3基因家族概念4基因家族的特点是具有显著相似性的一组基因，编码相似的蛋白质产物；同一家族中的成员有时紧密的排列在一起，成为一个基因簇；分散在同一染色体的不同部位，甚至位于不同染色体上，具有各自不同的表达调控模式；外显子具有相关性。5基因组的概念基因组基因组代表任一生物体内所有染色体所包含的基因总和。它包含一系列DNA分子，每一个DNA分子都包含很多基因，维持基本生理功能的一整套基因，即配子所含的基因总和。Thegenomerepresentsthetotalnumberofgenescontainedinallthechromosomesofanorganism.ItconsistsofaseriesofDNAmolecules,eachofwhichcontainsmanygenes,thewholesetofgenesforbasicphysiologicalfunctions,thesumtotalofgenescontainedinthegamete6真核生物基因组有以下结构特点真核生物具有真正的核结构和一定数目的染色体。真核生物基因组远大于原核生物，染色体数目变化范围大。大部分基因具有内含子，因此真核基因一般是不连续的，又称断裂基因。非编码序列的量多于编码序列，存在大量重复DNA序列。6真核生物基因组有以下结构特点常见植物染色体数目及其倍型水稻玉米香蕉水仙马铃薯曼陀罗小麦倍型2n2n3n3n4n4n6n染色体数目24203330484842（1）真核生物具有真正的核结构和一定数目的染色体6真核生物基因组有以下结构特点（2）植物基因组往往比较大，染色体数目变化范围大世界上现在公认的基因组最大的生物是Parisjaponica,中文名衣笠草，约150Gb，大约是人类（3.2Gb）的50倍，是具有40条染色体的八倍体。已知的染色体数目最多的一个科叫Ophioglossum,中文名瓶爾小草科，属于蕨类，该科物种最多可有1260条染色体。衣笠草瓶爾小草6真核生物基因组有以下结构特点（3）大部分基因具有内含子，因此真核基因一般是不连续的一个断裂基因能够含有若干段编码序列，这些可以编码的序列称为外显子。在两个外显子之间被一段不编码的间隔序列隔开，这些间隔序列称为内含子。每个断裂基因在第一个和最后一个外显子的外侧各有一段非编码区，有人称其为侧翼序列。在侧翼序列上有一系列调控序列。6真核生物基因组有以下结构特点（4）非编码序列的量多于编码序列，存在大量重复DNA序列植物基因组重复序列含量往往更高，通过其重复程度，可将其分成:高度重复序列中度重复序列低度重复序列单一序列二、基因转录有关的结构二、基因转录有关的结构启动子外显子和内含子终止子增强子沉默子三、基因表达及其调控1基因表达基因表达是指基因的转录及翻译过程。Geneexpressionreferstotheprocessofgenetranscriptionandtranslation.并非所有基因表达过程都产生蛋白质，rRNA、tRNA编码基因转录合成RNA的过程也属于基因表达。RNA类型的发展探索过程20世纪50-60年代1957年Zemecnik发tRNA;1959年rRNA被分离得到;1961年法国Monod和Jacob提出mRNA的存在。1977年发现了在基因组水平遗传信息编码的不连续性，U1、U2等一批核小分子RNA（snRNA）1990年在哺乳动物的细胞中鉴定了第一个长lncRNA—H19。2007年正式开启研究。1996年在真核生物及古细菌中发现大量的snoRNA及类似小RNA。1986年在锥虫的线粒体中发现了RNA编辑现象，即由一批向导RNA（gRNA）所介导的遗传信息的改变。1993年哈佛大学Ambros在线虫中发现了第一个微RNAlin-4。2001年，鉴定出近百个与lin-4和let-7相似的的小分子RNA，并统一命名microRNA（miRNA，微RNA）RNA类型的发展探索过程2003年发现重复序列相关小RNA（rasRNA）2008年发现应激诱导tRNA衍生RNA（sitRNA），2014年鉴定新的sitRNA，2016年开发算法全面鉴定sitRNA。2012年分子生物学家JuliaSalzman通过RNA-Seq首次报道了CircRNA。2006年发现PIWI蛋白结合小RNA（piRNA）。2009年发现启动子相关小RNA（PASR）。1998年Fire等人首次证实双链RNA分子可诱导RNA干涉作用,随后发现一些二十几个核苷酸左右的双链小RNA，被称为小干扰RNA（siRNA）。2基因表达的特异性时间特异性（阶段特异性）某一特定基因的表达严格按照特定的时间顺序发生。Theexpressionofaparticulargeneoccursinstrictchronologicalorder.在个体生长过程中，某种基因产物按不同组织空间顺序出现。Duringindividualgrowth,certaingeneproductsappearindifferenttissuespatialsequences.空间特异性（组织特异性）3基因表达调控转录前的调控（1）转录水平的调控（2）转录后的调控（3）翻译水平的调控（4）翻译后的调控（5）3基因表达调控（1）

转录前的调控转录前水平的调控是指通过改变DNA序列（如有关基因的数量和顺序）和染色质结构，从而影响基因表达的过程，也称DNA水平的调控。PretranscriptionallevelregulationreferstotheprocessofinfluencinggeneexpressionbychangingDNAsequence（suchasthenumberandorderofrelatedgenes）andchromatinstructure,alsoknownasDNAlevelregulation.基因的丢失基因的扩增（拷贝数改变）基因重排与变换DNA甲基化与基因活性的调控染色质的异质化和活化（2）转录水平的调控转录水平的调控是真核生物基因表达的主要方式，转录调控是通过基因的顺式作用元件和反式作用因子之间的相互作用来实现的。顺式作用：指起调控基因作用的核酸序列与所调控的基因在同一条核苷酸链上。反式作用：对不同核苷酸链上的基因表达起调控作用的蛋白，编码该蛋白的基因与其识别结合作用的核酸链不是同一条链。顺式调控元件是基因周围能与特异转录因子结合而影响转录的DNA序列。分为启动子、增强子和沉默子等。反式作用因子是一种基因的蛋白质产物，能影响位于基因组另一条染色体上的（或基因组别处的）另一个基因的活性，它能够通过同顺式作用元件（DNA）之间的相互作用而影响基因表达。（3）转录后水平的调控将mRNA的加工成熟过程（包括5‘断加帽、3’端加poly(A)尾、剪切）、输出核外、胞内定位和降解等过程的调控称为转录后水平的调控。TheregulationofmRNAprocessingandmaturation(including5'cleavagecapping,3'endpluspoly(A)tail,splicing),extranuclearexport,intracellularlocalization,degradationandotherprocessesiscalledpost-transcriptionalregulation.（4）翻译水平的调控mRNA完成加工后进入蛋白质合成翻译阶段的调控。主要表现在4个方面：mRNA的“扫描模式”与蛋白质合成起始mRNA帽子结构的识别与蛋白质合成mRNA的稳定性与基因表达调控可溶性蛋白因子修饰与翻译起始调控（5）翻译后水平的调控翻译初产物需经加工、修饰才具有活性，翻译后的调控主要是指蛋白质的翻译后修饰。剪切化学基团的修饰酶原的激活蛋白质的易位蛋白质的折叠和加工第二节基因工程的基本技术基因工程的基本技术核酸分离技术01电泳技术02PCR技术03杂交技术04生物芯片技术05核酸与蛋白互作技术07高通量测序技术06一、核酸分离技术基因组DNA提取方法RNA提取方法细菌质粒DNA提取CTAB法SDS法磁珠法离心柱法异硫氰酸胍法苯酚-SDS法CTAB法LiCl-尿素法试剂盒法Trizol法碱裂解法煮沸法试剂盒法（一）植物基因组DNA提取技术纯化1CTAB法1.1原理CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（>0.7mol/LNaCl）是可溶的；当盐浓度降低到一定程度（<0.3mol/LNaCl）时，从溶液中沉淀。通过离心和有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质。加入乙醇使核酸沉淀，而CTAB溶于乙醇。注：CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。1.2CTAB提取缓冲液的经典配方组份Tris-HCl（pH8.0）

EDTA（pH8.0）

NaClCTABβ-巯基乙醇终浓度100mM20mM1.4M2%(W/V)0.1%（V/V）使用前加入Tris-HCl（pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl提供一个高盐环境，使DNA充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除。1.3CTAB法流程图植物材料细胞裂解65℃,30～60min上清液液氮研磨提取液DNA溶解ddH2O,50ul抽提等体积氯仿/异戊醇（24:1）离心4℃,8000rpm,5min沉淀核酸－20℃无水乙醇,2×离心4℃,12000rpm,8min离心25℃,12000rpm,8min上清液干燥自然风干，2～3h洗脱－20℃75％乙醇,1ml离心4℃,8000rpm,5min

弃上清2SDS法2.2SDS法DNA提取缓冲液组份Tris-HCl

（pH8.0）

EDTA（pH8.0）

NaClSDSTris-HCl

（pH8.0）终浓度10mM20mM0.4M2%10mM2.1SDS法原理SDS（十二烷基硫酸钠）是一种阴离子去垢剂，在高温（55～65℃）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；然后采用提高盐浓度(5mol/LKAc或NH4Ac)并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀。上清液中的DNA用酚/氯仿反复抽提去除蛋白质，再用乙醇沉淀水相中的DNA。2.3SDS法流程图植物材料细胞裂解65℃,30～60min上清液液氮研磨提取液DNA溶解ddH2O,50ul抽提等体积氯仿/异戊醇（24:1）离心4℃,8000rpm,5min沉淀核酸－20℃无水乙醇,2×离心4℃,12000rpm,8min离心4℃,12000rpm,8min上清液干燥自然风干，2～3h洗脱－20℃75％乙醇,1ml离心4℃,8000rpm,5min

弃上清3离心柱法3.1基本原理主要是利用离心柱表面的树脂或硅胶膜对DNA先进行特异性吸附，然后在高pH值低盐环境下向DNA与提取物的混台液中加入TE等洗涤剂,经过离心、漂洗等步骤,最终将离心柱表面的杂质去除，获得DNA。离心柱法提取DNA需经过多次离心处理,因此在杂质的分离去除方面效果较好，提取出的DNA纯度较高,且降解的可能性比较小。近些年,以离心柱提取法为原理的试剂盒也应运而生，DNA提取效果较好，应用广泛。3.2离心柱法流程图4磁珠法4.1基本原理磁珠法提取DNA是一项将生物分子技术与纳米材料科学相结合的新型技术，是我国DNA提取纯化领域的一项重大突破,该技术主要是利用纳米技术改良纳米颗粒,并对磁珠表面进行修饰，制备成硅纳米磁珠,该磁珠表面具有的可吸附DNA的官能团，磁珠可以分散于基液中形成磁性基液，使其同时具有液体的流动性和固体的颗粒性，从而促进DNA与蛋白质分离。与其他DNA提取法相比，磁珠法的自动化程度较高,磁珠或磁性基液在磁场的作用下可以自动发生聚集或者扩散,将DNA分离与富集相结合，再经过RNA酶等、纯净水或者TE等洗脱液处理,便可得到纯度较高的DNA。4.2磁珠法流程图（一）植物基因组DNA提取技术纯化（一）植物基因组DNA提取技术纯化（二）植物RNA提取方法化1.异硫氰酸胍-超速离心法异硫氰酸胍(Guandinethrocyanate,简称GITC)是一类解偶联剂,与细胞作用后,蛋白质空间结构消失,蛋白质迅速与核酸解离,细胞结构降解,释放出RNA。z优点：冷冻时间长、细胞质和细胞核不易分离的组织标本。z缺点：操作复杂、流程长，一次提取的样品数量有限。1异硫氰酸胍-超速离心法2Trizol法Trizol是一种新型总RNA抽提试剂。这种方法包括用含异硫氰酸胍和酚的一种单相液裂解细胞。加入氯仿产生第二相（有机相），DNA和蛋白质在有机相中被抽提，酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层（无色）主要为RNA，有机层（黄色）主要为DNA和蛋白质。最后用异丙醇沉淀获得RNA。1.选择新鲜组织，生长旺盛的组织。2.样品量和Trizol的加入量一定要按步骤比例，不能随意增加样品量或减少Trizol量，否则会使内源性RNase的抑制不完全，导致RNA降解。3.实验过程必须严格防止Rnsae的污染。注意事项2Trizol法3苯酚-SDS法SDS是一种阴离子去污剂，主要作用是使核蛋白与核酸复合物分离。苯酚(Phenol)是一种易燃、腐蚀性强、毒性强的化合物，能够快速使蛋白质变性，但是不能完全抑制RNase的活性。此法的原理是用强变性剂(酚／SDS)裂解细胞以及用去蛋白剂抑制DNA酶和分离蛋白质与RNA。z优点：操作简单，提取时间短。z缺点：在RNA提取过程中，产生较高含量的多酚类杂质，且所提取的植物总RNA无法进行反转录实验。4CTAB法5LiCl-尿素法尿素具有抑制RNAase的特性，Licl-尿素法,用高浓度尿素抑制RNA酶并分离核蛋白与核酸。z优点：方法简单，成本低。z缺点：Licl沉淀小分子RNA不完全。6试剂盒法利用盐酸胍裂解样本，抑制RNase的活性；β-巯基乙醇变性蛋白，通过离心柱上的吸附膜，特异性吸附RNA。z优点：操作简便、快速，安全、产物纯度高，可随时用于下游实验。z缺点：多数需要手动操作，可能会滤膜堵塞，对RNA大小有要求。Biospin试剂盒提取流程图RNA提取方法的发展（三）质粒DNA提取方法化1碱裂解法1.1碱裂解法原理染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象；变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。1.2碱裂解法溶液配制

溶液I：10mmol/LEDTA(pH=8.0)50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris-HCl(pH=8.0)用ddH2O配制，高压灭菌15min，贮存于4℃。溶液II：0.2mmol/LNaOH1%SDS溶液Ⅲ：5mol/LKAc1.3质粒DNA提取—碱裂解法流程图对数生长期菌体(液体培养）离心4℃,12000rpm,30s弃上清溶液Ⅰ（冰浴）100ul,剧烈振荡溶液Ⅱ200ul,冰浴3min溶液Ⅲ150ul,冰浴3~5min离心4℃,12000rpm,5min上清液等体积(酚:氯仿=1:1）离心4℃,12000rpm,2min上清液加入等体积氯仿离心4℃,12000rpm,2min上清液加入无水乙醇2×弃上清液加入70％乙醇洗脱2次DNA溶解加入ddH2O50ul离心4℃,12000rpm,5min2.煮沸法2.1煮沸法原理经TritonX-100、溶菌酶和加热处理可从小量（1~2ml)细菌培养物中分离质粒DNA所获得的质粒则可以用电泳或限制性内切核酸酶消化的方法鉴定；经PEG处理进一步纯化后，其可以用做DNA测序反应的模板。2.2煮沸法溶液配制乙醇异丙醇乙酸钠（3.0mol/L，pH5.2）STETTE（pH8.0），含20μg/ml的RNaseA溶菌酶（10mg/ml）2.3质粒DNA提取——煮沸法流程图对数生长期菌体（液体培养）离心4℃，12000rpm，30s弃上清重悬细菌沉淀用350μlSTET25μl溶酶体溶液，涡旋混合3s沸水浴40s离心室温，12000rpm，15min收集上清液40μl乙酸钠和420μl异丙醇振荡混匀室温放置5min离心4℃，12000rpm，10min弃上清漂洗核酸沉淀4℃，1ml70%乙醇溶解DNA50μl含RNaseA的TE离心，挥发完乙醇3试剂盒法（TIANGEN质粒小提试剂盒）3.1试剂盒法原理采用碱裂解法裂解细胞，再通过离心吸附柱在高盐状态下特异性的结合溶液中DNA。3.2产品组成平衡液BL漂洗液PW溶液P1洗脱缓冲液溶液P2吸附柱CP3溶液P3收集管3.3质粒DNA提取-试剂盒法流程图柱平衡CP3中加入500μlBL弃废液对数生长期菌体（液体培养）离心常温，12000rpm，1min离心常温，12000rpm，1min弃废液悬浮细菌沉淀250μlP1裂解菌体250μlP2沉淀杂质350μlP3离心常温，12000rpm，10min取上清液上清液加入CP3离心常温，12000rpm，10min弃废液漂洗两次600μlPW洗涤离心常温，12000rpm，10min彻底晾干CP3洗脱DNA50-100μlEB离心收集DNA常温，12000rpm，2min（四）核酸的纯化1糖的去除用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5MKAc，高盐可溶解多糖。用多糖水解酶将多糖降解。在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖。在500μLDNA液中加入200μl20%PEG8000(含1.2MNaCl)，冰浴20min。（四）核酸的纯化2多酚的去除在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：β-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合。3盐离子的去除

70％的乙醇洗涤（五）核酸的检测DNA:A(260）：A(280）≈1.8(<1.8时，有蛋白质、小分子片段、多酚物质污；>2.0时，有RNA污染）

RNA:A(260）：A(230）>2.01紫外光谱分析法测定λ＝230、260、280的吸光度（A)。按1A(260)=50μg/mlDNA或40μg/mlRNA（五）核酸的检测2凝胶电泳法琼脂糖凝胶用于分离大于200～1000bp的片段；操作简单、快速，且分离范围广，分辨率高。琼脂糖浓度（％）分辨DNA片段的范围（bp)0.61000～100000.7800～100000.9500～70001.2400～60001.5200～30002.0100～2000琼脂糖凝胶电泳图DNA的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的电泳检测RNA的凝胶电泳检测DNA纯化前凝胶电泳检测DNA纯化后凝胶电泳检测二电泳技术1基本定义3操作步骤2电泳分类4注意事项基本定义电泳分类操作步骤注意事项在电场的作用下，带电粒子向着与其电性相反的电极移动的现象称为电泳。利用各种带电粒子电泳速度不同，对物质进行分离，然后对物质进行定性和定量的分析方法称为电泳分析法，也叫电泳技术。电泳技术Themovementofchargedparticlestowardselectrodesoppositetheirelectricalpropertiesundertheactionofanelectricfieldiscalledelectrophoresis.Usingavarietyofchargedparticleselectrophoresisspeedisdifferent,theseparationofsubstances,andthenqualitativeandquantitativeanalysisofsubstancescalledelectrophoresisanalysismethod,alsoknownaselectrophoresistechnology.electrophoresistechnology基本定义电泳分类操作步骤注意事项+-1定义基本定义电泳分类操作步骤注意事项常见电泳设备的基本结构电泳电源电泳槽附加装置基本定义电泳分类操作步骤注意事项电泳电场强度常压电泳、高压电泳电泳媒介自由电泳、区带电泳分离目的分析电泳、制备电泳、血清蛋白电泳、核酸电泳载体位置或形状水平电泳、垂直电泳、板状电泳、柱状电泳、U型管电泳、毛细管电泳载体形状板状电泳、柱状电泳、U型管电泳、毛细管电泳2分类基本定义电泳分类操作步骤注意事项基本定义电泳分类操作步骤注意事项类型介质原理特点纸电泳纸（纤维素）质荷比操作简单、分辨率低醋酸纤维素薄膜电泳醋酸纤维质荷比在纸电泳基础上的改进，操作简单、分辨率差琼脂糖凝胶电泳琼脂糖质荷比+分子筛快速，分辨率高但电渗现象严重，孔径大，常用于核酸的研究聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶分子筛可调节凝胶孔径，分辨率高，无电渗现象，高浓度凝胶难剥离，用于测定蛋白质亚基的分子量几种常见电泳的比较基本定义电泳分类操作步骤注意事项常见电泳纸电泳醋酸纤维素薄膜电泳琼脂糖凝胶电泳基本定义电泳分类操作步骤注意事项3操作步骤—琼脂糖凝胶电泳制胶加样电泳检测基本定义电泳分类操作步骤注意事项3操作步骤—聚丙烯酰胺凝胶电泳制胶加样电泳剥胶与固定染色与脱色分离胶、浓缩胶三氯醋酸溶液考马斯亮蓝垂直板基本定义电泳分类操作步骤注意事项4注意事项凝胶浓度选择根据样品DNA分子大小而定，所以电泳前应对DNA片段大小有粗略的估计。用胶带纸封闭胶床两端时，要确保严密，以免灌胶时有胶液漏出。用微波炉熔化琼脂糖时，应控制好时间，以免产生气泡，使琼脂糖溢出来。凝胶冷却至60℃左右，立即铺胶，以防凝固。上样前检查样品孔内是否有气泡，并设法排除。加样时，要轻贴样品孔壁，但不要碰坏孔壁，否则电泳条带不整齐。电泳前，确认样品孔位于电场负极。EB具有强诱变性，可致癌。必须戴手套操作，严格注意防护。紫外光对人眼有害，观察时加盖玻璃罩，观察时间不宜太长。三、PCR技术聚合酶链式反应(Polymerasechainreaction,PCR):1PCR的概念是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，即用一对寡聚DNA作为引物，以高温变性－低温退火－适温延伸作为一个周期，通过多次循环使目标DNA片段得到扩增的方法。ThePolymerasechainreaction(PCR)isamethodofenzymaticsynthesisofspecificDNAfragmentsinvitro,whichusesapairofoligomerDNAasprimersandamplifiesthetargetDNAfragmentsthroughmultiplecycles,includinghightemperaturedenaturation,lowtemperatureannealingandwarmextension.1PCR的概念PCR是Mullis于1986年发明的一项体外快速大量扩增DNA片段的方法（获1994年诺贝尔奖）。基本原理：在体外模拟细胞内DNA复制的过程，在反应系统中加入欲被扩增的DNA片段，作为模板；人工合成的寡聚核苷酸，作为引物；耐热的DNA聚合酶（Taq）以及四种核苷酸三磷酸。这种扩增产物是以指数形式积累的，经25－30个循环后，一般扩增倍数可达106～107。目的:用于扩增位于两段已知序列之间的DNA区段。DNA扩增PCR反应PCR扩增DNA示意图2PCR技术的基本要素TaqDNA聚合酶引物dNTPMg2+模板ddH2O缓冲液2.1TaqDNA聚合酶水生栖热菌(thermus

aquaticus,Taq)中分离纯化的DNA聚合酶。特点：①具有较高的热稳定性，能在PCR循环中保持较高的活性。半衰期：92.5℃130min；95℃40min；97.5℃5～6min②在相当宽的温度范围内都能催化核苷酸聚合。变性温度：≤95℃使其在整个扩增循环中保持足够活性，最适聚合酶温度72℃，所以选择72℃延伸③有5’→3’DNA聚合酶活性和外切酶活性，但无3’→5’外切酶活性。无3’→5’外切酶活性，便失去了3’→5’方向的校正活性，因而对核苷酸的错误掺入不具校正功能。35轮0.25%错配，与原始模板有差别。(致命缺点)2.2引物引物在结构组成上应满足以下条件：①引物长度在15～30个核苷酸，Tm接近72℃较佳（一般Tm=55℃～60℃）。

Tm值计算公式：Tm=(G+C)×4＋（A+T)×2②G+C碱基的含量在45％～55％左右。③引物中碱基的分布应该是随机的，避免出现一连串的单一碱基。④引物之间连续互补碱基也应小于4个。⑤两个引物在3’必须与模板互补，5’端可以不互补。⑥在引物5’端增加保护碱基。2.3模板影响PCR的主要因素是模板的数量和纯度，一般反应中模板数量控制在102～105个拷贝较好。模版用量过多可能增加非特异性产物。模版DNA可以是单链分子，也可以是双链分子；可以是线状分子，也可以是环状分子。线状分子比环状分子的扩增效果好。2.4dNTP（三磷酸脱氧核苷酸）四种脱氧核苷酸（dATP、dGTP、dCTP、dTTP)，基本原料终浓度：50

M注意：不稳定，保存时间长会失效2.5Mg2+Mg2+既影响TaqDNA聚合酶的活性和真实性，又影响引物退火、模板和PCR产物的解链温度、产物的特异性以及引物二聚体的生成。PCR体系中Mg2+浓度一般为0.5-2.5mmol/L。PCR体系中影响Mg2+浓度因素EDTA鳌合Mg2+，因此选较低浓度TE(10mMTris,1mMEDTA)；DNA模板、引物和dNTP的磷酸基团均可与Mg2+结合，降低Mg2+有效浓度，因此扩增产物或效率不理想，要注意调整合适的Mg2+浓度。2.6温度和时间变性温度：94-95℃GC比例高、长度很长，则变性T↑退火温度：温度越高，扩增特异性越好延伸温度：一般：40-60sec

500nt-1min

500nt-3min3PCR技术的特点操作简单，省时省工灵敏度高，特异性强有少量的单核苷酸错误的渗入对原始材料（DNA模板）的质量要求低4PCR技术的类型降落（递减）PCR（touchdownPCR）技术逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）技术等位基因特异性PCR（AS-PCR）技术锚定PCR（APCR）技术反向PCR（IPCR）技术4PCR技术的类型修饰引物PCR技术不对称

PCR

(

asymmetric

PCR

）技术巢式PCR（nestedPCR）技术实时荧光定量PCR（real-timePCR/quantitativePCR）技术单链构型多态性PCR（SSCP-PCR）技术5可能存在的问题以及解决办法5.1没有得到所期望的PCR产物检查酶是否有活性，确定是否加入酶；检验DNA解链是否充分；检查引物合成是否正确；采用热启动技术，既在PCR反应的第一个循环中待温度升高且超过模板Tm值（80℃）后再加关键试剂如TaqDNA聚合酶等。5.2PCR产物在凝胶电泳中呈片状减少TaqDNA聚合酶的浓度；增加退火温度；适当降低Mg2+浓度；减少退火时间以及延伸时间；减少循环次数；可从凝胶中回收与目标DNA片段大小相同的DNA，再次进行PCR扩增。5.3出现引物二聚体带检查引物的3’端是否互补；设计较长的引物再试；增加模板DNA的量；适当降低引物浓度；减少循环次数；适当增加退火温度。5.4PCR产物特异性不够增加退火温度；减少或延长退火温度；改变Mg2+浓度。降低引物和TaqDNA聚合酶的浓度；四、核酸杂交技术1杂交原理带有互补的特定核苷酸序列的DAN或RNA，混合在一起，其相应的同源片段通过碱基配对形成双链结构。形成的双链分子称为杂种核酸分子。有DNA:DNA、DNA:RNA两种类型。DANorRNAwithcomplementaryspecificnucleotidesequences,mixedtogether,theircorrespondinghomologousfragmentsbybasepairingtoformadouble-strandedstructure.Theresultingdouble-strandedmoleculeiscalledahybridnucleicacidmolecule.TherearetwotypesofDNA:DQZNAandDNA:RNA.2杂交步骤将核酸药品转移到固体支撑物滤膜上（尼龙滤膜、硝酸纤维素膜）。核酸转移将具有核酸印迹的滤膜用带有标记的DNA或RNA探针进行杂交。印迹杂交3探针3.1探针的概念是指经过放射性或非放射性物质标记的已知或特定的DNA或RNA序列。ItreferstoaknownorspecificDNAorRNAsequencelabeledbyaradioactiveornon-radioactivesubstance.3.2主要探针的类型同位素标记探针①生物素标记探针②地高辛标记探针③辣根过氧化物酶标记探针非同位素标记探针4核酸杂交4.1Southern杂交概念：根据毛细管作用原理，使在电泳凝胶中分离的DNA经转膜后与DNA探针杂交以检测这些被杂交的DNA片段。Accordingtotheprincipleofcapillaryaction,DNAisolatedinelectrophoreticgelishybridizedwithDNAprobeaftertransmembranetodetectthesehybridizedDNAfragments.用途检测基因的拷贝数转基因中外源基因的整合鉴定RFLP分子标记SouthernBlot操作步骤DNA

琼脂糖电泳印迹转移预杂交杂交（变性探针）洗膜放射自显影或显色DNA和RNA从琼脂糖凝胶向上的毛细管转移4.2Northern杂交概念：将RNA分子从电泳凝胶转膜后，以DNA

或RNA为探针进行核酸杂交的方法。RNAmoleculesaretransferredfromelectrophoreticgeltoDNAaftermembraneOrRNAasaprobefornucleicacidhybridization.用途：主要用于检测基因的表达情况。Southern杂交与Northern杂交的基本步骤4.3Western杂交原理：将通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维素或PVDF膜上，然后与能特异性识别待检蛋白的抗体进行反应，洗涤去除没有结合的特异性抗体后，加入标记的、能识别特异性抗体的种属特异性抗体，反应一段时间后再次洗涤去除非特异性结合的标记抗体，加入适合标记物的检测试剂进行显色或发光等，观察有无特异性蛋白条带的出现，也可通过条带的密度大小来进行特异性蛋白的半定量。操作过程：SDS电泳转膜（PVDF或硝酸纤维素膜）封闭一抗洗涤酶标二抗反应洗涤显色或化学发光显影五、DNA芯片技术基因芯片(Genechip)技术是指通过微阵列(Microarray)技术将高密度DNA片段阵列通过高速机器人或原位合成方式以一定的顺序或排列方式使其附着在如玻璃片等固相表面，以荧光标记的DNA探针，借助碱基互补杂交原理，进行大量的基因表达及监测等方面研究的最新革命性技术。GenechiptechnologyreferstousingMicroarraytechnologytoattachthearrayofhighdensityDNAfragmentstothesurfaceofsolidphasesuchasglassplateinacertainorderorarrangementthroughhigh-speedrobotorin-situsynthesis.Withthehelpoftheprincipleofbasecomplementaryhybridization,thefluorescentlabeledDNAprobecanbeused.Carryoutalargenumberofgeneexpressionandmonitoringandotheraspectsofthelatestrevolutionarytechnology.基因芯片发展历史cDNAmicroarrayexpressionpatternsofsmall(S)andlarge(L)neurons基因芯片基因工程测序技术六、高通量测序技术1基因测序技术概念与发展基因测序技术也称作DNA测序技术，即获得目的DNA片段碱基排列顺序的技术，获得目的DNA片段的序列是进一步进行分子生物学研究和基因改造的基础。2第一代测序技术1975年由FrederickSanger所提出的链终止法以及1977年由WalterGibert所发明的链降解法被称为第一代测序技术。1977年，WalterGilbert和FrederickSanger发明了第一台测序仪，并应用其测定了第一个基因组序列，噬菌体X174，全长5375个碱基。技术原理目前，基于第一代测序技术的测序仪几乎都是采用Sanger提出的链终止法。链终止法测序的核心原理是ddNTP的2'和3'端都不含羟基，因此在合成核酸链的过程中无法形成磷酸二酯键，从而导致DNA合成反应中断。在测定待测核酸片段的序列时，向反应体系中加入一定比例的带有放射性同位素标记的4种ddNTP，利用DNA聚合酶来延伸结合在待测核酸模板上的引物，直到掺入一种链终止核苷酸为止，最终会得到一组长度各相差一个碱基的链终止产物，这些产物可通过高分辨率变性凝胶电泳分离并根据其长度排序，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影进行检测，从而确定目的核酸片段各个位置的碱基。测序步骤完整的测序过程分为4步测序步骤总结高通量测序技术(HTS)是对传统Sanger测序技术革命性的变革，可以一次对几十万到几百万条核酸分子进行序列测定，因此也称其为下一代测序技术(NGS)，高通量测序技术的出现使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能。3第二代测序技术技术平台Roche/454ABI/SOLiDSOLiD测序技术与454技术的原理比较类似，同样是采用油包水的方式进行EmulsionPCR。不同之处在于SOLiD形成的小水滴要比454系统小得多，只有1μm大小，并且在PCR扩增的同时对扩增产物的3'端进行修饰，为下一步的测序做准备。在PCR完成之后，测序时，其反应底物不是dNTP也不是ddNTP，而含有8个碱基的单链荧光探针混合物，在测序时，这些探针按照碱基互补规则与单链DNA模板链配对，不同的探针的5'末端分别标记不同颜色的荧光染料，每两个碱基确定一个荧光信号，相当于一次能决定两个碱基，因此，这种测序方法也被称为两碱基测序法。ABI/SOLiDIllumina/Solexa通过不同的方法将打碎的DNA碎片末端连接序列已知的接头，构建单链DNA测序文库。将测序文库的每一条单链DNA通过特异性的接头固定在一个固体支撑体上，固体支撑体的每一个单独小空间中只包含一条DNA链，之后通过PCR特异性的将模板DNA进行富集，从而达到测序所需的模板量。对每一个单独的链进行碱基互补配对，反应试剂清洗和成像捕捉，不断反复进行此三步循环，每一个循环按顺序测定序列中的一个碱基。Illumina/Solexa总结4第三代测序技术以PacBio公司的SMRT技术和OxfordNanoporeTechnologies公司的纳米孔单分子技术为代表的新一代测序技术被称为第三代测序技术。与前两代测序技术相比，其最大的特点就是单分子测序，测序过程无需进行PCR扩增，并且理论上可以测定无限长度的核酸序列。PacBio技术平台SMRT芯片是一种带有很多ZMW孔的厚度为100nm的金属片，将DNA聚合酶、待测序列和不同荧光标记的dNTP放入ZMW孔的底部。荧光标记的位置是磷酸基团，当一个dNTP被添加到合成链上的同时，它会进入ZMW孔的荧光信号检测区，根据荧光的种类就可以判定dNTP的种类，从而获得核酸的碱基序列信息。PacBio平台测序原理每个ZWM孔只允许一条DNA模板进入，DNA模板进入后，DNA聚合酶与模板结合，加入4种不同颜色荧光标记4种dNTP，其通过布朗运动随机进入检测区域并与聚合酶结合从而延伸模板，与模板匹配的碱基生成化学键的时间远远长于其他碱基停留的时间，因此统计荧光信号存在时间的长短，可区分匹配的碱基与游离碱基。通过统计4种荧光信号与时间的关系，即可测定DNA模板序列。PacBio平台测序原理PacBio平台技术关键DNA聚合酶，该技术得到的序列读长主要跟DNA聚合酶的活性有关，它主要受激光对其造成的损伤所影响。荧光基团标记在核苷酸3'端磷酸上，在DNA合成过程中，3'端的磷酸键随着DNA链的延伸被断开，标记物被弃去，减少了DNA合成的空间位阻，维持DNA链连续合成，延长了测序读长。ZMW(零模波导孔)，将反应信号与周围游离碱基的强大荧光背景进行区分，在一个反应管中有许多这样的圆形纳米小孔，其外径仅有100nm，激光从底部打出后不能穿透小孔进入上方溶液区，能量被限制在一个小范围里，使得荧光信号仅来自这个小反应区域，孔外其它游离核苷酸单体依然留在黑暗中，从而实现将背景荧光降到最低。Nanopore技术测序原理将在某一面上含有一对电极的特殊脂质双分子层置于一个微孔之上，该双分子层中含有很多由α溶血素蛋白组成的纳米孔，并且每个纳米孔会结合一个核酸外切酶。当DNA模板进入孔道时，孔道中的核酸外切酶会“抓住”DNA分子，顺序剪切掉穿过纳米孔道的DNA碱基，每一个碱基通过纳米孔时都会产生一个阻断，根据阻断电流的变化就能检测出相应碱基的种类，最终得出DNA分子的序列。Nanopore技术测序原理总结5植物基因组测序2000年12月，第一个植物参考基因组拟南芥的完整基因组序列的发表预示着植物基因组时代的开始。在过去的20年中，已经为数百种植物产生了参考基因组，从非维管植物到开花植物。最近一项使用PacBio和Nanopore测序技术以及基于光学图谱的管道对玉米基因组(B73-Ab10)的研究成功地实现了染色体的无间隙组装，而无需人工干预。这是来自大型复杂基因组的任何染色体的第一个，并且通过将新的测序技术与组装算法相结合显示出巨大的潜力植物基因组测序进展到2020年底，已对788个不同植物物种（包括亚种）的1031个基​​因组进行测序和发表，并且数量继续呈指数增长自2000年拟南芥基因组发表以来，在染色体和非染色体水平测序的植物基因组数量。被子植物中基因组测序最多的前10个科。被子植物中测序的多倍体基因组数量。6转录组测序转录组(transcriptome)

是指特定生物体在某种状态下所有基因转录产物的总和，转录组研究是功能基因组研究的一项重要内容，转录组是连接基因组遗传信息与生物功能(蛋白质组)的必然纽带。Transcriptomereferstothesumofalltranscriptionproductsofgenesofspecificorganismsunderacertainstate.Transcriptomeresearchisanimportantcontentoffunctionalgenomicsresearch,whichistheinevitablelinkbetweengenomicgeneticinformationandbiologicalfunctions(proteomics).6转录组测序RNA-seq也称为全转录组鸟枪测序，应用高通量测序技术对样品中的mRNA、smallRNA和non-codingRNA进行测序的技术，其中针对mRNA的RNA-Seq测序即为转录组测序。RNA-seqisalsoknownasfulltranscriptomeshotgunsequencing,whichuseshigh-throughputsequencingtechnologytosequencemRNA,smallRNAandnon-codingRNAinsamples,amongwhichRNA-SEqsequencingformRNAistranscriptomesequencing.6转录组测序RNA-Seq可进行全基因组水平的基因表达差异研究，具有定量更准确、可重复性更高、检测范围更广、分析更可靠等特点。除了分析基因表达水平，RNA-Seq还能发现新的转录本、SNP、剪接变体，并提供等位基因特异的基因表达，能够全面快速地获得某一物种特定组织或器官在某一状态下的几乎所有转录本序列信息。转录组测序方法二代测序：市场占有率最高的Illumina测序平台为例，可分为文库构建→混合上机→获取序列→数据分割→分析比对转录组测序方法二代测序需要制备能够被测序仪直接分析的带有特定序列并在一定长度范围的测序文库，因此我们需要结合RNA富集、片段化、反转录、加接头、PCR扩增、长度选择等方法，获取带有接头序列（用于桥式PCR扩增）、Barcode序列（用于区分不同样品）以及插入的待测cDNA片段的序列。转录组测序方法常规的测序文库转录组测序方法转录组测序上机流程转录组分析流程转录组测序原理Illumia测序原理：就是将文库结合到测序芯片上，并通过PCR将单一序列扩增成簇以提高信号强度（具体步骤请搜索“桥式PCR”），然后测序时收集每一簇的荧光信号，并转换为相应的碱基，从而获取测序数据。7蛋白质组测序蛋白质组：由一个细胞、一个组织或一个机体的基因组所表达的全部相应的蛋白质，是一个整体的概念。蛋白质组学：以蛋白质组为研究对象，从蛋白质整体水平来认识重合活动规律的科学，是后基因组计划的重要组成部分。蛋白质组学本质上指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平、翻译后的修饰、蛋白质与蛋白质相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病机理、细胞代谢等过程的整体而全面的认识。蛋白质组学分类常用的是非标LabelFree，以及标记的iTRAQ分板技术。iTRAQiTRAQ：同重元素标记的相对与绝对定量技术，在微生物抗协迫机制和动植物发育分化机理研究及医学生物标记物筛选领域都有广泛应用。iTRAQ：采用4种或8种同位素标签，通过特异性标记多肽的氨基基团，进行串联质谱分析从而比较不同样本中蛋白质的相对含量。其特点是：蛋白通量高，覆盖度高；定量准确，可信度高；分离能力强、分析范围广，定性结果可靠；自动化程度高、分析时间快，分离效果好。iTRAQ的实验原理在质谱峰图中，虽然不同样本带有不同的同位素标签，但是经过质量平衡基因的平衡，任何一种试剂标记不同样本中的同一蛋白多肽表现为相同的质荷比，从而形成单一的峰。在串联质谱结果中，经过激光通量轰击肽段，iTRAQ试剂的三部分之间的键断裂，平衡基因断裂，基团丢失。不同同位素标签的同一多肽的离子信号表现为不同质荷比的峰，因此可根据波峰的高度和面积比较同一蛋白不同处理的定量信息。iTRAQ的实验原理iTRAQ的实验流程蛋白酶解样本，也就是将蛋白样本酶解为肽段；使用iTRAQ同位素标记，也就是使用不同的iTRAQ标签来标记不同的肽段样本；SCX预分级，使用强阳离子交换SCX（HPLC）将肽段分为多个组分；使用LC-MS对每个组分进行质谱检测。iTRAQ的实验流程iTRAQ定量蛋白组数据分析流程8代谢组测序代谢组是指一个细胞、组织或器官中所有代谢物的集合，包含一系列不同化学型的分子，比如肽、碳水化合物、脂类、核酸以及异源物质的催化产物等。Ametabolomeisacollectionofallmetabolitesinacell,tissueororgan,consistingofarangeofmoleculesofdifferentchemicalty