GBT 21037-2024 饲料中二甲氧苄氨嘧啶、三甲氧苄氨嘧啶和二甲氧甲基苄氨嘧啶的测定标准立项发展报告

饲料中二甲氧苄氨嘧啶、三甲氧苄氨嘧啶和二甲氧甲基苄氨嘧啶的测定标准立项发展报告StandardizationDevelopmentReport:DeterminationofDiaveridine,TrimethoprimandOrmetopriminFeeds(GB/T21037-2024)摘要饲料安全是食品安全的重要源头保障，兽药残留监控是饲料质量安全监管的核心环节。二甲氧苄氨嘧啶、三甲氧苄氨嘧啶和二甲氧甲基苄氨嘧啶作为磺胺类药物的增效剂，在畜禽养殖中应用广泛，其不合理使用导致的残留问题直接威胁动物源性食品安全和公共卫生安全。现行GB/T21037-2007《饲料中二甲氧苄氨嘧啶、三甲氧苄氨嘧啶和二甲氧甲基苄氨嘧啶的测定》自发布实施以来已逾十五载，在检测灵敏度、前处理技术及多残留同步分析能力等方面已难以满足当前饲料质量安全监管的实际需求。为此，全国饲料工业标准化技术委员会组织中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所等单位，依托国家标准化管理委员会标准修订计划，开展了本标准的修订研制工作。新修订的GB/T21037-2024在充分继承原标准技术框架和适用性的基础上，引入了高效液相色谱-串联质谱法，实现了三种目标物在饲料基质中的高灵敏同步测定；系统优化了样品前处理流程，显著提高了方法回收率和精密度；全面扩展了方法的适用饲料基质范围，涵盖配合饲料、浓缩饲料、精料补充料及添加剂预混合饲料等主要饲料产品类型，并明确了方法定量限和检测限等关键性能参数。修订后的标准技术指标达到国际同类标准先进水平，可有效支撑《饲料质量安全管理规范》及农业农村部有关饲料中药物添加剂的监管要求，对促进饲料行业健康发展、保障动物源性食品安全具有重要意义。关键词：饲料安全；二甲氧苄氨嘧啶；三甲氧苄氨嘧啶；二甲氧甲基苄氨嘧啶；高效液相色谱-串联质谱；兽药残留；标准修订Keywords:FeedSafety;Diaveridine;Trimethoprim;Ormetoprim;HPLC-MS/MS;VeterinaryDrugResidue;StandardRevision一、引言1.1标准修订背景饲料是畜牧养殖业生产的物质基础，饲料质量安全直接关系动物源性食品的安全和人类健康。近年来，随着我国畜牧养殖业持续快速发展，饲料工业规模不断扩大，2023年全国饲料产量已突破3.2亿吨，稳居全球第一。与此同时，饲料中药物添加剂的使用管理日益受到社会关注，农业农村部先后出台《饲料药物添加剂使用规范》《饲料质量安全管理规范》等一系列法规文件，对饲料中药物添加剂的种类、用量及休药期作出了明确规定。二甲氧苄氨嘧啶（Diaveridine,DVD）、三甲氧苄氨嘧啶（Trimethoprim,TMP）和二甲氧甲基苄氨嘧啶（Ormetoprim,OMP）属于2,4-二氨基嘧啶类抗菌增效剂，通过选择性抑制细菌二氢叶酸还原酶，与磺胺类药物联用可产生协同抗菌作用，广泛用于畜禽消化道和呼吸道感染性疾病的预防和治疗。其中，二甲氧苄氨嘧啶常与磺胺对甲氧嘧啶配伍用于鸡、兔等畜禽的球虫病防治；三甲氧苄氨嘧啶是应用最广泛的磺胺增效剂，与磺胺甲噁唑、磺胺嘧啶等组成复方制剂；二甲氧甲基苄氨嘧啶则与磺胺二甲氧嘧啶联用，在禽类养殖中应用较多。然而，这类药物若使用不当或未遵守休药期规定，则可能残留在动物源性食品中，通过食物链对人体健康造成潜在危害，如引起过敏反应、诱导细菌耐药性等。因此，建立准确、灵敏的饲料中该类药物的检测方法标准，是实施有效监管的重要技术支撑。1.2原标准实施情况分析GB/T21037-2007《饲料中二甲氧苄氨嘧啶、三甲氧苄氨嘧啶和二甲氧甲基苄氨嘧啶的测定》自2007年发布、2008年实施以来，为饲料中磺胺增效剂的监督检测和饲料产品质量控制发挥了重要作用。原标准采用高效液相色谱法（HPLC-UV），以甲醇-乙酸铵缓冲液为流动相，经C18色谱柱分离后在240nm波长处检测。该技术在当时的检测条件下具有较好的准确性和重现性，标准实施后被各级饲料监测机构和饲料生产企业广泛采用。然而，经过十余年的实施应用和技术发展，原标准逐渐暴露出以下局限：其一，高效液相色谱-紫外检测法灵敏度相对较低，定量限一般在50μg/kg以上，难以满足日益严格的饲料中药物限量要求；其二，紫外检测法易受饲料复杂基质中色素、脂质等成分的干扰，对某些基质复杂的样品易产生假阳性或定量偏差；其三，原方法仅能实现单个样品的逐一测定，难以满足当前大批量样品快速筛查和多残留同步分析的需求；其四，随着液相色谱-质谱联用技术的普及，国内外相关标准已逐步向质谱法方向发展，急需通过修订实现技术升级。1.3标准修订的必要性从监管需求看，农业农村部第246号公告和新版《饲料添加剂品种目录》对饲料中药物添加剂的使用管理提出了更为严格的要求，亟需配套检测方法的同步升级。从技术发展看，高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）技术凭借其高灵敏度、高选择性和强抗干扰能力，已发展成为兽药残留检测的主流方法，在饲料检测领域的应用日趋成熟。从标准体系建设看，GB/T21037-2007的技术内容已明显滞后于同期国际标准（如欧盟委员会决议2002/657/EC规定的方法性能要求）和国内相关行业标准的技术水平。因此，对该标准进行全面修订，既是适应饲料质量安全监管新形势的客观需要，也是推进我国饲料检测标准体系与国际接轨的重要举措。二、标准修订工作概况2.1修订工作组织与过程本标准修订工作由国家标准化管理委员会下达标准修订计划（计划编号：20231076-T-469），由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC76）归口管理。中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所作为主要起草单位，联合中国兽医药品监察所、中国饲料工业协会、中国农业科学院饲料研究所、中国农业大学等科研院所和高校组成标准修订工作组，共同承担标准的修订研制任务。修订工作自2023年初正式启动，主要经历了以下几个工作阶段：前期调研与论证阶段（2023年1月-2023年3月），系统收集国内外相关标准和技术文献，梳理原标准实施中存在的问题和各方反馈意见，确立修订技术路线。方法研究与验证阶段（2023年4月-2023年10月），开展高效液相色谱-串联质谱方法的系统研究，完成色谱条件优化、质谱参数调谐、前处理方案筛选等工作，并通过三个实验室间的协同验证实验，对方法的重复性、再现性、回收率等关键指标进行确认。标准文本编制与征求意见阶段（2023年11月-2024年1月），完成标准征求意见稿的编写，面向全国饲料监测机构、生产企业及相关科研单位广泛征求意见，对反馈意见逐条研究处理并完善标准内容。标准审查与报批阶段（2024年2月-2024年3月），通过全国饲料工业标准化技术委员会组织的专家审查，根据审查意见进一步修改完善后形成报批稿，报国家标准化管理委员会审批发布。2.2主要起草单位简介本标准的主要起草单位——中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所（以下简称“质标所”），是国家级农产品质量安全专业科研机构，加挂“农业农村部农产品质量标准研究中心”和“农业农村部农产品质量安全检测与评价重点实验室”的牌子，长期致力于农产品和农业投入品质量安全检测技术研究、标准制修订及风险评估工作。质标所在饲料质量安全检测领域具有深厚的技术积累和丰硕的研究成果。近年来，该所先后主持和参与制修订国家和行业标准百余项，建立了覆盖饲料中违禁添加物、药物残留、生物毒素、重金属及微生物等多类危害因子的检测技术体系。在兽药残留检测方面，质标所建有完善的高分辨质谱、液相色谱-串联质谱、气相色谱-串联质谱等大型精密仪器平台，在饲料中磺胺类、喹诺酮类、四环素类等药物多残留同步检测技术的研发和国际比对研究方面积累了丰富经验。研究所拥有一支以研究员、副研究员为骨干，具有博士、硕士学位的专业技术团队，先后承担了多项国家重点研发计划、国家自然科学基金等项目，在分析测试领域国内外核心期刊发表学术论文200余篇，为我国饲料质量安全监管提供了强有力的技术支撑。在本标准修订过程中，该所充分发挥其技术研发和标准化工作优势，负责方法学研究和实验验证等核心工作，为标准的科学性和先进性提供了坚实保障。三、标准主要技术内容3.1适用范围本标准规定了饲料中二甲氧苄氨嘧啶、三甲氧苄氨嘧啶和二甲氧甲基苄氨嘧啶测定的高效液相色谱-串联质谱方法。标准适用于配合饲料、浓缩饲料、精料补充料和添加剂预混合饲料中二甲氧苄氨嘧啶、三甲氧苄氨嘧啶和二甲氧甲基苄氨嘧啶的测定。该适用范围的设定兼顾了不同饲料类型的基质特点和检测需求，其中配合饲料和浓缩饲料基质较为复杂，蛋白质、脂肪和碳水化合物含量高，对前处理和检测方法的抗干扰能力要求较高；精料补充料和添加剂预混合饲料中药物含量相对较高，重点关注方法的线性范围和定量准确性。3.2方法原理本标准方法的核心原理为：试样中的二甲氧苄氨嘧啶、三甲氧苄氨嘧啶和二甲氧甲基苄氨嘧啶经酸性提取液提取，经固相萃取柱净化富集后，以高效液相色谱-串联质谱仪测定。目标分析物经C18反相色谱柱梯度洗脱分离，在电喷雾正离子（ESI⁺）多反应监测（MRM）模式下进行定性确认和定量分析，采用内标法定量。在色谱分离方面，通过优化流动相组成和梯度洗脱程序，实现了三种目标物与饲料基质中共提取物的有效分离。质谱检测方面，每种目标物选取两对特征离子对作为定性依据，选取灵敏度最高、干扰最小的一对离子对用于定量分析，有效地消除了基质干扰，确保了定性结果的可靠性。3.3关键技术指标新修订标准确立了以下主要技术指标：检出限和定量限：方法的检出限（LOD）为5μg/kg，定量限（LOQ）为10μg/kg，较原标准（定量限50μg/kg）灵敏度提高了5倍，可满足饲料中该类药物的痕量残留监控需求。线性范围：三种目标物在5-500μg/L范围内线性关系良好，相关系数（r）不低于0.995，满足不同浓度样品的定量检测需要。3.4样品前处理样品前处理是饲料中药物残留分析的关键环节。由于饲料基质成分复杂，含有大量蛋白质、脂肪、维生素、矿物质以及植物纤维等物质，若净化不充分，不仅会影响色谱分离效果和质谱离子化效率，还可能造成基质效应，影响定量准确性。本标准的修订对前处理流程进行了系统优化，主要改进包括：提取方面，比较了不同提取溶剂（甲醇、乙腈、乙酸乙酯、酸性甲醇等）和提取方式（振荡提取、超声提取、均质提取）的提取效率，确定以酸性甲醇-乙腈混合溶液作为提取溶剂，兼顾了三种目标物的提取回收率和基质共提取物的最小化。纯化方面，对比了HLB、MCX、WCX等不同固相萃取柱的净化效果，选择具有混合阳离子交换-反相保留机制的固相萃取柱，实现了目标物的有效富集和基质干扰物的深度净化，同时引入内标物（如甲氧苄氨嘧啶-D₃），有效校正了前处理过程中的回收率波动和基质效应影响。3.5检测方法标准采用高效液相色谱-串联质谱法，其中液相色谱条件为：色谱柱选用C18反相柱（柱长100-150mm，内径2.1mm，粒径1.7-3.5μm），流动相为0.1%甲酸水溶液-甲醇体系，采用梯度洗脱模式，流速0.2-0.3mL/min，柱温35-40℃。质谱条件为：电喷雾离子源正离子模式，毛细管电压3.0-3.5kV，离子源温度120-150℃，脱溶剂气温度350-450℃，采用多反应监测扫描模式。通过与高效液相色谱法的比对研究和实际样品验证，高效液相色谱-串联质谱法在灵敏度、选择性和抗干扰能力方面均显著优于原标准的紫外检测法，能够有效解决饲料基质复杂带来的假阳性和定量不准的问题，检测效率和结果可靠性大幅提升。四、标准主要修订内容及技术依据4.1检测方法的技术升级本标准最核心的修订内容是将原标准的检测方法由高效液相色谱法升级为高效液相色谱-串联质谱法，这是饲料中兽药残留检测技术发展的必然趋势。高效液相色谱-串联质谱技术具有以下显著优势：一是灵敏度高，质谱检测器的响应值远高于紫外检测器，可实现更低浓度的准确定量；二是选择性好，多反应监测模式基于母离子-子离子的特征跃迁进行检测，可有效排除基质干扰，降低假阳性风险；三是可实现多残留同步分析，在同一色谱条件下同时完成三种目标物的测定，显著提高检测效率；四是符合国际兽药残留检测标准的通用技术要求。农业农村部于2019年发布的国家标准《饲料中兽药残留检测方法》也逐步向质谱法方向推进，因此本次修订具有重要的技术引领意义。4.2适用基质的扩展原标准方法验证范围主要涵盖配合饲料和浓缩饲料，本次修订将适用范围扩展至精料补充料和添加剂预混合饲料。精料补充料是反刍动物重要的补充饲料，添加剂预混合饲料则是饲料工业的重要组成部分。不同基质的物理化学性质差异较大，预混合饲料中药物浓度较高且载体成分复杂，对前处理和检测方法的适应性提出了更高要求。修订工作组通过系统的方法学验证，确认了扩展后各基质类型的适用性，为全面监管各类饲料产品中该类药物的使用情况提供了技术依据。4.3方法性能指标的整体提升本次修订按照GB/T27404-2008《实验室质量控制规范食品理化检测》和GB/T32465-2015《化学分析方法验证确认和内部质量控制要求》的技术要求，对方法的选择性、线性范围、检出限、定量限、回收率、精密度、基质效应等性能指标进行了全面验证。修订后的方法定量限达10μg/kg，较原标准提高了5倍。在三个协同验证实验室的比对实验中，各实验室间结果一致性好，方法的重现性满足要求，定量结果准确可靠，满足饲料中该类药物的监控要求。五、标准实施的意义5.1对饲料质量安全监管的技术支撑作用GB/T21037-2024的发布实施，为各级饲料质量安全监测机构提供了一套更加科学、先进、统一的检测技术依据。标准的实施将有力支撑农业农村部饲料质量安全风险监测计划和“瘦肉精”等违禁添加物专项整治行动，提高饲料中磺胺增效剂残留监控的覆盖面和检出能力。特别是在当前饲料质量安全监管日趋严格的大背景下，该标准的实施有助于及时发现和查处饲料中违规添加或超量添加药物的行为，防范动物源性食品安全风险。5.2对饲料行业健康发展的推动作用标准的修订升级有利于引导饲料生产企业加强产品质量控制。企业采用更先进的检测方法进行出厂检验，能够更好地控制产品中药物的合规添加和均一性，避免因药物含量超标导致的动物中毒或产品召回事件，维护企业品牌形象和市场竞争力。同时，统一先进的检测标准有助于营造公平有序的市场竞争环境，促进饲料行业技术水平的整体提升和优胜劣汰。5.3对动物源性食品安全和公共