羊膜间充质干细胞的分离制备标准操作规程

Q/CRHIAXXXXX—XXXXICSFORMTEXT11.100FORMTEXTC04FORMTEXT     T/FORMTEXTCRHIAFORMTEXTXXXXX—FORMTEXTXXXXFORMTEXT     羊膜间充质干细胞的分离制备标准操作规程StandardOperatingProcedureforIsolationandPreparationofAmnioticMesenchymalStemCellsFORMTEXT点击此处添加与国际标准一致性程度的标识（工作组讨论稿）XXXX-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施中国生殖健康产业协会   发布目次TOC\o"1-2"\h\z\u目次 II前言 III引言 IV羊膜间充质干细胞的分离制备标准操作规程 11范围 12规范性引用文件 13术语和定义 14缩略语 25责任 26器材和试剂 37技术要求 48操作方法 4附录A(资料性附录)围产组织捐献知情同意书 8附录B(资料性附录)供者健康信息采集表 9附录C(资料性附录)间充质干细胞质量检测表 10参考文献 11前  言本标准按照GB/T1.1-2020给出的规则起草。本标准由中国生殖健康产业协会归口。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准起草单位：国家卫生健康委科学技术研究所、国家人类遗传资源中心、军事医学研究院、清华大学玉泉医院本标准主要起草人：陈昱圻、周越、郭昌龙、袁国红、张毅、徐静、王译晗、范雨萱、方明霞、董艺超、成子安、王蕴文、高建恩、王媛媛。引  言羊膜间充质干细胞具有多向分化潜能，并且免疫原性低，移植不会发生免疫排斥反应，已经被广泛应用于科学研究和临床研究试验，对退行性疾病、免疫失调疾病等取得了较好的临床治疗效果，具有较为广阔的临床应用前景。本标准旨在通过对羊膜间充质干细胞分离制备的操作过程进行规范，使羊膜间充质干细胞的分离制备及存储操作规范化，从而保障间充质干细胞的质量的可靠性与稳定性。在制订过程中，通过参考国内外间充质干细胞的相关文献、规范性和指导性文件，制定本标准操作规程。范围本标准给出了羊膜间充质干细胞分离制备的标准操作规程。本标准仅适用于羊膜间充质干细胞分离制备的实验人员，以保证羊膜间充质干细胞的质量。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T1.1-2009标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写GB2894-2008安全标志及其使用导则GB/T5458-2012液氮生物容器GB/T12905-2000条码术语GB13690-2009化学品分类和危险性公示通则GB15258化学品安全标签编写规定GB/T20269-2006信息安全技术信息系统安全管理要求GB/T22278-2008良好实验室规范原则GB/T27025-2008检测和校准实验室能力的通用要求AQ3013-2008危险化学品从业单位安全标准化通用规范CNAS-CL05-2009实验室生物安全认可准则WHOThirdEdition实验室生物安全手册《中华人民共和国药典》2015版，第三部《全国临床检验操作规程》，第四版《医疗器械冷链(运输、贮藏)管理指南》术语和定义下列术语和定义适用于本文件。

羊膜间充质干细胞humanAmnioticMesenchymalStemCells来源于胎盘的羊膜组织的间质层，是具有明显可塑性和多向分化潜能的一种成体干细胞，可分化为多种间质组织，如骨骼、软骨、脂肪细胞等。

分离制备SeparationandPreparation从组织、血液及相关生物标本中将特定细胞分离出来，进行体外培养的过程。

形态Morphology表现细胞生命现象的的显微及亚显微结构。

细胞传代CellPassage原代细胞培养成功后，将细胞分割成小部分，重新接种新的培养瓶中，继续培养的过程。

扩增Expansion将细胞在无菌条件下培养，其数量增加的过程。

细胞计数Cytometry当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞数目，即可换算出每毫升细胞悬液中的细胞数目。

细胞冻存CellCryopreservation细胞培养成功后，使用专用的冻存液对细胞进行-80℃或者液氮冷冻储存。

细胞复苏CellRecovery将冻存细胞解冻之后重新培养，细胞恢复生长的过程。缩略语本标准中缩略语见表1。表1缩略语缩写英文全称名称AMSCAmnioticMesenchymalstemcells羊膜间充质干细胞FBSFetalbovineserum胎牛血清PBSPhosphatebuffersalinesolution磷酸盐缓冲溶液HBSSHank’sbalancedsaltsolution平衡盐溶液PAUmbilicalcordamnion脐带羊膜NEAANon-EssentialAminoAcid非必须氨基酸EGFEpideralgrowthfactor表皮生长因子DMSODimethylsulfoxide二甲基亚砜责任负责羊膜间充质干细胞分离制备的实验人员应明确该项目操作的目的、方法及注意事项。器材和试剂器材羊膜间充质干细胞分离制备所需仪器。生物安全柜。细胞培养箱。倒置显微镜。程序降温仪。恒温水浴锅。低速离心机。试剂羊膜间充质干细胞分离制备所需试剂见表2。表2羊膜间充质干细胞分离制备所需试剂实验类别试剂组织分离、消化Nacl、HBSS、CollagenaseIV细胞培养α-MEM、FBS、NEAA、双抗、EGF、Glutamin、胰酶、苔盼蓝染液、DMSO试剂配制羊膜消化液CollagenaseIV的配制用托盘天平称取1g粉末放入50ml离心管中。加入10mlPBS，用移液枪吹打混匀。用0.22um针孔过滤器过滤除菌，1ml一支分装到1.5ml离心管中，-20℃保存（此试剂浓度为10mg/ml（12.50u/ml），可视为10x储液）。EGF的配制用天平称取2mgEGF放入50ml离心管中。加入20mlα-MEM培养基，轻轻地上下颠倒离心管混匀，1ml一支分装在1.5ml离心管中，放入-20℃储存。MSC完全培养基配制10%FBS+1%双抗+1%谷氨酰胺+1%非必需氨基酸+10ng/mlEGF+α-MEMMSC冻存液配制10%DMSO+MSC完全培养基DNaseI的配制用托盘天平称取100mg粉末放入50ml离心管中。加入10mlPBS吹打混匀。用0.22um真空过滤器过滤除菌，1ml一支分装到1.5mlEP管中，放入-20℃冰箱保存，此试剂浓度为10mg/ml（对于DN25，活性为4000u/ml）技术要求规范操作要求羊膜间充质干细胞分离制备过程应保证生物安全柜主操作区内只有一份羊膜及其对应耗材，执行核对制度，保证羊膜和耗材的一一对应和准确性。操作开始前两人对需操作羊膜进行复核，确认羊膜信息准确无误。整个复核环节需由2人以上共同参与，其中1名为核对人员，其余为制备人员。确保在羊膜采集后24h内将羊膜间充质干细胞完成制备。实验室各设备在使用前需认真阅读设备说明书，规范操作，使用后需填写设备记录本。实验所需试剂在使用前需认真阅读产品说明书，注意易燃、有毒有害试剂的规范操作，使用前后需做试剂出入库登记。操作方法样本采集从妇产医院取回胎盘样品，用不锈钢保温桶盛装，加入脐带运输液保持表面湿润。制备人员用组织镊将胎盘取出，放入搪瓷托盘中，用HBSS洗净表面血液残留物。分离羊膜从保温桶取出胎盘，有脐带的一面为子面，无脐带且颜色较深面为母面。将母面朝下放入高压好的搪瓷托盘中。剪下脐带，放入一新的50ml离心管中，加入等体积的Nacl溶液，标好C和分离日期，放入4摄氏度冰箱以备其他实验使用。脐带连接着的一层白色组织为羊膜层，沿脐带切口，用手术刀在羊膜上划出十字口，期间不断用HBSS冲洗胎盘表面以保持湿润。沿十字口，用组织镊钝性分离羊膜，放入一新的玻璃烧杯，放入等体积的Nacl溶液，标好PA和分离日期。将所分离的羊膜组织用组织剪尽量剪到最碎，然后将剪碎的组织10ml一个单位放入50ml离心管中，标好名称，加入已配好的组织所需的消化酶，酶与组织比为1：1。将离心管放入水平摇床，37℃，250rpm，直至组织块消化完全。羊膜MSC的制备将消化好的组织用100目滤网过滤，滤液以1000g，10min离心弃上清，沉淀第一次用已配好的MSC培养基洗涤，即1000g，离心10min，离心后弃上清，向沉淀中加入含双抗的HBSS洗涤一次即1000g，10min离心，离心后弃上清。向沉淀加入配好的MSC完全培养基重悬细胞，计数后以1*106密度将细胞铺在T75的培养瓶中并向培养瓶中加入已配好的MSC培养。MSC细胞形态学鉴定组织块铺板培养7天后，镜下观察可见少许细胞从组织周围爬出，拍照记录。10天后更多细胞爬出，呈放射性排列在组织块的周围，也可见部分细胞克隆样生长，拍照记录。14天后，部分细胞成90%汇合，纯化培养第3代后细胞形态均一，呈短梭形排列，可初步认定为MSC细胞。MSC的换液和传代组织铺板细胞的换液铺板后24h内不要摇动细胞培养皿，防止组织块脱落。培养48h后，取出培养皿，用移液枪小心吸走组织块空隙中的培养基。将10mlMSC完全培养基以淋浇的方式均匀撒在组织块表面（注：培养基使用前需使用恒温水浴锅预热）。每两天换液一次，每次10ml。待镜下观察有贴壁细胞长出，且融合度达70%-80%时，即进行传代操作。消化细胞的换液铺板后24h内不要摇动细胞培养瓶。培养48h后，将培养瓶内液体快速倒掉，并用喷过75%乙醇的棉球擦拭瓶口，防止液体回流污染细胞。沿培养瓶壁缓缓加入20ml新鲜MSC完全培养基，将细胞放回培养箱继续培养（注：培养基使用前需预热，加培养基时要倾斜瓶身，沿着瓶身侧部缓慢加入，不可直接加到细胞上导致贴壁细胞被冲起。）每两天换液20ml，直到细胞融合度达80%-90%，即可进行细胞传代操作。间充质干细胞的传代待细胞融合度达80%-90%时，吸出原培养基，沿瓶壁缓慢加入2mlPBS，轻轻摇动瓶身吸出PBS，清洗细胞表面残留培养基，重复此步骤1次；加入2mlPBS和500ul胰酶，放入37℃培养箱孵育2min，镜下观察细胞形态成正圆形，可视为消化完全，轻敲瓶身，打散细胞团；加入1mlMSC完全培养基终止消化；用电动移液枪吹掉粘附在瓶底的细胞，将液体吸出放入15ml离心管；加入2mlPBS，用电动移液枪冲洗瓶底，吸出PBS加到之前15ml离心管中，重复此步骤，直到镜下观察瓶底无残留细胞；将细胞混合液放入离心机，配平后以800g，离心5min，弃上清，加入1ml培养基重悬细胞；取100ul细胞计数后，以1*106密度重新铺入新的T75的培养瓶中，剩余细胞以一支1*106密度冻存。间充质干细胞的计数将需要计数的间充质干细胞从培养皿/瓶上消化下来，将细胞悬液以800g离心5min，弃上清；用10mlPBS充分重悬细胞沉淀，取100ul细胞悬液到一新的1.5ml离心管中；取1ml苔盼蓝染液到该1.5mlEP管中，加入9mlPBS，轻轻地上下颠倒离心管将其混匀，此时苔盼蓝浓度可视为0.04%，在管身标好苔盼蓝工作液和配制日期；吸取10ul苔盼蓝工作液加到装有100ul细胞液的1.5ml离心管中，用食指轻弹管底后，用移液枪吹打混匀；将细胞计数板和盖玻片擦拭干净，并将盖玻片盖在计数板上；吸出10ul加有苔盼蓝的细胞悬液，滴加在盖片边缘，缓慢推动加样枪，使悬液充满盖片和计数板之间且无气泡出现；镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只记左侧和上方的，然后按以下公式计算：4格细胞总数/4*104*稀释倍数*细胞总体积。间充质干细胞活率检验胰酶消化前，细胞生长迅速，镜下观察细胞形态为梭形且牢固贴壁，培养基澄澈无过多杂质悬浮，可初步认定细胞存活率较高；当细胞出现严重脱落或者生长缓慢，细胞边缘颜色加深，培养基中有大量杂质析出时，细胞此时的存活率可能较低，需要进一步的染色确认其细胞活率。镜下观察血球计数板上的苔盼蓝染液染色的细胞，无色为活细胞，深蓝色为死细胞，分别记下细胞个数，运用步骤7.7.7中公式就算出活/死细胞率。细胞冻存步骤待细胞长满后，吸出原培养基，沿瓶壁缓慢加入2mlPBS，轻轻摇动瓶身，吸出PBS，清洗细胞表面残留培养基，重复此步骤1次；加入1ml配好的MSC培养基终止消化；用电动移液枪吹掉粘附在瓶底的细胞，将液体吸出放入15ml离心管；将细胞混合液以800g，3min离心，弃上清，向细胞沉淀中加入10mlPBS重悬细胞；取100ul细胞计数（具体计数步骤详见《间充质干细胞细胞计数标准操作规程》，将细胞以800g，离心5min，弃上清；将细胞以一支1*106cell/ml的密度用配好的MSC冻存液重悬细胞，将细胞充分混匀后冻存；冻存细胞标签制定规则：标签内容应包括：细胞名称、供者编码、采集信息、细胞数量、冻存日期等；建议标签格式如下：XX-XX-XX-XXX-XX-XXX-XXXXXX；细胞冻存标签由20位代码组成，含义如下：第1-2位代码为细胞种类，如NK、MSC（MC）；第3-4位：用以表示样品的组织来源（如：脐带血（UB）、外周血（PB）等）；第5-6位：样品采集来源信息（医院编号）；第7-9位：样品信息（产妇样本编号）；第10-11位：细胞培养天数；第12-14位：同一批次冻存的细胞顺序编号；第15-20位：细胞冻存日期。注：若使用合金冻存盒，可待冻存盒降至室温，将细胞放入冻存盒中，放入-80℃保存一夜，第二天放入液氮；若使用程序降温仪进行冻存详见《程序降温仪标准操作技术规程》。细胞复苏步骤打开水浴锅开关，将温度调至37℃；待温度处于37℃时，从液氮罐中取出需复苏的MSC，将细胞迅速放置水浴锅中解冻；待冻存管内培养基全部融化后，从水浴中取出冻存管，放入离心机，配平后以1000g，离心5min；弃上清，向冻存管中加入1mlPBS，重悬细胞沉淀，并将细胞悬液转移到15ml离心管中，并向离心管中加入PBS至终体积为10ml；将离心管放入离心机，配平后以800g，离心5分钟，弃上清；向沉淀加入10ml已配好的MSC培养基重悬细胞沉淀；将细胞悬液到T75细胞培养瓶中，向培养瓶中加入10ml已配好的MSC细胞培养基，此时细胞液终体积为20ml；水平轻摇瓶身，将细胞混匀后放至37℃，5%CO2培养箱中培养。

附录A

(资料性附录)

围产组织捐献知情同意书首席研究员：__________________受试者医生：__________________请注意：知情同意书中含有帮助您决定是否参加此科研项目受试的重要信息。请您详细阅读下列知情信息，如有不明白的部分，请要求医生或者相关科研人员给予解释。项目有关声明：本项目是以当今全世界范围内广泛开展的生物实验技术为基础的医学科研项目。本实验将不涉及伦理或者安全问题。我们邀请您作为志愿受试者，请您在详细阅读下列知情信息后决定是否参与我们的研究，如有疑问，医生将为您作详细解释。研究目的：本科研项目是针对目前医学界尚未解决的部分疾病的基础研究。通过采集相应受试者的胎盘羊膜组织志愿受试者捐出的这些组织细胞将在一定的培养条件下，成为间充质干细胞，用来进一步研究志愿受试者或其家人所患有的疾病治病机理。研究中志愿受试者捐献组织的所有权：志愿受试者捐出的胎盘羊膜组织在培养，培养出的间充质干细胞的所有权归所有，并有可能作为科研材料通过合作或商用形式推广至整个学术界。志愿受试者参与本研究可能带来的益处：本项研究对受试者本人在短期内不会带来益处，但通过对其捐出组织的研究将为更好的探索疾病机理及相应治疗药物的研发提供基础，可以找出针对相关疾病的新的诊疗方法与预防方法，为将来更好的治疗目前医学界尚未解决的部分疾病提供可能。志愿受试者参加本研究可能的风险：本研究是收集医疗废弃物中的胎盘羊膜组织，不会给志愿受试者带来其他的不适。志愿受试者参加本研究可能出现的紧急情况说明：正常情况下，不会出现紧急情况。研究的保密性：将承诺对志愿者的个人信息进行严格保密，不会向与该科研无关的人或单位透露涉及任何受试者的个人信息。参与研究的自愿性原则：志愿受试者拥有自由选择参加和退出的权利，这个选择不会对正常的诊治产生影响，更不会带来损失。同意部分：我已认真阅读该知情同意书，关于此项研究医生已向我做了详尽说明并解答了我的相关问题，我已充分知晓以上内容，同意参加研究。(以下为签字部分)志愿受试者姓名(正楷)：_____________签名：___________________日期：________________我或我的研究人员已向该志愿受试者充分解释和说明了本临床试验的目的、操作过程以及志愿受试者参加该试验可能存在的风险和潜在的利益，并满意地回答了受试者的所有有关问题。研究者指定的研究人员(对志愿受试者进行告知者)姓姓名(正楷)：_____________签名：___________________日期：________________

附录B

(资料性附录)供者健康信息采集表采集样本信息编码参与者信息姓名年龄/出生日期国家民族过往疾病（）有（）无身份证号码联系电话联系地址联系邮箱法定监护人信息姓名年龄/出生日期国家民族过往疾病（）有（）无身份证号码联系电话联系地址联系邮箱化验结果血型（）A（）B（）O（）ABRH（