CN119390787A 用于aav衣壳的使用转录依赖性定向进化的方法 （俄勒冈健康与科学大学）

202080026983.X2020.01.31用于AAV衣壳的使用转录依赖性定向进化的本发明公开了进行转录依赖性定向进化(TRADE)的方法和使用此类方法选择的新型AAV衣壳。本发明还提供了新型AAV衣壳突变体。TRADE技术被用于鉴定在静脉施用后介导脑中的导致鉴定出在施用新型AAV衣壳后在脑中可以比AAV9更有效、更特异性地转导神经元的新型AAV衣壳。TRADE技术可用于鉴定靶向各种细胞群的21.腺相关病毒血清型9(AAV9)衣壳蛋白，其包含肽插入，其中所述肽插入包含SEQIDNO:128的氨基酸序列。2.腺相关病毒血清型9(AAV9)衣壳蛋白，其包含肽插入，其3.编码包含肽插入的腺相关病毒血清型9(AAV9)衣壳蛋白的核酸分子，其中所述肽插入包含SEQIDNO:128的氨基酸序列。4.编码包含肽插入的腺相关病毒血清型9(AAV9)衣壳蛋白的核酸分子，其中所述肽插入在表3中列出的肽插入位点SEQIDNO中的5.腺相关病毒血清型9(AAV9)衣壳蛋白，其与变体AAV9衣壳蛋白具有99％或更高的序6.腺相关病毒血清型9(AAV9)衣壳蛋白，其与变体AAV9衣壳蛋白具有99％或更高的序7.包含反义方向的腺相关病毒(AAV)cap基因序列的核酸分子，其中所述反义方向的AAVcap基因序列包含信使核糖核酸(mRNA)剪接义方向的AAVcap基因序列包含信使核糖核酸(mRN(a)用包含核酸分子的AAV载体转导细胞，其中所述核酸分子包含反义方向的所述AAV所述核酸分子包含反义方向的AAVcap基因序列，所述AAV病毒颗粒包含由AAVcap基因序列编3AAV衣壳的使用转录依赖性定向进化的方法”的中国专利人类和非人灵长类动物组织中分离出许多天然存在的新血清型和亚型，因此AAV载体的用途得到了扩展。Gao等人,JVirol78,6381_6388(2004)和Gao等人,ProcNatlAcadSciUSA99,11854_11859(2002)。在新鉴定的AAV分离株中，AAV血清型8(AAV8)和AAV血清型9(AAV9)受到关注，因为源自于这两种血清型的AAV载体可以在全身施用后以高效率转导多Circulation112,2650_2659(2005)；Wang等人,NatBiotechnol23,321_328(2005)；Nakai等人,JVirol79,214_224(2005)；和Foust等人,NatureBiotechnol23,321_328细胞摄取和/或细胞中病毒粒子壳的快速脱壳。Thomas等人,JVirol78,3110_3122[0004]使用AAV介导的基因治疗的概念验证已在许多人类疾病的临床前动物模型中得到证实。I/II期临床研究显示了针对治疗血友病B(Nathwani等人,NEnglJMed71,1994_2004(2014))、脂蛋白脂肪酶缺乏症(Carpentier等人,JClinEndocrinolMetab97，1635_1644(2012))、莱伯氏先天性黑蒙症(Jacobson等人,ArchOphthalmol130,9_24(2012)以及Pierce和Bennett,ColdSpringHarbPerspectMed5,a017285(2015))和其他(Mingozzi和High,NatRevGenet12,341_355(2011)以及Wang等人,NatRevDrugDiscov18,358_378(2019)中综述的)的有希望的[0005]尽管有这种希望，但人体研究也揭示了AAV介导的基因治疗中的意外问题和潜在Ther28,1075_1086,(2017)；和Ogden等人,Science366,1139_1143,(2019))，对于临床体内AAV文库选择策略的发展产生了能够高效转导先前难驾驭的细胞类型的多种设计的4AAV变体(Kotterman和Schaffer,NatRevGenet15,445_451(2014)以及Grimm等人,Mol理论上讲，这种策略会导致回收有效的AAV变体以及介导载体介导的转基因表达所需的一等人,JVirol82,5887_5911(2008)；Lisowski等人,Nature506,382_386(2014)；和里程碑意义的研究表明通过使用Cre_依赖性选择策略(第二代)可以极大地改进这个过程。Deverman等人,NatBiotechnol34,204_209(2016)。Cre_依赖性文库选择利用Cre重组酶该序列的倒置允许方向选择性PCR特异性扩增由AAV变体递送至细胞的病毒DNA，这些病毒于以细胞类型特异性方式选择性表达Cre重组酶，从而允许选择有效转导的新型AAV变体。身施用后，其转导能力是亲代AAV9的40倍。Deverman等人,NatBiotechnol34,204_209同，Cre依赖性选择在临床相关的大型动物(包括非人灵长类动物)中是难以驾驭的，因为细胞类型特异性或遍在mRNA表达水平上对AAV衣壳转导进行选择。本文描述的方法提供了5系统不需要Cre转基因动物；因此，它可以应用于源自于任何动物物种的动物和培养的细毒基因组从单链DNA到双链DNA的转换水平上应用细胞类型特异性选择，与CREATE系统不胶质细胞特异性、少突胶质细胞特异性和小胶质细胞特异性)整合到一个AAV衣壳文库中，性或组织/器官特异性增强子/启动子或遍在增强子/启动子都可以很容易地用于AAV衣壳脉施用后可以比AAV9更有效和更特异性地转导小鼠和非人灵长类动物脑中的神经元的新可能是神经元起源的一个或多个未定义的细前从未报道过的新发现。这种剪接有可能阻碍AAVcapORF全长反义mRNA的有效回收，当[0012]本文描述的TRADE系统使用反义mRNA来回收衣壳序列信息，使用有义链mRNA的[0013]图1用于AAV衣壳定向进化的体内文库选择策略概述。AAV载体介导的转导是一个回收有效的AAV变体，以及介导载体介导的转基因表达所需的一些步骤但不是所有步骤的6那些能够实现转导的双链DNA阶段的AAV变体的Cre依赖性回收显著提高了选择严格性。此性回收的AAV定向进化技术的基础上，这些AAV变体能够从细胞类型特异性增强子_启动子于猿猴病毒40(SV40)基因组的多腺苷酸化信号(pA)以反义方向置于AAV基因组内含子内，在启动子(如CAG启动子)也可用于TRADE中代替细胞以转导多种细胞类型的AAV衣壳。细胞类型特异性增强子_启动子可以放置在AAVcap基因胞类型特异性转录物被抑制，从而导致成功制备包含AAV_TRADE载体基因组的重组AAV载mRNA序列的表达，而p40启动子的转录活性在转导的细胞中由于缺乏腺病毒辅助功能而保持无活性。整个cap基因ORF可以通过使用以细胞类型特异性方式表达的反义cap基因mRNA触蛋白I基因(hSynI)增强子_启动子的泄漏表达而表达的反义mRNA转录物，也可以以高水[0015]图3靶向脑神经元的TRADE系统的验证。图3中A为AAV_PHP.B_hSynI_GFP_TRADE载显微镜图像证实了细胞类型特异性增强子_启动子驱动的转录物的表达。图3中D所示为在物中MVM内含子的预期剪接(SEQIDNO:190)。外显子_外显子接头(junction)以灰色突出7我们一致地回收到约0.7kb的扩增子。这些RT_PCR产物的Sanger测序鉴定出与图5所示的[0017]图5在源自于AAV9cap基因的反义mRNA中鉴定的内含子(SEQIDNO:192)。当AAV_PHP.Bcap基因序列在HEK293细胞或Neuro2a细胞中在神经元特异性人突触蛋白I(hSynI)增强子_启动子控制下以反义方向被转录时，鉴定了剪接事件与隐蔽的剪接供体和剪接受体元中未观察到这种剪接事件。应该注意的是(1)尽管hSynI增强子_启动子已被用作神经元特异性元件，但已证明其可以驱动HEK293细胞中的渗漏表达；(2)用于内含子剪接实验的AAV9capORF序列在C端附近具有以下沉默突变：gaaccccgccccattggcacGCgTtacCTGACTCGTAATCTGTAA(SEQIDNO:1)。内含子序列标有下划线，已引入内含子中以创建MluI(ACGCGT)识别位点的沉默突变以大写字[0018]图6具有以反义方向存在于AAVcapORF中的外显子_内含子接头的共同特征的隐蔽的剪接供体(SD)和剪接受体(SA)位点。使用多序列比对程序(SEQIDNO223_316)比对序列。剪接供体区域中的虚线表示AAV3capORF衍生的反义mRNA中鉴定的剪接供体位点[0019]图7源自于AAV3cap基因的反义mRNA中鉴定的内含子。pAAV3_hnLSP_MCS_TRADE2是携带具有MVM内含子(hnLSP)的置于肝特异性增强子_启动子下的野生型AAV3capORF的的反义mRNA。两种截短的RT_PCR产物的序列在PCR产物的平端TOPO克隆之后通过Sanger测capORF的剪接受体位点上游约80bp。请注意，也已在AAV1capORF中鉴定了在AAV3cap多序列比对程序比对源自于122个天然存在的AAV毒株(血清型和变体)的cap基因的核苷酸序列(SEQIDNO:317_420)。AAV3capORF衍生的反义mRNA中鉴定的剪接受体位点处的外8显子_内含子接头用实线表示。图8A中的虚线表示实验确定的剪接受体位点附近的替代的于122个天然存在的AAV毒株(血清型和变体)的cap基因的核苷酸序列(SEQIDNO:421_461)。在AAV3capORF衍生的反义mRNA中鉴定的剪接供体位点处的外显子_内含子接头用核苷酸序列(SEQIDNO:194)。通过hSynI增强子_启动子在人胚胎肾(HEK)293细胞或Neuro2a细胞中以反义方向表达AAV1capORF。然后通过RT_PCR分析源自于AAV1capORF受体组合的详细信息。以粗体表示的外显子_内含子接头(CT或AC)处的两个保守核苷酸是两个保守核苷酸是也已在反义AAV3或AAV9capmRNA转录物中鉴定的那些[0023]图11AAV9capORF的剪接抑制诱变。在AAV9capORF中的剪接受体(SA)位点和/天然序列(SEQIDNO:195，SEQIDNO:196)剪(SEQIDNO:197)在SA位点周围具有一组突变，而AAV9NS2基因组(SEQIDNO:198)在SD位[0024]图12在剪接供体和/或受体位点周围引入的突变有效地抑制了源自于AAV9capORF的反义mRNA的剪接。Neuro2a细胞用含有AAV9capORF和各种潜在的TRADE构型中的剪有密码子修饰的剪接受体的AAV9_TRADE载体基因组。NS2，具有密码子修饰剪接供体的[0025]图13应用TRADE鉴定在全身AAV载体注射后对于脑神经元转导增强的AAV变体的研98氨基酸肽替代AAV9_N272Acap序列(SEQIDNO:222)的Q588。B的质粒文库用于使用三重回收包含肽插入的cap片段，随后包含肽插入的cap片段被克隆回AAV载体质粒骨架。在[0026]图14A_图14D通过AAVRNABarcode_Seq验证小鼠和非人灵长类动物中26种新型种病毒条码(VBC)可以在hSynI增强子_启动子有活性的细胞(即神经元)中特异性表达为转中鉴定的5种变体和非人灵长类动物中鉴定的21种变体)和3种对照AAV衣壳(AAV9、AAV9_N272A和AAV_PHP.B)的神经元转导。包含由TRADE鉴定中鉴定的5个变体和由TRADE在非人灵长类动物中鉴定的21个变体)的带DNA/RNA条码的dsAAV_hSynI_GFP_BC文库(dsAAV_hSynI_GFP_BCLib)和对照AAV衣壳(AAV9、AAV9_N272A和AAV_PHP.B)以每只小鼠5×1011vg的剂量静脉注射到三只成年雄性C57BL/6J小鼠和三只成新型AAV变体和3个对照AAV衣壳的神经元转导。将相同的带DNA/RNA条码的AAV文库以2×的12个不同脑区域中通过AAVRNABarcode_Seq分析3种TRADE变体HN1、HN2和HN3以及AAV_[0027]图15使用传统的eGFP报告载体和组织学定量验证小鼠中AAV9_N272A_HN1的增强的自我互补AAV基因组的AAV9、AAV_PHP.B和AAV9_N272A_HN1载体。将纯化的载体以3×1011vg/小鼠的剂量通过尾静脉施用至8周大雄性C57BL/6J或BALB/cJ小鼠(n＝4只小鼠/载的矢状切片的代表性瓷砖式扫描图像。图15中C为基于四个脑区域中表达eGFP和NeuN的细和NeuN的细胞的手动计数的D中的神经元转导的定量。误差棒代表平均值+/_SEM。***p<[0028]图16A_图16B使用已附加表位的eGFP报告载体验证恒河猴中相对于AAV9的增强的AAV9_CAG_FLAGnlsGFP_BCLib、AAV9_CAG_HAnlsGFP_BCLib、AAV9_N272A_HN1_CAG_FLAGnlsGFP_BCLib和AAV9_N272A_HN1_CAG_HanlsGFP_BCLib。nlsGFP(带有源自于SV40大T抗原的核定位信号的eGFP)在N端用FLAG标签或HA标签进行标记。每个载体都是带DNA/RNA未使用此特征。图16A中描绘的上半部分的两个载体以1:1比例混合以制成AAV文库1中，AAVLib1和AAVLib2各自包含1:1比例的表达带有已附加表位的nlsGFP的AAV9载体和来自一只接受AAVLib的动物的代表性大图拼接式扫描的(tile_scanned)脑部分。每个AAV[0029]图17A_图17D在小鼠和恒河猴种在全身递送后AAV9_N272A_HN1向主要外周器官的生物分布。我们使用AAVDNABarcode_Seq确定由dsAAV_hSynI_GF17B和图17C)中包含的每个AAV衣壳递送的每个外周器官中的AAV载体基因组DNA的相对丰和非人灵长类动物中通过TRADE鉴定的26个AAV变体的dsAAV_hSynI_GFP_BCLib文库以及对还使用AAVRNABarcode_Seq确定图16A(图17D)中描述的静脉注射有ssAAV_CAG_nlsGFP_BCLib文库的恒河猴的每个外周器官中与AAV9相比的相对转导效率。图17A在C57BL/6J小布。图17B在C57BL/6J小鼠和BALB/cJ小鼠(n＝3只小鼠/品系)中AAV9_N272A_HN1的向除肝外的主要外周器官的生物分布。图17C基于dsAAV_hSynI_GFP_BC分析，在恒河猴(n＝1)中注射有dsAAV_hSynI_GFP_BCLib文库的一只恒河猴收集的样本进行AAVDNABarcode_Seq分周器官的生物分布(n＝2)。对于该实验，对从如图16A所示的注射有ssAAV_GAG_nlsGFP_BCLib载体的恒河猴收集的样品进行AAVRNABarcode_Seq分析。误差棒代表平均值+/_[0030]图18在小鼠全身施用后AAV9_N272A_HN1具有高度亲神经性。在强遍在CAG启动子控制下表达nlsGFP的AAV9和AAV9_N272A_HN1载体以3x1011vg/小鼠的剂量静脉注射到8周自用AAV9_N272A_HN1_CAG_nlsGFP转导的小鼠大脑皮层的代表性图像。绝大多数用AAV9_AAV9和AAV9_N272A_HN1衣壳的神经元特异性。通过将双阳性细胞(eGFP+/NeuN+)的数量除或遍在方式表达的capORF的反义mRNA的AAV衣壳的定向进化。这样的系统不需要Cre转基因动物。因此，它可以应用于大型动物包括非人灵长类动物的细胞类型特异性AAV衣壳进靶细胞中表达AAV衣壳蛋白的细胞类型特异性或遍在方式表达的capORF的mRNA的AAV衣壳新型AAV衣壳在C57BL/6J小鼠中在静脉注射后比AAV9好几倍地转导脑神经元。在某些实施们对假定的剪接供体位点和剪接受体位点的了解，设计这种非剪接版本的AAVcapORF成[0044]本公开的多核苷酸和多肽序列也可以根据与本文所述的某些多核苷酸和多肽的特定同一性和/或相似性来定义。序列同一性通常大于60优选大于75更优选大于80甚至更优选大于90并且可以大于95％。序列的同一性和/或相似性可以是与本文个序列的序列同一性和/或相似性百分比可以使用Karlin和Altschul(1990)，修改为等人(1997)所述的空位BLAST。当使用BLAST和空位BLAST程序时，可以使用各自程序[0045]如本文所公开的制备AAV载体的方法是本领域众所周知的，包括例如使用包装细[0049]在本文公开的AAV载体的一些实施方案中，一种或多种反馈元件可用于抑制目的以将目的蛋白质的表达水平维持在生理水平的体内平衡的[0050]在本文公开的AAV载体的一些实施方案中，基因组编辑机制可用于以位点特异性方式遗传修饰细胞基因组DNA或mRNA转录物。Komor等人，Cell168,20_36(2017)；和分泌多肽的N_末端)的融合可以允许以可以从转导的细胞分泌的形式产生治疗性蛋白质。[0052]如本文所述，通过非侵入性技术通过某些AAV载体例如具有AAV9序列的非AAV9载7至10118至1011[0059]在腺病毒辅助功能存在情况下驱动细小病毒科cap基因表达的所述第一方向上的[0060]相对于所述第一方向是反义的第二方向上的第二启动子其中，所述第二多腺苷酸化信号位于引起所述细小病毒科cap基因的反义mRNA转录终止的因序列。[0068]9.包含多个实施方式4所述AAVcap基因序列。67或108个独特的AAVcap基因序列。[0070]11.如实施方式1_8中任一项所述的核酸，进一步包含所述第二方向上的目的基定位为使得所述cap基因在所述第一方向上被正确翻译成全长衣壳蛋白并且所述cap基因被正确转录为包含全长AAVcap基因编码序列的反义基因序列的至少一种其他AAV载体相比时具有增强的转导来自目的组织的细胞的能力，所[0077]制备包含富集的AAV载体的回收的cap基因序列的第二轮AAVTRADE核酸文库，并[0078]通过向一只或多只动物注射所述第二轮AAVTRADE载体文库并回收所述动物的所[0081]将实施方式4_8或11_13中任一项所述的核酸或实施方式9或10所述的核酸文库引入AAV包装细胞系并从所述包装细胞系回收AAVTRADE载体或AAVTRADE载[0082]16.一种用于确定AAV载体的新型cap基[0091]在腺病毒辅助功能存在情况下驱动所述细小病毒科cap基因表达的所述第一方向[0092]在没有腺病毒辅助功能情况下驱动所述细小病毒科cap基因表达的所述第一方向67或108个独特的AAVcap基因序列。基因序列的至少一种其他AAV载体相比时具有增强的转导来自目的组织的细胞的能力，所[0103]通过将实施方式27或28的核酸文库引入AAV包装细胞系并从所述包装细胞系中回[0106]制备包括回收的富集AAV载体的cap基因序列的第二轮AAVTRADE核酸文库，将该[0107]通过向一只或多只动物注射所述第二轮AAVTRADE载体文库并回收在所述动物的[0108]在第一轮富集之后、在第二轮富集之后以及在任何后续轮富集之后鉴定富集的AAVcap基因序列。[0110]将实施方式23_26或29种任一项所述的核酸或实施方式27或28所述的核酸文库引入AAV包装细胞系并从所述包装细胞系回收所述AAVTRADE载体或所述AAVTRADE载体文[0111]32.一种用于确定AAV载体的新型cap基因[0118]36.如实施方式1_8或11_13中任一一剪接供体和/或剪接受体位点的十个核苷酸内的个或多个核苷酸的改变。一氨基酸序列。[0121]39.一种AAVcapORF序列，包含剪接供[0137]40.一种AAVcapORF序列，包含剪接[0152]41.一种AAVcapORF序列，包含[0184]我们在C57BL/6J小鼠和恒河猴中应用了TRADE系统，以鉴定在全身递送后有效转粒的有效制备(图2B)。在反义方向，细胞类型特异性增强子_启动子(例如人突触蛋白IAAV2基因组中存在的内含子中的多腺苷酸化信号(po克隆骨架，我们生成了基于肝脱靶AAV9_N272A(PCT/US2017/068050)cap基因平台的AAV文库，该平台包含在带有AAV9衣壳中的Q588位置处取代的甘氨酸_丝氨酸连接子(5’_GGGS；3’GGGGS)的随机8聚体肽。通过RT_PCR从脑[0185]我们首先测试了TRADE系统使用AAV_PHP.B_hSynI_GFP_TRADE载体从细胞类型特异性反义mRNA中回收AAVcap基因序列的能力(图3)。hS盒以TRADE构型被纳入包含AAV_PHP.B衣壳基因的AAV载体基因组中(图3A)。该载体基因组被包装到AAV_PHP.B衣壳中，所得AAV载体被静脉注射到两只8周大的雄性C57BL/6J小鼠体回收了cap基因的反义mRNA(图3E)。反义mRNA特有的剪接点的Sanger测序证实RT_PCR产物达的hSynI增强子_启动子驱动的反义mRNA中成功回收AAVcap序列周大的雄性C57BL/6J小鼠，另一次使用了一只8个月大的雄性恒河猴。我们制备了AAV9_N272A_hSynI_GFP_TRADE_Lib文库，该文库由在Q588的位置具有GGGS(N8)GGGGS(SEQID物扩增包括侧翼区域的肽区域。然后使用RT_PCR产物创建下一个AAV9_N272A_hSynI_于第二轮选择和第三轮选择，我们包装了没有GFPORF的AAV9_N272A_hSynI_TRADE_Lib基于某些样品，我们将第一次PCR产物直接克隆到质粒骨架中，无需对Sanger测序进行嵌套PCR。在小鼠的三轮选择(表1)和非人灵长类动物的一轮选择之后，我们确定了许多插入室先前开发的DNA/RNABarcode_Seq技术(Adachi等人NatCommun5,3075(2014)；和PCT/US2017/068050)比较在两种常用小鼠品系(C57BL/6J和BALB/cJ)和一只恒河猴中静脉施用发现：(1)由TRADE技术鉴定的一些新型变体，特别是AAV9_N272A_TTNLAKNS(HN1)和AAV9_于HNx名称，请参阅表3。(2)如Hordeaux等人(Hordeaux等人2018)先前报道的那样，AAV_(HN1)和AAV9_N272A_QQNGTRPS(HN2)在BALB/cJ小鼠中保留了强力神经元转导，显示出比特别是，AAV9_N272A_TTNLAKNS(HN1)在多个脑区域中最好地转导非人灵长类动物的脑(图出不同程度的肝脱靶特性(图17A)。(6)在小鼠中AAV9_N272A_TTNLAKNS(HN1)和AAV9_N272A_QQNGTRPS(HN2)可以比AAV9好高达17倍地转导在肺中具有hSynI增强子_启动子转录用靶向小鼠脑神经元的AAV9_N272N_GGGS(N8)GGGGS文库鉴定的肽序列。[0197]表2通过hSynI一TRADE系统使用靶向恒河猴脑神经元的AAV9一N272A一GGGS(N8)[0200]表3用于每个AAV毒株的表型确定的带DNA/RNA条码的dsAAV_hSynI_GFP_BCLib文[0203]新型AAV9_hSynI_TRADE衍生的衣壳变体是从小鼠中的三轮选择(表1)和恒河猴中表4在C57BL/6J小鼠中静脉施用后TRADE表4在C57BL/6J小鼠中静脉施用后TRADE鉴定的AAV变体的脑神经元转导效率和生[0207]包含26种由TRADE鉴定的新型AAV变体的带DNA/RNA条码的dsAAV_hSynI_GFP_BC文库(dsAAV_hSynI_GFP_BCLib)和对照AAV衣壳以每只小鼠5×1011vg的剂量静脉注射到3只[0211]对从注射了1×1013vg/kg带DNA/RNA条码的dsAAV_hSynI_GFP_BCLi后TRADE鉴定的AAV变体的脑神经元转导效率和[0213]包含26种由TRADE鉴定的新型AAV变体的带DNA/RNA条码dsAAV_hSynI_GFP_BC文库(dsAAV_hSynI_GFP_BCLib)和对照AAV衣壳以每只小鼠5x1011vg剂量静脉注射到3只BALB/cJ小鼠中(对于文库，请参见表3)。注射后两周，各种组织被收集并分析，通过AAVRNABarcode_Seq分析脑转导以及通过AAVDNABarcode_Seq分析向外周器官的生物分布。所有静脉施用后一只恒河猴的不同脑区中的hSynI_TRADE衍生的AAV变体[0216]对从静脉注射了2.0×1013vg/kg表达在hSynI增强子_启动子控制下的RNA条码的带DNA/RNA条码的dsAAV_hSynI_GFP_BCLib文库的一只恒河猴(n＝1)的不同脑区提取的RNA[0221]表9由AAVDNABarcode_Seq分析确定的静脉施用后hSynI_TRADE衍生的AAV变体向[0224]对从静脉注射2×1013vg/kg带DNA/RNA条码的dsAAV_hSynI_GFP_BCLib[0227]在反义AAVcapmRNA中鉴定的外显子_内含子接头周围的十个核苷酸与接头一起PHP.B_hSynI_GFP_TRADE转导的小鼠脑组织中回收的RNA并非如内含子连接共同特征的隐蔽的剪接供体位点和剪接受体位点也可以在许多天然AAV血清型中与AAV9cap基因中鉴定的剪接供体位点和剪接受体位点相对应的区域中被鉴定出并且它们是高度保守的(图6)。这表明剪接可能发生在不仅AAV9而且许多其他AAV毒株的cap细胞中的人类肝特异性启动子(LSP)控制下被表达时，AAV3capORF衍生的反义mRNA上会mRNA上存在多个剪接事件(图7)。测序比对研究鉴定了其他的潜在剪接供体位点和剪接受体位点(图8和图9)。当反义mRNA在HEK293细胞或Neuro2a细胞接供体位点(GT/CA)和剪接受体位点(AG/TC)在不同血清型中高度保守，表明这些位点在[0229]capORF衍生的反义mRNA的潜在剪接在科学上是有趣的，但当需要从反义mRNA中我们在质粒pAAV9_N272A_PHP.B_hSyn1_GFP_TRADE中包含的AAV9capORF中引入了沉默突变，该突变破坏了剪接受体(SA)共有序列(pAAV9NS1构建体)、剪接供体(SD)共有序列 [0231]为了鉴定源自于capORF的反义mRNA上的潜在剪接供体位点和剪接受体位点，我们专有的反义mRNA上的潜在剪接供体位点和剪[0232]我们通过使用密码子优化的序列改变至少一个