ISO 231902021 中药.用高效液相色谱法（HPLC）测定天然产品中马兜铃酸标准立项发展报告

中药中马兜铃酸测定高效液相色谱法国际标准立项发展报告StandardizationDevelopmentReport:TraditionalChineseMedicine—DeterminationofAristolochicAcidsinNaturalProductsbyHigh-PerformanceLiquidChromatography(HPLC)摘要马兜铃酸（AristolochicAcids,AAs）是一类存在于马兜铃科植物中的硝基菲类有机酸，具有明确的肾毒性和致癌性，其安全性问题已成为国际社会关注的热点。为有效控制含马兜铃酸中药材及天然产物的质量安全风险，国际标准化组织（ISO）于2021年6月正式发布了ISO23190:2021《中药——用高效液相色谱法（HPLC）测定天然产品中马兜铃酸》标准。该标准作为中药领域重要的安全性检测方法标准，建立了基于高效液相色谱技术测定天然产物中马兜铃酸I和II的统一技术规范，明确了样品制备、色谱条件、系统适用性试验、定量分析方法及方法学验证等核心技术要求。本报告系统梳理了该标准的立项背景、研制历程、核心技术内容及其行业影响，分析了标准实施对中药国际贸易、质量控制体系建设和公众用药安全保障的重要意义，并对该标准未来的修订方向和应用拓展进行了展望。关键词：马兜铃酸；高效液相色谱法；中药安全；国际标准；质量控制Keywords:AristolochicAcids;High-PerformanceLiquidChromatography(HPLC);TraditionalChineseMedicineSafety;InternationalStandard;QualityControl一、引言1.1马兜铃酸安全性问题概述马兜铃酸（AristolochicAcids）主要存在于马兜铃属（Aristolochia）和细辛属（Asarum）等马兜铃科植物中。20世纪90年代初，比利时发生的“中草药肾病”事件首次将马兜铃酸的毒性问题推向国际视野——约100名服用含广防己减肥药的女性出现进行性肾纤维化，其中数十人发展至终末期肾病。后续研究进一步证实，马兜铃酸具有不可逆的DNA损伤作用和明确的致癌性，国际癌症研究机构（IARC）于2008年将马兜铃酸列为I类致癌物。2012年，一项发表于《美国肾脏病学会杂志》的研究指出，马兜铃酸暴露与亚洲地区部分尿路上皮癌的发生存在显著相关性，进一步加深了国际社会对该物质安全风险的关注。1.2国际监管与标准需求鉴于马兜铃酸的严重安全性问题，世界各主要药品监管机构均采取了严格的管控措施。美国食品药品监督管理局（FDA）自2001年起禁止含有马兜铃酸的植物原料进入美国市场；欧盟于2013年发布指令2013/46/EU，要求各成员国确保含有马兜铃科植物的药品不得在欧盟境内流通；中国国家药品监督管理局亦多次修订相关监管政策，对含马兜铃酸的中药品种实施严格的分类管理。然而，在国际贸易实践中，不同国家和地区对马兜铃酸的限量标准、检测方法存在显著差异，缺乏统一的技术规范。这一局面不仅增加了跨境贸易的合规成本，也为不法产品规避监管提供了可能。因此，制定一项国际公认的马兜铃酸检测方法标准，成为中药国际化进程中亟待解决的关键技术问题。1.3标准立项的背景ISO/TC249（中医药技术委员会）自2009年成立以来，致力于中医药领域的国际标准化工作。在此框架下，中国于2017年首次提出制定马兜铃酸HPLC检测方法国际标准的提案。该提案由中国食品药品检定研究院牵头起草，联合国内多家权威科研机构共同推进。经过国际专家多轮研讨和实验室间验证，标准最终于2021年6月9日正式发布。二、标准概述2.1标准基本信息|项目|内容||------|------||标准编号|ISO23190:2021||标准名称|中药——用高效液相色谱法（HPLC）测定天然产品中马兜铃酸||英文名称|TraditionalChineseMedicine—Determinationofaristolochicacidsinnaturalproductsbyhigh-performanceliquidchromatography(HPLC)||发布机构|国际标准化组织（ISO）||技术委员会|ISO/TC249（中医药）||发布日期|2021-06-09||标准状态|现行||国际分类号|药物（ICS11.120.10）||标准语言|英语|2.2标准适用范围本标准适用于天然产物（含中药材、中药饮片及其中间产品）中马兜铃酸I（AristolochicAcidI,AAI）和马兜铃酸II（AristolochicAcidII,AAII）的定性与定量测定。标准所规定的检测方法以反相高效液相色谱-紫外检测（HPLC-UV）为核心技术手段，检测限和定量限满足各国监管机构对马兜铃酸的控制要求。三、核心技术内容3.1方法原理本标准采用反相高效液相色谱法，基于马兜铃酸I和II在C18色谱柱上的保留行为差异实现分离，通过紫外检测器在波长约250nm处进行检测（该波长下马兜铃酸具有特征性紫外吸收）。马兜铃酸I和II的分子结构中均含有共轭体系和硝基取代基，呈现出特征性的紫外吸收光谱，为实现选择性检测提供了物化基础。3.2样品制备关键技术要求样品前处理是保证检测结果准确性的关键环节。本标准系统规定了不同类型样品（药材、粉末、提取物、制剂等）的提取和净化方法：-提取溶剂：推荐使用甲醇-水混合溶剂体系，确保马兜铃酸的有效提取；-提取方式：规定了超声提取的操作参数（温度、时间、功率）；-净化方法：采用固相萃取（SPE）技术去除基质干扰，标准对SPE柱的选型、活化、上样、淋洗和洗脱程序作出了具体规定；-内标使用：推荐采用合适的内标物质（如2-氯马兜铃酸）以校正样品处理过程中的回收率波动。3.3色谱条件标准规定了系统化的色谱分析条件：-色谱柱：C18反相色谱柱（粒径5μm或更小，柱长150~250mm，内径4.6mm）；-流动相：采用乙腈-酸水体系（酸为甲酸或乙酸，调节流动相pH值至2.5~4.0），可选用等度或梯度洗脱模式；-流速：0.8~1.5mL/min；-柱温：25~40°C；-检测波长：250nm±2nm；-进样量：5~20μL。3.4系统适用性试验与方法学验证为确保分析结果的可靠性，标准明确要求进行系统适用性试验，规定马兜铃酸I和II的分离度应不低于1.5，理论塔板数不得低于5000，拖尾因子应在0.8~1.8之间。此外，标准对方法学验证指标提出了明确要求，包括：-线性范围：各组分标准曲线相关系数r≥0.999；-检测限（LOD）和定量限（LOQ）：AAI的检测限不高于0.5ng，定量限不高于2ng；-回收率：加标回收率应在85%~115%范围内；-精密度：重复性RSD不大于5%，中间精密度RSD不大于8%。3.5结果计算与表达标准规定了基于外标法和内标法的定量计算公式，并要求最终结果以马兜铃酸I和II各自的含量（mg/kg或μg/g）分别报告。对于超出线性范围的样品，标准规定了稀释或调整进样量的处理程序。四、标准研制历程4.1提案阶段（2017—2018年）2017年，中国国家标准化管理委员会经由ISO/TC249正式提交新工作项目提案（NWIP）。提案获得包括德国、澳大利亚、日本、韩国、泰国等成员国专家的广泛关注和支持。经ISO/TC249全体成员国投票表决，该项目于2018年正式立项，项目编号为ISO/TC249/WG4。4.2起草与讨论阶段（2018—2020年）由中国食品药品检定研究院牵头组建标准起草工作组，工作组核心成员来自中国、德国、日本、韩国等国家的药品检验机构和学术研究单位。工作组先后召开多次国际会议和网络研讨会，对各技术环节进行深入讨论。讨论集中的焦点问题包括：-样品前处理方法的普适性和可操作性；-不同实验室间色谱条件的协同性问题；-标准限值设定应当参考的毒理学数据基础；-方法的适用范围是否应扩展至复方制剂。标准草案历经工作组草案（WD）、委员会草案（CD）和国际标准草案（DIS）等阶段，期间根据各成员国反馈意见进行了多轮修改完善。4.3国际标准最终草案（FDIS）与发布阶段（2020—2021年）2020年底，标准进入FDIS阶段，经ISO/TC249各P成员国最终投票，获得一致通过。2021年6月9日，ISO23190:2021正式向全球发布。该标准是ISO/TC249在中药安全性检测领域发布的重要标准之一，标志着中药安全性控制国际标准体系取得了新的突破。五、标准实施意义与行业影响5.1保障公众用药安全马兜铃酸肾毒性和致癌性的分子机制研究已表明，其DNA加合物在体内具有长期蓄积性和不可逆性。ISO23190:2021提供了一套经过国际验证的标准化检测工具，使得各国药品监管机构能够以统一的方法对市售含马兜铃酸风险的产品进行筛查和定量分析，从源头上降低公众的暴露风险。对中药企业而言，该标准为原料验收、过程控制和成品放行提供了明确的技术依据，有助于建立全链条的质量控制体系。5.2促进中药国际贸易便利化在ISO23190:2021发布之前，各国对马兜铃酸的检测方法不尽相同——部分国家采用LC-MS/MS法，部分国家采用HPLC法，各国在样品制备、定量方式上亦存在显著差异。这种技术壁垒导致了重复检测、结果互认困难等问题。本标准的发布为各国提供了一个统一的方法学平台，为检测结果的国际互认奠定了技术基础。以中欧中药贸易为例，欧盟传统草药注册指令（2004/24/EC）要求申请人提供产品安全性数据，其中马兜铃酸的检测数据是评估安全性的核心内容之一。ISO23190:2021的实施有助于中国企业按照国际统一标准开展检测，提高注册申请的通过率和效率。5.3推动中药标准化体系建设ISO23190:2021的发布，进一步完善了ISO/TC249的标准体系，丰富了中药安全性检测领域的国际标准供给。该标准与其他已发布标准（如ISO18668系列中药编码标准、ISO21309中药煎煮服务标准等）共同构建了覆盖中药质量、安全、服务的标准矩阵，推动了中药从“经验管理”向“标准治理”的转变。5.4促进检测技术进步与实验室能力建设标准发布后，各国药品检验机构和第三方检测实验室纷纷按照ISO23190:2021的要求建设或升级相关检测能力。标准中规定的系统适用性要求和验证指标，实际上为实验室的方法确认和能力验证提供了基准。同时，标准的实施也推动了高灵敏度检测技术（如LC-MS/MS法作为确证手段）与常规HPLC筛查方法的协同应用，形成了“筛查-确证”的层级化检测策略。六、主要起草单位介绍：中国食品药品检定研究院中国食品药品检定研究院（NationalInstitutesforFoodandDrugControl,NIFDC，以下简称“中检院”）是国家药品监督管理局直属的药品、生物制品、食品、化妆品检验检定的法定机构和技术仲裁机构，承担着国家药品标准物质研制、标准制修订以及食品药品质量监督检验等重要职责。在ISO23190:2021的研制过程中，中检院作为项目牵头单位，负责标准提案起草、方法学研究和国际协调等核心工作。具体而言，中检院中药民族药检定所组建了由药物分析、中药化学和毒理学等多学科专家参与的科研团队，系统开展了马兜铃酸HPLC检测方法的系统适用性优化研究，包括不同品牌色谱柱的分离效能评价、不同基质类型样品的提取效率比较、以及实验室间协同验证方案的设计与实施。此外，中检院还依托其国家药品标准物质制备平台，研制了马兜铃酸I和II的国家标准物质，为标准的实施提供了关键的计量溯源性支撑。在国际协调方面，中检院专家作为ISO/TC249注册专家，在标准讨论和意见处理过程中发挥了核心作用，确保了中国在中药国际标准制定中的话语权和主导地位。中检院长期致力于中药安全性和有效性评价技术体系的研究，近年来在黄曲霉毒素、农药残留、重金属及有害元素等外源性污染物检测领域取得了系列重要成果。此次牵头制定ISO23190:2021，是中检院履行“国家药品安全技术支撑”职能的重要体现，也是其国际化发展战略的成功实践。七、标准面临的挑战与未来展望7.1实施层面的挑战ISO23190:2021作为一项基于HPLC-UV技术的检测方法标准，在推广应用过程中仍面临若干挑战：-灵敏度瓶颈：HPLC-UV法的灵敏度低于LC-MS/MS法。随着各国监管限量要求日趋严格，部分高要求应用场景可能需要与质谱技术联用；-基质复杂性：中药材和天然产物基质高度复杂，部分品种（如含挥发油丰富的药材）在前处理过程中可能遭遇基质干扰的问题，需要实验室根据具体样品类型进行适当的方法调适；-检测能力不平衡：部分发展中国家和中小企业的实验室能力建设滞后，在仪器配置和人员技术方面需要进一步培训和投入。7.2标准修订方向未来标准的修订可重点关注以下方向：-扩展检测对象：将检测范围扩展至马兜铃酸内酰胺（aristolactam）等其他相关化合物，构建更为完整的风险物质控制谱系；-引入新技术：考虑将UHPLC方法、LC-MS/MS确证方法纳入标准体系，实现“高效筛查+精准确证”的互补策略；-细化限量建议：结合最新的毒理学和暴露评估数据，对具体药材品种提出更有针对性的限量指导值；-增加附录实例：补充更多实际样品（如含马兜铃酸的中成药、保健品等）的检测色谱图和验证数据，增强标准的可操作性。7.3应用前景与拓展随着全球对中药安全性的关注持续升温，ISO23190:2021的应用范围有望进一步拓展：-监管应用：可作为各国药典和药品监管机构制定马兜铃酸检测方法的技术参考基准；-国际贸易：可作为中药材及天然产物进出口贸易中马兜铃酸项目检测的通用方法，减少重复检测和贸易摩擦；-科研支撑：为新药研发中天然产物的安全性评价、含马兜铃酸药材替代品研究提供标准化检测工具；-大健康产业：可为含天然植物成分的食品补充剂、化妆品等大健康产品的安全性评价提供方法学参考。八、结论ISO23190:2021《中药——用高效液相色谱法（HPLC）测定天然产品中马兜铃酸》是中药安全性检测领域具有里程碑意义的国际标准。该标准的发布和实施，不仅为全球范围内马兜铃酸的风险防控提供了统一、规范、可信的技术工具，也是中药标准化发展水平不断提升的重要标志。从更宏观的视角来看，本标准的成功研制和发布，充分验证了ISO/TC249框架下中药国际标准制定工作模式的可行性——即以科学数据为基础、以国际协作机制为保障、以服务公众健康为目标。中国在其中发挥的主导作用，体现了我国在中药标准化领域的专业实力和国际影响力。参考文献[1]InternationalOrganizationforStandardization.ISO23190:2021TraditionalChinesemedicine—Determinationofaristol