药品生物检定技术（第2版）课件 第一篇 第一章 药品生物检定基础知识与基本操作

第一章药品生物检定基础知识与基本操作目录01药品生物检定技术概述02生物检定用培养基03生物检定用菌毒种及动物细胞的质量控制04药品生物检定技术基本操作05实验动物操作技术学习目标1.掌握药品生物检定技术的概念。2.掌握培养基的概念、分类和配制过程。3.熟悉生物检定用菌毒种概念和分类、动物细胞的概念和检定项目。4.熟悉实验动物操作技术。知识目标1.学会配制各类培养基的方法。2.规范、熟练进行微生物的接种操作。能力目标1.树立生物检定过程中的安全操作意识。2.培养耐心细致、严谨务实的职业态度。素养目标第一节药品生物检定技术一、药品生物检定技术的概念药品生物检定技术是利用药物对生物体包括整体动物、离体组织、器官、细胞和微生物等，所产生的药理作用或者毒理作用以及其他反应来测定药品的有效性（即生物活性或效价）、安全性（即毒性或某些有害物质限度检查、无菌检查等），以及研究药物的量效关系，是反映药品的临床功能、效价和安全的一门学科。二、药品生物检定技术的任务（一）药品的生物活性测定《中国药典》（2025年版）收载了激素类药品的生物检定法、抗生素类药品的微生物检定法、酶和蛋白的生物检定法，还收载了菌苗、疫苗、抗毒素、类毒素、单克隆抗体等药品的效力测定法。（二）药品的安全性检查无菌检查微生物限度检查细菌内毒素检查异常毒性检查其他（三）检验方法的核对用生物检定法来核对理化检验方法是否可靠。（四）神经介质、激素及其他微量生理活性物质的测定采用理化检验方法测定某些神经介质、激素或其他微量生理活性物质的浓度，具有高效快速等优点，但这些物质具有微量、生理活性强的特点，生物检定法往往具有更高的灵敏度和专一性。此外，生物检定法一般对样品的纯化要求不高，在样品处理上较理化方法的要求更低。第二节生物检定用培养基一、培养基的概念和分类（一）培养基的概念培养基是人工配制的生物营养物质，即用人工方法将多种物质按各种微生物生长繁殖的需要配制成的一种混合营养物质，用于细菌的培养、分离、鉴定、研究和保存。（二）培养基的分类

1．按物理性状分可分为液体、流体、固体、半固体4种。常用固体培养基有平板、斜面2种。2．按用途分可分为基础培养基、选择培养基、增菌培养基和鉴别培养基等，或分为需氧菌检查用培养基、霉菌检查用培养基、酵母菌检查用培养基、厌氧菌检查用培养基等。二、培养基的制备过程1．容器要求

玻璃器皿或搪瓷，禁用金属容器。2．称量与溶解

根据处方要求配制。3．校正pH一般高压灭菌前应比最终pH高0.2~0.3（验证）。4．分装

不同类型培养基分装要求不同。5．灭菌

一般采用高压蒸汽灭菌（121℃20min或115℃30min）6．储存

干粉（阴冷干燥处）；配制好的培养基（2~25℃）。第三节生物检定用菌毒种及动物细胞的质量控制一、生物检定用菌毒种的管理及质量控制1.概念

生物制品检定用菌毒种系指直接用于检定生物制品的细菌、真菌、支原体、放线菌、衣原体、立克次体或病毒等，包括各种经过基因工程修饰的菌毒种。检定用菌毒种其来源途径应合法，并经国家药品监督管理部门批准，应确保其生物学特性稳定，并且适用于检定要求。2.分类

以中国《人间传染的病原微生物目录》为基础，根据病原微生物的传染性、感染后对个体或群体的危害程度，将菌毒种分为四类。01第一类病原微生物系指能够引起人类或者动物非常严重疾病的微生物，以及中国尚未发现或者已经宣布消灭的微生物。03第三类病原微生物系指能够引起人类或者动物疾病，但一般情况下对人、动物或者环境不构成严重危害，传播风险有限，实验室感染后很少引起严重疾病，并且具备有效治疗和预防措施的微生物。02第二类病原微生物系指能够引起人类或动物严重疾病，比较容易直接或间接在人与人、动物与人、动物与动物之间传播的微生物。04第四类病原微生物系指在通常情况下不会引起人类或者动物疾病的微生物。无菌检查微生物限度检查3.菌毒种的保存与销毁保存销毁菌毒种经检定后，应根据其特性，选用冻干、液氮、≤-60℃冻存或其他适当方法及时保存。不能冻干、液氮、≤-60℃冻存的菌毒种，应根据其特性，置适宜环境至少保存2份或保存于两种培养基。保存的菌毒种传代、冻干、液氮、≤-60℃冻存均应填写专用记录。销毁一、二类菌毒种的原始种子、主种子批和工作种子批时，须经本单位领导批准，并报请国家卫生行政主管部门或省、自治区、直辖市卫生行政主管部门认可。销毁三、四类菌毒种须经单位领导批准。销毁后应在账上注销，作出专项记录,写明销毁原因、方式和日期。二、生物检定用动物细胞的质量控制1.概念

检定用动物细胞系指用于生物制品检定的细胞，包括原代细胞、连续传代细胞或二倍体细胞，以及经特定基因修饰过的细胞。细胞鉴别试验细胞形态、生物化学法、免疫学检测、细胞遗传学检测、遗传标志检测以及其他方法。支原体检测第一法（培养法）。支原体液体培养基、半流体培养基，36℃±1℃，如接种供试品的培养基均无支原体生长，则供试品判为合格。细菌、真菌检查取混合细胞培养上清液或冻存细胞管样品，依“无菌检查法（通则1101）”进行检查，应符合规定。外源病毒因子检查采用体外培养法检测外源病毒因子。用细胞培养上清液制备活细胞或细胞裂解物作为待检样本，分别接种至少下列三种指示细胞，包括猴源细胞、人二倍体细胞和同种属来源的细胞。对昆虫细胞，还应至少增加两种敏感的指示细胞进行检测。2.细胞检定（至少1~3项）其他检查成瘤性检查、病毒敏感性检查、细胞功能检查、稳定性检查。第四节药品生物检定技术基本操作一、药品生物检定的基本程序1．采样

随机、客观、均匀、合理（还要遵循各检查项目的其他具体要求）。2．样品检验前处理

完整性、有效性。特殊要求（消毒等）。3．样品检验

依规检查。4．检验记录和检验报告

真实、完整、齐全、不随意涂改。二、无菌技术（一）无菌和半无菌环境1．无菌环境是指人们用物理或化学的方法，在某一可控空间内使悬浮粒子、浮游菌、沉降菌等数量达到最低限度，接近于“无菌”的一种空间。环境洁净度B级下局部洁净度A级的单向流空气区域内或隔离系统中即达到《中国药典》2025年版要求的这种“无菌”空间。2．半无菌环境半无菌操作间要求设有紫外灯，在此基础上还应附设空气净化及空调设备，控制室温为20～25℃，达到无菌或半无菌状态。抗生素微生物检定要求的环境是半无菌操作间。（二）实验器材1．灭菌器材

需要灭菌处理的器材均需要灭菌，或采用标注灭菌的产品。如玻璃器皿、接种针、注射器、吸管、试管、培养基、稀释剂等。2．消毒器材

无法灭菌处理的可进行消毒处理。如无菌室的凳子、试管架、天平、工作台面、操作人员双手等。（三）无菌操作方法无菌操作的目的：一是保证待检样品不被环境中的微生物污染；二是防止检样品中的微生物或阳性对照菌等污染环境或感染操作人员。三、消毒与灭菌（一）消毒消毒是指杀灭病原微生物的繁殖体但不能杀死芽孢等全部微生物的过程。消毒的方法一般都是用化学试剂浸泡或擦拭，这些化学试剂称为消毒剂。如75%乙醇溶液、2%碘酒、0.1%苯扎溴铵溶液、3%甲酚皂溶液等。（二）灭菌灭菌是用适当的物理或化学方法将物品中的微生物杀灭或除去的方法。灭菌可杀灭物体中所有的微生物繁殖体及芽孢或孢子，灭菌后的物品不含任何活的微生物。1.干热灭菌法利用热辐射及干热空气进行灭菌的方法。2.湿热灭菌法通过热蒸汽或沸水使细菌蛋白质变性而杀灭微生物的方法（121℃20min或115℃30min）。3.气体灭菌法用化学消毒剂形成的气体杀灭微生物的方法。如环氧乙烷、气态过氧化氢等。4.辐射灭菌法利用放射性同位素放射γ射线（如60Co）、紫外辐射或电离辐射杀灭微生物的方法。5.物理阻留过滤除菌利用微生物不能通过致密、具孔滤材的原理以除去药品中微生物的方法。四、微生物接种技术接种是指将微生物转移到另一个灭菌的新鲜培养基中，使其生长繁殖的过程。为保证接种过程中不受杂菌的污染，接种过程必须采用严格的无菌操作。（一）常用的接种工具

图1-1微生物接种常用的工具（1.接种环2.接种针3.接种钩4.涂布器）（二）常用的接种方法1．斜面接种图1-2斜面划线接种示意图2．穿刺接种图1-3斜面穿刺接种示意图3．平板接种图1-4连续划线接种示意图图1-5分区划线接种示意图4．液体接种

一种是由斜面培养基接入液体培养基，多用于细菌的纯培养，以便进一步鉴定细菌或保存菌种；另一种是由液体培养基接入液体培养基，多用于增菌培养。第五节实验动物操作技术一、常用实验动物及分类（一）实验动物的遗传学分类1．近交系2．远交系3．突变系4．杂交群（二）实验动物的微生物学分类1．普通动物

外观健康，不带有动物烈性传染病和人畜共患病病原。2．清洁动物

除上述普通动物要求，还不应携带对动物危害大和对科学实验干扰大的病原体。3．SPF动物

除上述要求外，还应排除潜在的感染或条件性致病的病原体，以及对实验干扰大的病原体。4．无菌动物、悉生动物

用于特殊的科研实验。二、实验动物操作方法（一）实验动物编号的标记方法1．大鼠、小鼠一般采用颜料涂擦被毛的方法标记。

当数量不超过10只时，可采用单染色法。编号的原则是先左后右，从前到后。如左前腿上为1，左腰部为2，左后腿为3，头部为4，背部为5，尾基部为6，右前腿为7，右腰部为8，右后腿为9。如实验动物编号超过10或更大数字时，可使用双染色法。最常用染色剂是3%~5%苦味酸溶液（黄色）。2．兔、豚鼠常采用的方法有烙印法、染色法、耳孔法。3．犬将号码印在金属牌上。（二）实验动物被毛的去除方法1．剪毛法2．拔毛法3．剃毛法4．脱毛法常用的脱毛剂为8％硫化钠溶液。（三）实验动物的抓取与固定1．小鼠

以掌心包住小鼠背部皮肤，使头、身、尾成一条直线。2．大鼠

可戴帆布手套，左手从背部中央到胸部捏起来抓住，避免提鼠尾。3．豚鼠

参考大鼠。4．兔

一手抓颈背部皮肤，一手托住腰部或臀部，避免提兔耳。也可用盒式固定器。5.犬

避免犬咬伤。（四）实验动物的麻醉方法1．全身麻醉药：乙醚（短效）、戊巴比妥钠（2-4h）2．局部麻醉药：普鲁卡因（30-40min）、丁卡因（60-90min）。（五）实验动物的给药方法1．口服给药：口服灌胃（灌胃针：尖端焊有中空的小圆金属球，防止刺入气管或损伤消化道，针头弯曲20°左右，适应口腔食管等生理弯曲）