ISOTS 21569-62026 分子生物标记物分析的水平方法.检测转基因生物和衍生产品的分析方法.第6部分检测cry1AbAc和Pubi-cry DNA序列的基于实时PCR的筛选方法标准立项发展报告

分子生物标记物分析的水平方法检测转基因生物和衍生产品的分析方法第6部分：检测cry1Ab/Ac和Pubi-cryDNA序列的基于实时PCR的筛选方法标准立项发展报告StandardizationDevelopmentReport:HorizontalMethodsforMolecularBiomarkerAnalysis—MethodsofAnalysisfortheDetectionofGeneticallyModifiedOrganismsandDerivedProducts—Part6:Real-TimePCRBasedScreeningMethodsfortheDetectionofcry1Ab/AcandPubi-cryDNASequences摘要随着全球转基因生物（GMO）研发与商业化进程的持续推进，转基因产品国际贸易规模不断扩大，各国对转基因成分检测方法的标准化需求日益迫切。cry1Ab/Ac基因作为目前全球种植面积最广的Bt抗虫转基因作物所携带的核心外源基因，其编码的杀虫晶体蛋白在玉米、水稻、棉花等主要作物中广泛应用，而Pubi（玉米泛素基因启动子）则是驱动外源基因高效表达的关键调控元件。针对上述靶标序列建立快速、灵敏、可靠的筛选检测方法，对于转基因产品的市场监管、进出口检验和法规符合性评价具有重要意义。本报告基于ISO/TS21569-6:2026标准的立项背景与技术内容，系统梳理了该标准的研制过程、核心技术要素、与现行标准体系的关系及应用前景。该标准由国际标准化组织（ISO）发布，属于ISO21569系列“分子生物标记物分析的水平方法”的重要组成部分，规定了基于实时荧光PCR技术检测cry1Ab/Ac和Pubi-cryDNA序列的筛选方法，在特异性、灵敏度和可重复性方面均达到国际validation要求。本报告还对标准主要起草单位的工作机制与技术贡献进行了介绍，并对该标准在全球转基因检测标准化领域的应用前景进行了展望。关键词：转基因生物；实时PCR；cry1Ab/Ac；Pubi-cry；分子生物标记物；国际标准；食品安全检测AbstractWiththecontinuousadvancementoftheresearch,development,andcommercializationofgeneticallymodifiedorganisms(GMOs)worldwide,thescaleofinternationaltradeinGMproductshasbeenexpandingsteadily,andthedemandforstandardizeddetectionmethodsforGMOcomponentsacrossdifferentcountrieshasbecomeincreasinglyurgent.Thecry1Ab/Acgene,asthecoreexogenousgenecarriedbythemostwidelycultivatedBtinsect-resistanttransgeniccropsglobally,encodesinsecticidalcrystalproteinsthatareextensivelyappliedinmajorcropssuchasmaize,rice,andcotton.Meanwhile,Pubi(maizeubiquitingenepromoter)servesasakeyregulatoryelementdrivinghigh-efficiencyexpressionofexogenousgenes.Establishingrapid,sensitive,andreliablescreeningmethodstargetingthesesequencesisofgreatsignificanceformarketsupervision,importandexportinspection,andregulatorycomplianceassessmentofGMproducts.Thisreport,basedontheprojectbackgroundandtechnicalcontentofISO/TS21569-6:2026,systematicallyreviewsthedevelopmentprocess,coretechnicalelements,relationshipwiththeexistingstandardsystem,andapplicationprospectsofthisstandard.PublishedbytheInternationalOrganizationforStandardization(ISO),thisstandardconstitutesanimportantpartoftheISO21569serieson"Horizontalmethodsformolecularbiomarkeranalysis,"specifyingreal-timePCR-basedscreeningmethodsforthedetectionofcry1Ab/AcandPubi-cryDNAsequences,withspecificity,sensitivity,andrepeatabilityallmeetinginternationalvalidationrequirements.Thisreportalsointroducestheworkingmechanismsandtechnicalcontributionsofthemajorparticipatinginstitutionsindraftingthestandard,andprovidesanoutlookontheapplicationprospectsofthisstandardinthefieldofglobalGMOdetectionstandardization.Keywords:Geneticallymodifiedorganisms;Real-timePCR;cry1Ab/Ac;Pubi-cry;Molecularbiomarkers;Internationalstandards;Foodsafetydetection一、引言1.1研究背景转基因生物技术自20世纪90年代实现商业化应用以来，全球转基因作物的种植面积持续增长。根据国际农业生物技术应用服务组织（ISAAA）的年度报告，全球转基因作物种植面积已从1996年的170万公顷扩展至近年来的近2亿公顷，涉及玉米、大豆、棉花、油菜等多种主要农作物。其中，表达苏云金芽胞杆菌（*Bacillusthuringiensis*）杀虫晶体蛋白基因（cry基因）的抗虫转基因作物在全球范围内种植最为广泛。cry1Ab和cry1Ac是其中应用最为成熟的两种杀虫基因类型，广泛存在于MON810、Bt11、Bt176等转基因玉米事件以及G2事件、GK19等转基因棉花事件中。与此同时，随着CRISPR等新型基因组编辑技术的快速发展，全球转基因生物及其衍生品的种类和数量持续增加，对检测方法提出了更高的要求。各国监管机构纷纷建立了转基因生物的标识制度与检测标准体系。国际食品法典委员会（CAC）通过了《重组DNA植物及其食品安全性评估准则》等一系列指导文件，对转基因食品的检测与标识提出了明确要求。在这样的大背景下，建立国际统一的、能够覆盖多种转基因事件共性靶标的筛选检测标准，成为各国监管部门和标准化组织的共识。1.2标准立项的必要性转基因生物的检测方法可分为事件特异性检测、构建特异性检测和筛选检测三个层级。其中，筛选检测针对转基因生物中普遍存在的外源基因元件（如启动子、终止子、标记基因等），以较少的检测次数实现对大量样品的快速筛查，在转基因产品的日常监管和市场监测中发挥着不可替代的作用。cry1Ab/Ac基因及其上游调控元件——玉米泛素基因启动子（Pubi）——是多种商业化转基因事件的重要特征序列。然而，由于不同转化事件中所构建的表达盒结构存在差异，部分事件仅含有cry1Ab/Ac基因（如MON810），部分事件同时含有Pubi启动子和cry1Ab/Ac基因（如Bt11），这要求检测方法能够在复杂遗传背景下准确识别上述序列。建立国际上统一的、经过实验室间协同验证的实时PCR筛选方法，对于提升全球范围转基因检测结果的可比性和互认性具有重要的现实意义。ISO/TS21569-6:2026标准的正式发布，正是适应这一需求的产物。二、标准概述2.1标准基本信息ISO/TS21569-6:2026《分子生物标记物分析的水平方法检测转基因生物和衍生产品的分析方法第6部分：检测cry1Ab/Ac和Pubi-cryDNA序列的基于实时PCR的筛选方法》是由国际标准化组织（ISO）下属的ISO/TC34（食品产品技术委员会）SC16（分子生物标记物分析分技术委员会）负责制定的国际标准。该标准于2026年1月29日正式发布，标准状态为现行有效，分类号为食品试验和分析的一般方法。标准文本为英文版，以电子版加密PDF格式发行。2.2标准定位与技术原理本标准的定位是“水平方法”（horizontalmethod），即不针对特定种类食品或特定转基因事件，而是适用于各类食品、饲料及其衍生产品中转基因成分的通用筛选检测方法。该标准规定的技术原理是基于实时荧光PCR（real-timePCR）技术，通过特异性引物和TaqMan荧光探针，对样品DNA中cry1Ab/Ac基因序列和Pubi-cryDNA序列进行靶向扩增与荧光信号实时监测。方法涵盖了DNA提取质量评价、引物探针序列、PCR反应体系、热循环参数、结果判读标准和质量控制要求等完整的技术流程。2.3标准的主要技术内容标准的核心内容包括以下几个方面：第一，规定了适用于该方法的样品范围和DNA提取要求，确保提取的DNA质量和纯度满足实时PCR扩增的要求；第二，详细给出了检测cry1Ab/Ac基因序列和Pubi-cryDNA序列的特异性引物和TaqMan探针的核苷酸序列信息，以及相应的扩增子大小；第三，规定了实时PCR反应体系的组成（包括各试剂的浓度）、热循环参数（退火温度、延伸时间、循环数等）以及仪器校准要求；第四，明确了结果解释的判定标准，包括阳性质控、阴性质控、空白对照和扩增内控（如内源基因平行扩增）的判定规则；第五，规定了方法的性能指标，包括检出限（LOD）、定量限（LOQ）、扩增效率、重复性和再现性等关键验证参数。三、标准研制过程3.1研制背景与工作基础ISO/TS21569-6的研制工作建立在全球多个标准化组织和研究机构在转基因检测领域长期积累的技术成果之上。在ISO框架下，ISO21569系列标准首次发布于2005年（第一版为ISO21569:2005《分子生物标记物分析的水平方法检测转基因生物和衍生产品的分析方法基于核酸的方法》），该系列标准经历了从通用性方法标准向分部分专项标准不断细化和拓展的发展过程，主要发展脉络包括：-ISO21569:2005（第一版）：最初为综合性标准，规定了基于核酸的转基因生物检测通用要求。-ISO21569:2005/Amd1:2013：增加了对样品DNA提取方法的相关规定。-ISO21569-1:2022：标准体系重构后的第1部分，规定了实时PCR方法通用要求和定义，为后续各专项检测方法部分提供了共性技术框架。-ISO/TS21569-2:2021：针对检测事件特异性DNA序列的实时PCR方法。-ISO/TS21569-3:2020：适用于检测植物材料中转基因成分的构建特异性方法。-ISO/TS21569-4:2023：针对检测耐除草剂转基因植物相关DNA序列的方法。-ISO/TS21569-5:2023：针对检测其他常见外源调控元件的方法。-ISO/TS21569-6:2026：本次立项发布的部分，聚焦于cry1Ab/Ac和Pubi-cryDNA序列的实时PCR筛选检测。3.2标准主要研制阶段本标准的研制遵循ISO/IEC导则第1部分和ISO内部规章中关于技术规范（TechnicalSpecification,TS）的制定程序，主要历经了以下几个关键阶段：在新工作项目提案（NWIP）阶段，由ISO/TC34/SC16成员国专家联合提出立项建议，经委员会投票表决通过后正式立项。随后进入工作组草案（WD）阶段，由项目负责人组织国际专家起草标准技术内容，明确方法的靶标序列选择依据、引物探针设计方案、反应体系和循环参数的确定原则。此后进入委员会草案（CD）阶段，标准草案在SC16内部各成员国之间传阅并征集意见，各国专家对方法的技术细节进行了多轮讨论和修改，重点就引物探针的特异性评价数据、方法的检出限验证方案、以及不同类型食品基质对检测性能的影响等内容进行了深入研讨。在国际标准草案（DIS）阶段，标准草案面向全体ISO成员国进行投票和意见征集，收到了来自各成员国在方法性能验证数据和文本表述方面的反馈意见。经过技术修订后，最终版本进入最终国际标准草案（FDIS）阶段进行终审投票，并最终于2026年1月获得批准发布。在研制过程中，标准草案还经过了国际同行验证（inter-laboratoryvalidation），多个国家的专业实验室参与了协同试验，共同验证了方法的灵敏度、特异性、重复性和再现性等关键性能指标。四、标准技术内容分析4.1靶标序列选择与特异性分析cry1Ab和cry1Ac基因在核苷酸序列上具有高度同源性（约85%以上），两者在进化上来源于苏云金芽胞杆菌的不同亚种。在商业化转基因作物的构建中，cry1Ab基因主要存在于孟山都公司研发的MON810、Bt11等转基因玉米事件中，cry1Ac基因则广泛存在于多种转基因棉花和转基因水稻事件中。由于两种基因序列的相似性，设计能够同时检测两者的通用引物探针具有技术可行性。本标准通过筛选保守区域设计引物和探针，实现了对cry1Ab与cry1Ac的同步检测，即“cry1Ab/Ac”联合筛选靶标。Pubi启动子来源于玉米泛素基因（*ubiquitin*）的启动子区域，是驱动外源基因在单子叶植物中高效表达的常用启动子元件。由于该启动子在多种转基因玉米事件中被使用（如Bt11、GA21等），检测Pubi-cryDNA序列（即Pubi启动子与cry基因编码区连接区域的DNA片段）可以进一步提高检测的特异性，有效区分含有该特定表达盒结构的转化事件。本标准同时设置了针对上述两种类型的检测靶标，既可单独使用也可联合应用，为实验室提供了灵活的技术方案，其扩展应用场景包括：其一，在市场监测中通过筛选检测快速判断样品是否含有转基因成分；其二，在对未知样品的溯源分析中，通过检测特征性表达盒结构辅助判定其可能的转化事件来源；其三，在进口食品的符合性判定中，配合事件特异性方法对初筛阳性结果进行确认。4.2实时PCR方法设计标准所规定的实时PCR方法采用TaqMan水解探针技术路线。该方法的基本原理是：在PCR扩增过程中，TaqMan探针与靶标序列特异性结合，当TaqDNA聚合酶沿模板延伸时，其5‘→3’外切酶活性将探针降解，使探针上标记的荧光基团（报告荧光基团）与淬灭基团分离，从而产生可检测的荧光信号。随着PCR循环的进行，荧光信号的累积与扩增产物的增加呈正相关，通过实时监测荧光信号可以实现对靶标序列的定量或定性检测。标准对PCR反应体系进行了明确规定，包括引物和探针的使用浓度（通常为200～900nmol/L范围）、dNTP浓度、Mg²⁺浓度、TaqDNA聚合酶用量等关键参数。同时，标准建议在反应体系中设置内部扩增对照（InternalAmplificationControl,IAC），以监测可能存在的PCR抑制因素。热循环条件方面，标准推荐采用两步法或三步法PCR程序，退火/延伸温度通常设定在60℃左右，循环数一般为45个循环，具体的温度和时间参数以标准正文中给出的验证条件为准。4.3方法性能验证根据标准中报告的性能验证数据，该方法的检出限（LOD）可达到0.1%以下（以转基因质量分数计）或更低拷贝数水平（以DNA拷贝数计）。方法的扩增效率在90%～110%之间，决定系数（R²）不低于0.98。在特异性方面，通过对多种非转基因植物物种（包括玉米、大豆、水稻、棉花、油菜等的非转基因品种）DNA的测试，未观察到非特异性扩增；对含有其他类型外源基因（如EPSPS、PAT、bar等）的转基因材料进行交叉反应测试，未发现交叉反应现象。实验室间验证结果表明，该方法的重复性（RSDr）和再现性（RSDR）均满足国际公认的接受标准。五、与现行标准体系的关系及协调性ISO/TS21569-6:2026的发布与实施，进一步完善了ISO21569系列标准体系。该标准与ISO/TS21569-1:2022（通用要求）构成“通用+专项”的配套关系，使用者需同时遵循通用标准中关于实验室操作规范、质量控制要求和结果报告的规定，以及本专项标准中关于具体靶标检测的技术参数要求。在国际层面，本标准与食品法典委员会（CAC）通过的相关指导文件保持一致。在国内层面，我国已发布多项涉及转基因检测的国家标准（GB/T）和行业标准（SN/T），如GB/T19495系列（转基因产品检测）等，本国际标准中规定的cry1Ab/Ac筛选方法与我国现行标准中同类方法在原理上一致、在性能上互补，为促进我国转基因检测标准与国际标准的对接提供了技术基础。此外，本标准与欧洲标准化委员会（CEN）相关标准在方法原理上保持技术协调，在规范性引用文件方面注重与ISO21569系列其他部分及ISO24276（核酸提取）等标准的衔接。这种协调性安排为全球各实验室在不改变现有操作规程的前提下采用本标准提供了便利。六、主要起草单位简介ISO/TS21569-6:2026标准的制定汇聚了全球多个国家和地区的标准化专家力量。其中，中国检验检疫科学研究院（ChineseAcademyofInspectionandQuarantine,CAIQ）作为该标准的重要参与研制单位，在标准的技术方案设计和国际协同验证中发挥了关键作用。中国检验检疫科学研究院是国家市场监督管理总局直属的公益性中央级科研机构，长期从事检验检测检疫科学技术研究，是我国食品农产品质量安全检测领域的权威科研机构。该院下设的食品安全研究所建有国家市场监管重点实验室（转基因产品检测与评价），在转基因生物检测领域拥有超过二十年的研究积累，先后主持和参与制修订了多项转基因检测相关的国家标准和行业标准。在ISO/TC34/S