热考微练18PCR技术的原理与应用

热考微练18PCR技术的原理与应用(分值：35分)授课提示：对应课后定时检测案149页选择题每题3分。1．(2026·东北三省高三模拟卷)中国科学家领衔的国际团队发现，驯鹿能适应极昼和极夜的环境而不会出现睡眠紊乱，原因是节律调控有关基因PER2发生突变。利用PCR技术可获取和扩增PER2基因，下列有关说法错误的是()A．研究该基因的表达及功能可为治疗失眠提供方案B．PCR反应每次循环一般可以分为变性、复性和延伸三步C．DNA聚合酶能够从引物的5′端开始连接脱氧核苷酸D．一般采用琼脂糖凝胶电泳技术来鉴定PCR的产物解析：题意显示，驯鹿能适应极昼和极夜的环境而不会出现睡眠紊乱的原因是节律调控有关基因PER2发生突变，因此研究该基因的表达及功能可为治疗失眠提供方案，A正确；PCR反应过程中的每一轮循环依次包括变性(高温解旋)、复性(引物结合)、延伸(子链延伸)三步，B正确；DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸，C错误；一般采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物，按相对分子质量大小分离DNA，D正确。答案：C2．(2026·广东汕头高三一模卷)巢式PCR是一种扩增目的基因的方法。其原理为先以比目的基因大的DNA片段为模板，用外引物(F1，R1)进行扩增，获得大量含目的基因的中间产物，再以扩增后的中间产物为模板，用内引物(F2，R2)扩增目的基因，如图所示。下列说法错误的是()A.两对引物的碱基序列不相同，但均应为单链DNA片段B．第二轮PCR反应能否进行，是对第一轮PCR反应正确性的鉴定C．由于和两套引物都互补的靶序列较少，该技术可大大提高扩增的特异性D．如果两套引物一起加入反应体系中，外引物的复性温度应显著低于内引物解析：两对引物的碱基序列不相同，但均应为单链DNA片段，以便与模板互补配对，A正确；第二轮PCR使用内侧引物以第一轮PCR产物为模板进行再次扩增，第二轮PCR反应能否进行，是对第一轮PCR反应正确性的鉴定，B正确；由于和两套引物同时都互补的靶序列较少，该技术可大大提高扩增的特异性，将需要的目的基因扩增出来，C正确；如果两套引物一起加入反应体系中，外引物复性温度要明显高于内引物，使外引物先进行反应，D错误。答案：D3．(14分)(2026·黑龙江哈尔滨一模卷)金黄色葡萄球菌(简称Sa)可能引发从轻微皮肤感染到严重的全身感染，尤其对免疫力低下者危害更大。预防感染的关键在于良好的卫生习惯和合理使用抗生素。但不规范使用抗生素易出现抗药性Sa。推测Sa产生头孢霉素抗性与其R基因有关。为验证该推测，以下图中R基因的上、下游片段及质粒1共同构建质粒2，然后通过同源重组(质粒2中的上、下游片段分别与Sa基因组中R基因上、下游片段配对，并发生交换)敲除Sa的R基因。(1)操作步骤如下：①根据图甲信息，质粒2的构建过程中用引物________(填数字)进行PCR扩增，每次循环一般可以分为________________________三步，n次循环后可以得到等长的目的基因________个。然后选择限制酶______________对扩增产物进行酶切，然后回收上、下游片段，再与SacⅡ酶切质粒1所得大片段连接，获得质粒2。②用质粒2转化临床分离的具有头孢霉素抗性、对氯霉素敏感的Sa，然后涂布在含氯霉素的平板上，经培养获得含质粒2的Sa单菌落。③将步骤②获得的单菌落多次传代以增加同源重组敲除R基因的概率，随后稀释涂布在含________的平板上，筛选并获得不再含有质粒2的菌落。从这些菌落中分别挑取少许菌体，依次接种到含________的平板上，若无法增殖，则对应菌落中细菌的R基因可能被敲除。(2)以③获得的菌株基因组为模板，采用不同引物组合进行PCR扩增，产物一般通过________________(技术名称)来鉴定。检测结果如图乙所示，表明R基因已被敲除的是________。解析：(1)①由图甲可知，质粒2上依次接有SacⅡ、EcoRⅠ、SacⅡ三个酶切位点，而质粒1上只有SacⅡ酶切位点，R基因的上下游依次含有SacⅡ、EcoRⅠ、EcoRⅠ、SacⅡ酶切位点，若要构建质粒2，可以采用引物1和4进行PCR扩增可得到整个R基因。PCR反应过程是：变性→复性→延伸，n次循环后可以得到等长的目的基因(2n－2n)个。用SacⅡ和EcoRⅠ对PCR产物进行酶切，然后回收上、下游片段，再与SacⅡ酶切质粒1所得大片段连接，获得质粒2。②用质粒2转化临床分离的具有头孢霉素抗性、对氯霉素敏感的Sa，因为重组的质粒2上含有氯霉素抗性基因，所以可以将重组后的含质粒2的菌落涂布在含氯霉素的平板上，能生存下来的菌落就是含质粒2的Sa单菌落。③为验证该推测需要敲除R基因，因为质粒2上含有Y可被脱水四环素诱导表达的Sa致死基因，所以将步骤②获得的单菌落多次传代以增加同源重组敲除R基因的几率，随后稀释涂布在含脱水四环素的平板上，可诱导R基因死亡，推测Sa产生头孢霉素抗性与其R基因有关，因此可从这些菌落中分别挑取少许菌体，依次接种到含头孢霉素的平板上，若无法增殖，则对应菌落中细菌的R基因疑似被敲除。(2)以③获得的菌株基因组为模板，采用不同引物组合进行PCR扩增，产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。由图甲可知，上游片段长度为0.7kb，R基因长度为2.2kb，下游片段长度为1.2kb，步骤③获得的菌株若R基因已被敲除，用引物1和4进行PCR扩增时，获得的目的基因为上游片段＋下游片段，长度为0.7＋1.2＝1.9(kb)，D正确。答案：(1)①1、4变性、复性、延伸2n－2nSacⅡ和EcoRⅠ③脱水四环素头孢霉素(2)琼脂糖凝胶电泳D4．(15分)(2026·福建龙岩一模卷)科研人员采用重叠延伸PCR技术，成功构建了突变的IKBA基因(以下称IKBAm)，使IKBA蛋白中第32、36位氨基酸由丝氨酸突变为丙氨酸，阻断了IKBA蛋白的磷酸化，IKBA蛋白磷酸化与哺乳动物组织中广泛存在的某种转录因子的功能有关。该技术采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来，获得定点突变的新基因，原理如图，回答下列问题：(1)利用重叠延伸PCR技术诱变IKBA基因时，将预期的突变碱基设计在PCR的引物3和引物4中，分别进行PCR体系1和PCR体系2的扩增。PCR体系1中加入的引物是________。PCR体系1和PCR体系2必须分开进行的原因是______________________________________________________________。(2)将PCR体系1、2的产物(图中a、b和c、d)混合后，继续进行下一次PCR反应。在该PCR反应体系中经过高温变性后，当温度下降到55℃，能够互补配对的DNA链相互结合，理论上有________种结合的可能，其中能进行进一步延伸的是________组合的DNA片段。(3)质粒A上有限制酶BamHⅠ、EcoRⅠ的识别序列，为将IKBAm与质粒A正确连接，在设计IKBAm的扩增引物时，需在引物________的5′端分别添加相应的限制酶的识别序列。下表为重叠延伸PCR引物序列表，引物3的①位置上有关的碱基序列是________(填写出6个碱基)。(4)已知IKBA基因的部分序列为：数字94、95、96、106表示碱基位置，丙氨酸的密码子：GCU、GCC、GCA、GCG，则突变引物4中省略的碱基是________(填序号)。①AGC、GGC、CTG、GAC、GCC②UCG、GGC、CTG、GAC、ACC③GCC、GGC、CTG、GAC、GCC④TCG、CCG、GAC、CTG、AGG解析：(1)为了获得定点突变的新基因，采用PCR扩增时需要改变引物的部分碱基，引物是与目的基因复制起始端互补配对的单链DNA，结合题图和题干信息分析，PCR体系1需要引物1和引物3，PCR体系2需要引物2和引物4。引物3和DNA一条链互补配对，引物4和DNA对应部位的另一条链互补配对，即引物3和引物4碱基互补配对，若PCR体系1和PCR体系2混合进行，两种引物结合形成双链，引物失效则无法高效地进行PCR扩增，因此必须分开进行扩增。(2)由于引物3和引物4碱基序列互补配对，PCR扩增产物经过高温变性后会形成a、b、c、d四种单链，当温度下降到55℃，能够互补配对的DNA链相互结合，a和b结合，a和d结合，b和c结合，c和d结合，共4种结合方式。a和b结合以及c和d结合没有突出的单链部分，不能延伸，b和c结合有突出的单链部分，但是DNA延伸方向必须是从自身的5′→3′，b和c结合也不能延伸，能进行进一步延伸的是a和d组合的DNA片段。(3)由于引物3和引物4是和目的基因的中间碱基序列互补配对的，要将目的基因和质粒连接形成重组的DNA分子，则需要在目的基因的两端增加限制酶识别序列，因此需要在引物1和2的5′端分别添加相应的限制酶的识别序列。由于引物3和4是碱基互补配对的，引物4的3′端前6个碱基是AGCAGA，则引物3的①位置上有关的碱基序列是TCGTCT。(4)结合引物4的已知序列和IKBA基因的部分序列可知，引物4的碱基序列和题图中的IKBA基因的单链部分序列基本相同(除突变位点外)，已知第32位氨基酸需要是丙氨酸，根据丙氨酸对应的密码子分析，94、95、96对应的碱基是GCC，9