核酸序列及数据分析

本章内容第一节核酸数据的获取第二节序列比对第三节序列特征分析1实验生物学生物信息学理论生物学23基因组学核酸6核酸脱氧核糖核酸（DNA）核糖核酸（RNA）

功能：是细胞内携带遗传信息的物质，在生物体的遗传、变异和蛋白质的生物合成中具有极其重要的作用。核酸：遗传信息携带着7真核生物:DNARNA原核生物:DNARNA大多数病毒:DNA极少数病毒:RNA遗传物质是DNA遗传物质是RNA细胞生物非细胞生物HIV、SARS病毒、流感病毒、烟草花叶病毒、车前草病毒等8《Biology》NeilCampbell，Version4，19969核酸组成10DNARNA碱基腺嘌呤(adennine,A)鸟嘌呤(guanine,G)胞嘧啶(cytosine,C)胸腺嘧啶(thymine,T)腺嘌呤鸟嘌呤胞嘧啶尿嘧啶(Uracil,U)戊糖脱氧核糖核糖磷酸磷酸磷酸核苷酸的基本组成单位1112基因不同核酸序列A,G,C,T不同13第一节核酸数据的获取14实验手段获取核酸序列

Sanger双脱氧末端终止法（1977）

PCR技术（1985）

DNA自动测序仪的发展（ABI,1995）

生物信息学分析软硬件设施15大规模基因组测序的两种策略逐步克隆法--基于BAC的方法（ClonebyClone）

先把基因组打碎成200－300kb的片段并制成BAC文库，再选择一些BAC进一步打碎成3kb左右的小片段，测序并拼接(BAC克隆的覆盖率不应低于3倍)，。全基因组霰弹法-鸟枪法（WholeGenomeShot-gun)

把基因组直接打碎成3kb左右的小片段，测序并拼接。16已形成了一条世界第六、亚洲最大的基因组测序技术平台，共有MegaBACE测序仪104台，ABI3730测序仪2台，ABI377测序仪11台，满负荷运转日产可达50Mb，是一个低投入、高产出，高度自动化的测序平台。中国基因组测序情况17我国测序能力的“三级跳”人类基因组计划1%项目的finishing(1999年)中-丹合作的家猪基因组计划(2000年)水稻工作框架图的绘制和公布(2001年)标志着我国已掌握了国际先进的测序技术，具有相当的测序能力。测序能力和质量已达到国际一流水平,以独立承担大规模的基因组测序项目我国已经成为继美国之后世界上第二个具有独立完成大规模的全基因组测序和组装分析能力的国家18通过生物信息学手段获取核酸序列19三大核酸序列数据库GenBank（NCBI）EMBLDDBJ

20特殊类型核酸序列数据库：非编码RNA数据库（ncRNA）；表达序列标签数据库（dbEST）；序列标签位点数据库（dbSTS）；miRBase；tRNAdb等。21基因组相关数据库：人类基因组数据库（HGD）；基因组序列数据库（GSDB）；基因组在线数据库（GOLD）等。22基因表达数据库：基因表达库（GEO）；斯坦福微阵列数据库（SMD）；ArrayExpress；CGED；GXD；BodyMap等。23人类基因突变及疾病相关数据库：人类基因变异数据库（HMGD）、人类遗传双等位基因序列数据库（HGBASE）、人类孟德尔遗传在线（OMIM）、国际单体型计划（HapMap）、人类单核苷酸多态性数据库（dbSNP）、肿瘤基因数据库（TGDB）、疾病关联数据库（GAD）、癌症基因数据库（CGAP）、人类表观遗传数据库（HEP）、人类DNA甲基化与癌症数据库（MethylCancer）等。24以NCBI数据库为例学习如何获取核酸序列及序列相关信息//genbank/NCBIGenBank25什么时候需要利用生物信息学获取序列信息●基因克隆（PCR，RACE）

●表达检测（RT-qPCR，RT-PCR）●基因表达调控（基因过表达或沉默表达）●原核表达蛋白●序列同源性分析?26CCL212728293031CCL2132当前可查103条基因组相关基因99条可查看SNP11条基因定义染色体定位基因组参考序列号选择物种33343536373839…………4041…………42基因基本信息的总结43基因基本信息的总结基因与染色体、基因组相关信息44基因相关参考文献基因功能相关参考文献45表型变异和艾滋病相关46相关通路和其他基因的互做47基因基本信息同源性基因本体注释（GO分类）48GeneOntology（GO分类）GeneOntology包含了基因参与的生物过程，所处的细胞位置，发挥的分子功能三方面功能信息，并将概念粗细不同的功能概念组织成DAG（有向无环图）的结构。GeneOntology是一个使用有控制的词汇表和严格定义的概念关系，以有向无环图的形式统一表示各物种的基因功能分类体系，从而较全面地概括了基因的功能信息。在基因表达谱分析中，GO常用于提供基因功能分类标签和基因功能研究的背景知识。利用GO的知识体系和结构特点，旨在发掘与基因差异表达现象关联的单个特征基因功能类或多个特征功能类的组合。

4950基因编码蛋白的基本信息51参考序列信息mRNA和编码蛋白序列信息基因组相关序列信息5253CCL21核酸序列CCL21mRNA登录号CCL21编码蛋白CCL21登录号54什么是登录号（accessionnumber）?Anaccessionnumberislabelthatusedtoidentifyasequence.Itisastringoflettersand/ornumbersthatcorrespondstoamolecularsequence.ExamplesX02775 GenBankgenomicDNAsequenceNT_030059 GenomiccontigRs7079946 dbSNP(singlenucleotidepolymorphism)N91759.1 Anexpressedsequencetag(1of170)NM_006744 RefSeqDNAsequence(fromatranscript)NP_007635 RefSeqproteinAAC02945 GenBankproteinQ28369 SwissProtprotein1KT7 ProteinDataBankstructurerecordproteinDNARNA55NCBI’simportantRefSeqproject:bestrepresentativesequencesRefSeq(accessibleviathemainpageofNCBI)providesanexpertlycuratedaccessionnumberthatcorrespondstothemoststable,agreed-upon“reference”versionofasequence.RefSeqidentifiersincludethefollowingformats:Completegenome NC_######Completechromosome NC_######Genomiccontig NT_######mRNA(DNAformat) NM_######e.g.NM_006744Protein NP_######e.g.NP_00673556CCL21核酸序列CCL21mRNA登录号CCL21编码蛋白CCL21登录号57………基因序列信息基因相关信息58Genbank

格式注解59LOCUS条目名称（标识符）DEFINITION序列的定义，说明ACCESSION序列编号，具有唯一性和永久性VERSION版本KEYWORDS由序列提交者提供，包括序列的基因产物及相关信息SOURSE序列来源，说明序列的来源物种，来源组织等REFERENCE和序列相关的文献，包括题目，作者等信息FEATURES具有特定格式，包含大量的信息和内容，用来详细描述序列特性及相关内容BASECOUNT碱基组成ORIGIN碱基序列，并以//作为序列条目结束的标记序列文件的主要结构：6061FEATURES具有特定格式，包含大量的信息和内容，用来详细描述序列特性及相关内容62GenBank记录中特性表中的主要关键词:关键词解释关键词解释misc_feature生物学特性无法用特性表关键词描述的序列promoter转录起始区misc_difference序列特性无法用特性表关键词描述的序列CAAT_signal真核启动子上游的CAAT盒,与RNA结合相关conflict同一序列在不同研究中在位点或区域上有差异TATA_signal真核启动子的TATA盒unsure序列不能确定的区域-35_signal原核启动子中的-35框old_sequence该序列对以前的版本做过修订-10_signal原核启动子的Pribow盒variation包含稳定突变的序列GC_signal真核启动子的GC盒modified_base修饰过的核苷酸RBS核糖体结合位点gene已识别为基因或已命名的序列区域polyA_signalRNA转录本的剪切识别位点misc_signal无法用信号特性关键词描述的信号序列enhancer增强子63关键词解释关键词解释attenuator与转录终止有关的序列CDS蛋白质编码序列terminator转录终止序列sig_peptide编码信号肽的序列rep_origin双链DNA复制起始区transit_peptide转运蛋白编码序列misc_RNA无法用RNA关键词描述的转录物或RNA产物mat_peptide编码成熟肽的序列prim_transcript初始转录本intron内含子precursor_RNA前体RNApolyA_siteRNA转录本的多聚腺苷酸化位点mRNA信使RNArRNA核糖体RNA5’clip前体转录本中被剪切掉的5’端序列tRNA转运RNA3’clip前体转录本中被剪切掉的3’端序列scRNA小细胞质RNA5’UTR5’非翻译区snRNA小核RNA3’UTRexon3’非翻译区外显子snoRNA加工和修饰rRNA的小核RNA64关键词解释关键词解释immunoglobulin_relatedrepeat_unit单个的重复元件C_region免疫相关蛋白上的不变区LTR长末端重复序列D_segment免疫球蛋白重链的可变区，T细胞受体β链Satellite卫星重复序列J_segment免疫球蛋白重链、轻链以及T细胞α、β、γ的结合链misc_binding无法描述的核酸序列结合位点N_region插入重排免疫球蛋白片段间的核苷酸primer_bind复制、转录的引物结合位点S_region免疫球蛋白重链的开关区protein_bind蛋白质结合区V_region编码免疫球蛋白的可变区N末端的序列STS测序标签位点V_segment编码免疫球蛋白的可变区的序列misc_recomb无法用重组特性关键词描述的重组事件repeat_region基因组中所包含的重复序列iDNA通过重组所消除的DNA65关键词解释关键词解释misc_structure无法用结构关键词描述的核酸序列高级结构或构型stem_loop发夹结构D_loop线粒体中DNA中的取代环GenBank记录中特性表中的限定词:限定词含义限定词含义/allele=给定基因的等位基因/codon_start=相对于序列第一个碱基，编码序列密码子的偏移量/bound_moiety=嵌合范围/country=DNA样本的来源国/cell_type=获得序列的细胞类型/db_xref=其他数据库信息的交叉索引号/citation=已被引用的参考文献数/direction=DNA复制方向/clone_lib=获得序列的克隆文库/environmental_sample=序列直接从环境材料中获得而没有指明来源物种66限定词含义限定词含义/exception=指明DNA序列未按通常的生物学规律翻译，如RNA编辑/PCR_conditi-ons=描述PCR的反应条件/frequency=在种群中发生变异的频率/pop_variant=获得序列的群体变异种名称/germline如果序列是DNA并来源于免疫球蛋白家族，则表示该序列来源于未重排DNA/product=序列编码产物的名称/insertion_seq=序列来源于某种插入元件/anticodon=tRNA反义密码子的位置及它所编码的氨基酸/isolate=序列来源的生物个体/cell_line=获得序列的细胞系/lab_host=为扩增序列来源物种所用的实验室宿主/chromosome=获得序列的染色体/macronuclear指明DNA来源于染色体分化的大核期/clone=获得序列的克隆子/note=评论及附加信息/codon=指出与参考密码子不同的密码子/organelle=获得序列的细胞器/EC_number=序列产物的酶学编号67限定词含义限定词含义/cons_splice=区分内含子剪切位点和“5‘-GT.AG-3'”剪切位点/map=相关特性在基因图谱上的位置/cultivar=所获序列植物的栽培变种/mod_base=被修饰碱基的简写/dev_stage=序列来源于某种生物的特定发育阶段/number=从5’→3’注明遗传元件的顺序/evidence=序列特性来源于实验还是推理/organism=提供测序用遗传物质的物种的科学名称/focus指出在记录中的来源特性在其他物种中还有不同的来源特性/phenotype=序列特性所导致的表型/function=序列所代表的功能/plasmid=获得序列的质粒名称/haplotype=序列来源于某种物种的单倍体/protein_id=蛋白质的检索号/isolation_sou-rce=描述序列来源物种的生理、环境和地理信息/proviral整合在基因组中的前病毒/label=序列特性的俗名/rearranged如果序列是DNA并来源于免疫球蛋白家族，则表示该序列来源于重排DNA68限定词含义限定词含义/rpt_family=重复序列/transposon=转座子/rpt_unit=指明重复区域的重复元件构成/variety=获得序列的生物变种/serotype=同一物种的不同血清学特征/pseudo假基因/sex=获得序列的物种性别/replace=表明特性间的间隔序列已被替换/specimen_vou-cher=指明来源物种保存于什么地方/rpt_type=重复序列的组织方式/strain=获得序列的菌珠/sequenced_m-ol=获得序列的分子类型/sub_species=获得序列的来源物种的亚种/serovar=同一原核生物的血清学特征/tissue_lib=获得序列组织库/specific_host=获得序列的天然宿主/transgenic指明物种的来源特性是否是转基因受体/standard-name=特性的通用名称/transl_except=标明序列中未按指定密码子表翻译的氨基酸的位置/sub_clone=获得序列的亚克隆69限定词含义限定词含义/sub_strain=获得序列的来源微生物亚种/tissue_type=获得序列组织类型/translation=按通用或指定的密码子表翻译的氨基酸序列/transl_table=描述在翻译中与通用密码表不同的密码表/usedin=表明该特性在其他检索中也被使用/virion病毒颗粒7071FASTA格式FASTA格式第一行是描述行，第一个字符必须是“>”字符。随后的行是序列本身，每行序列不超过80个字符。序列由标准的IUB/IUPAC氨基酸和核酸代码代表。>ref|NC_000016.8|NC_000016:76691052-77024150Homosapienschromosome16,referenceassemblyGCAGTGCGCAGGCGTGAGCGGTCGGGCCCCGACGCGCGCGGGTCTCGTTTGGAGCGGGAGTGAGTTCCTGAGCGAGTGGACCCGGCAGCGGGCGATAGGGGGGCCAGGTGCCTCCACAGTCAGCCATGGCAGCGCTGCGCTACGCGGGGCTGGACGACACGGACAGTGAGGACGAGCTGCCTCCGGGCTGGGAGGAGAGAACCACCAAGG7273成功提取CCL21mRNA全长序列7475编码序列76成功提取CCL21mRNA编码序列77第二节序列比对78什么时候需要进行序列比对●已知某基因的部分核酸序列

●已知某基因编码的蛋白序列获取基因的全长序列（包括5‘端和3’端非编码序列的获得）●已知某基因的cDNA序列●已知某基因的同源序列和相似序列（两个序列以上）序列同源性相似性分析，保守序列的分析，及聚类分析的需要等●克隆序列测序后的验证确认序列的准确性已有一个或多个已知或未知序列?79序列比较

序列比较的一个基本操作就是比对（Alignment），即将两个序列的各个字符（代表核苷酸或者氨基酸残基）按照对应等同或者置换关系进行对比排列，其结果是两个序列共有的排列顺序，这是序列相似程度的一种定性描述多重序列比对研究的是多个序列的共性。序列的多重比对可用来搜索基因组序列的功能区域，也可用于研究一组蛋白质之间的进化关系。

80相似性(similarity)：

是指一种很直接的数量关系，比如部分相同或相似的百分比或其它一些合适的度量。比如说，A序列和B序列的相似性是80％，或者4/5。这是个量化的关系。当然可进行自身局部比较。序列的相似性81同源性(homology)：指从一些数据中推断出的两个基因或蛋白质序列具而共同祖先的结论，属于质的判断。就是说A和B的关系上，只有是同源序列，或者非同源序列两种关系。而说A和B的同源性为80％都是不科学的。生物序列的同源性82相似性和同源性关系序列的相似性和序列的同源性有一定的关系，一般来说序列间的相似性越高的话，它们是同源序列的可能性就更高，所以经常可以通过序列的相似性来推测序列是否同源。正因为存在这样的关系，很多时候对序列的相似性和同源性就没有做很明显的区分，造成经常等价混用两个名词。所以有出现A序列和B序列的同源性为80％一说。83数据库的搜索在分子生物学研究中，对于新测定的碱基序列或由此翻译得到的氨基酸序列，需要通过数据库搜索，找出具有一定相似性的同源序列，以推测该未知序列可能属于哪个基因家族，具有哪些生物学功能。对于氨基酸序列来说，有可能找到已知三维结构的同源蛋白质而推测其可能的空间结构。因此，数据库搜索与数据库查询一样，是生物信息学研究中的一个重要工具.84序列比对搜索和双序列比对85NCBI主站点：

/BLAST/

对一般用户来说，目前常用的办法是通过NCBI国际著名生物信息中心的BLAST服务器进行搜索。序列比对神器-BLAST86BLAST简介

BLAST是由美国国立生物技术信息中心（NCBI）开发的一个基于序列相似性的数据库搜索程序。

BLAST是“局部相似性基本查询工具”(BasicLocalAlignmentSearchTool)的缩写。87BLAST简介Blast是一个序列相似性搜索的程序包，其中包含了很多个独立的程序，这些程序是根据查询的对象和数据库的不同来定义的。比如说查询的序列为核酸，查询数据库亦为核酸序列数据库，那么就应该选择blastn程序。88NCBIBLAST8990主要的BLAST程序程序名查询序列数据库搜索方法Blastn核酸核酸核酸序列搜索逐一核酸数据库中的序列Blastp蛋白质蛋白质蛋白质序列搜索逐一蛋白质数据库中的序列Blastx核酸蛋白质核酸序列6框翻译成蛋白质序列后和蛋白质数据库中的序列逐一搜索。Tblastn蛋白质核酸蛋白质序列和核酸数据库中的核酸序列6框翻译后的蛋白质序列逐一比对。TBlastx核酸核酸核酸序列6框翻译成蛋白质序列，再和核酸数据库中的核酸序列6框翻译成的蛋白质序列逐一进行比对。91数据库简述nrmonthdbestdbstshtgsyeastE.colipdbkabatvectormitoalugss非冗余的GenBank＋EMBL＋DDBJ＋PDB序列，除了EST、STS、GSS和0,1,2阶段的HTGS序列nr中过去30天的最新序列非冗余的Genbank＋EMBL＋DDBJ＋PDB的EST部分非冗余的Genbank＋EMBL＋DDBJ＋PDB的STS部分0,1,2阶段的高产量基因组序列(3阶段完成的HTG序列在nr库里)酵母的全基因组序列大肠杆菌的全基因组序列由三维结构库来的核酸序列Kabat的免疫学相关序列库Genbank的载体子集线粒体核酸序列REPBASE中Alu重复序列翻译而来，用来遮蔽查询序列中的重复片段，基因组勘测序列(GenomeSurveySequence)BLAST的核酸数据库92NCBIBLAST9394BLAST搜索格式（1）FASTA格式FASTA格式第一行是描述行，第一个字符必须是“>”字符。随后的行是序列本身，每行序列不超过80个字符。序列由标准的IUB/IUPAC氨基酸和核酸代码代表。>ref|NC_000016.8|NC_000016:76691052-77024150Homosapienschromosome16,referenceassemblyGCAGTGCGCAGGCGTGAGCGGTCGGGCCCCGACGCGCGCGGGTCTCGTTTGGAGCGGGAGTGAGTTCCTGAGCGAGTGGACCCGGCAGCGGGCGATAGGGGGGCCAGGTGCCTCCACAGTCAGCCATGGCAGCGCTGCGCTACGCGGGGCTGGACGACACGGACAGTGAGGACGAGCTGCCTCCGGGCTGGGAGGAGAGAACCACCAAGG95BLAST搜索格式96GATGGGATTGGGGTTTTCCCCTCCCATGTGCTCAAGACTGGCGCTAAAAGTTTTGAGCTTCTCAAAAGTCTAGAGCCACCGTCCAGGGAGCAGGTAGCTGCTGGGCTCCGGGGACACTTTGCGTTCGGGCTGGGAGCGTG97结果页面98结果页面99结果页面100结果页面101结果页面102BLAST程序评价序列相似性的两个数据Score：使用打分矩阵对匹配的片段进行打分，这是对各对氨基酸残基（或碱基）打分求和的结果，一般来说，匹配片段越长、Score值越大，则相似性越高。Evalue:在相同长度的情况下，两个氨基酸残基（或碱基）随机排列的序列进行打分，得到上述Score值的概率的大小。E值越接近零，越不可能找到其它的匹配序列，其背后的含义就是E值越小，则匹配度越好。103E值(E-Value)P值(P-Value)

BLAST程序中使用了E值而非P值，这主要是从直观和便于理解的角度考虑。比如E值等于5和10，比P值等于0.993和0.99995更直观。但是当E<0.01时，P值与E值接近相同AND104105106GATGGGATTGGGGgTTTTCCCCTCCCATGTGCTCAAGAgCTGGCGCTAAAAGTTTTGAGCTTCTCAAAAGTCTAGAGCCACCGTCCAGGGAGCAGGTAGCTGCTGGGCTCCGGGGACACTTTGCGTTCGGGCTGGGAGCGTGGATGGGATTGGGGTTTTCCCaCTCCCATGTGCTCAAGACTGGCGCTAAAAGTTTTGAGCTTCTCAAAAGTCTAGAGCCACCGTCCAGGGAGCAGtGTAGCTGCTGGGCTCCGGGcGACACTTTGCGTTCGGGCTGGGAGCGTG107108多序列比对109多重序列比对网站及常用软件Clustal:MultipleSequenceAlignment

（/）KEGGGENESDatabase

（http://www.genome.jp/kegg/genes.html）DNAManDNAStar110/111112GCG,FASTA,EMBL,PIR,NBRF,UniProtKB/Swiss-Prot>111AATTCCGG>222CCGGAATT>333GGCCTTAA113114115116117118第三节序列特征分析119什么是基因？基因是遗传信息的物理和功能单位，包含产生一条多肽链或功能RNA所必需的全部核苷酸序列。－碱基成对出现:ATCGGCCTAGCCGG120基因基因组

任何一条染色体上都带有许多基因，一条高等生物的染色体上可能带有成千上万个基因，一个细胞中的全部基因序列及其间隔序列统称为genomes（基因组）。基因组有两层意义：遗传物质和遗传信息。要揭开生命的奥秘，就需要从整体水平研究基因的存在、基因的结构与功能、基因之间的相互关系。121碱基+脱氧核糖+磷酸脱氧核苷酸DNA染色体A,T,C,G构成形成双链蛋白质+基因基因就是位于DNA上的有效遗传效应的片段基因1+基因2+基因3+--122基因是一种相对独立的遗传信息单位，这些信息单位可以通过各种方式在生物个体之间进行重新组合，并向后代传递；基因是一段DNA分子，遗传信息贮存在DNA序列之中；基因的信息内容通过相应的形式表现出来，即指导合成蛋白质或RNA，进而产生生理功能，或影响其他基因的表达。

基因具有几个重要的特征123中心法则（TheCentralDogma）

基因表达中的信息流124基因功能区域基因按其功能可分为结构基因和调控基因：结构基因可被转录形成mRNA，并进而转译成多肽链；调控基因是指某些可调节控制结构基因表达的基因。在DNA链上，由蛋白质合成的起始密码开始，到终止密码子为止的一个连续编码序列称为一个开放阅读框(OpenReadingFrame,ORF)。结构基因多含有插入序列，除了细菌和病毒的DNA中ORF是连续的，包括人类在内的真核生物的大部分结构基因为断裂基因，即其编码序列在DNA分子上是不连续的，或被插入序列隔开。断裂基因被转录成前体mRNA，经过剪切过程，切除其中非编码序列(即内含子)，再将编码序列(即外显子)连接形成成熟mRNA，并翻译成蛋白质。125基因的不连续性Intron和Exon:大多数真核生物蛋白质基因的编码顺序(Exon)都被或长或短的非编码顺序(Intron)隔开126真核生物基因结构：

一个完整的真核生物基因，不但包括编码区域，还包括5'端和3'端两侧长度不等的特异性序列，虽然这些序列不编码氨基酸，却在基因表达的过程中起着重要的作用。所以，严格的“基因”这一术语的分子生物学定义是：产生一条多肽链或功能RNA所必须的全部核苷酸序列。127基因序列特征分析主要内容一、开放阅读框二、CpG岛——CpGislands三、转录终止信号四、启动子—promoters五、密码子偏好性

128一、开放阅读框

ORF—openreadingframe

开放阅读框指的是从5'端开始翻译起始密码子（ATG）到终止密码子（TTA、TAG、TGA）的蛋白质编码碱基序列。1291.1遮蔽重复序列

在进行任何真核生物序列的基因分析之前,最好把重复序列找出来并从序列中除去。1301.2根据开放读码框预测基因A起始密码子ATG第一个ATG的确定则依据Kozak规则;Kozak规则是基于已知数据的统计结果，所谓Kozak规则，即第一个ATG侧翼序列的碱基分布所满足的统计规律.131若将第一个ATG中的碱基A，T，G分别标为1,2,3位，则Kozak规则可描述如下：(1)第4位的偏好碱基为G；(2)ATG的5’端约15bp范围的侧翼序列内不含碱基T；(3)在-3，-6和-9位置，G是偏好碱基；(4)除-3，-6和-9位，在整个侧翼序列区，C是偏好碱基。132B终止密码子

终止密码子:TAA,TAG,TGAGC%=50%终止密码子每64bp出现一次；

GC%>50%终止密码子每100－200bp出现一次；由于多数基因ORF均多于50个密码子，因此最可能的选择应该是ORF不少于100个密码子。133C3’端的确认

3’端的确认主要根据Poly(A)尾序列,若测试Contig不含Poly(A)序列，则根据加尾信号序列“AATAAA”和BLAST同源性比较结果共同判断。134开放读码框常用软件ORFfinder：(/gorf/orfig.cgi)GENSCAN：美国麻省理工学院开发的人类（或脊椎动物）基因预测软件。http：//genes.M/GENSCAN.htmlExPASyTranslatetool：/translate/135136137138Homosapienschemokine(C-Cmotif)ligand21(CCL21),mRNANCBIReferenceSequence:NM_002989.3ACATAAATAGCAGGCCAATCCCAGCCCACGCACAGACCCCCAACTTGCAGCTGCCCACCTCACCCTCAGCTCTGGCCTCTTACTCACCCTCTACCACAGACATGGCTCAGTCACTGGCTCTGAGCCTCCTTATCCTGGTTCTGGCCTTTGGCATCCCCAGGACCCAAGGCAGTGATGGAGGGGCTCAGGACTGTTGCCTCAAGTACAGCCAAAGGAAGATTCCCGCCAAGGTTGTCCGCAGCTACCGGAAGCAGGAACCAAGCTTAGGCTGCTCCATCCCAGCTATCCTGTTCTTGCCCCGCAAGCGCTCTCAGGCAGAGCTATGTGCAGACCCAAAGGAGCTCTGGGTGCAGCAGCTGATGCAGCATCTGGACAAGACACCATCCCCACAGAAACCAGCCCAGGGCTGCAGGAAGGACAGGGGGGCCTCCAAGACTGGCAAGAAAGGAAAGGGCTCCAAAGGCTGCAAGAGGACTGAGCGGTCACAGACCCCTAAAGGGCCATAGCCCAGTGAGCAGCCTGGAGCCCTGGAGACCCCACCAGCCTCACCAGCGCTTGAAGCCTGAACCCAAGATGCAAGAAGGAGGCTATGCTCAGGGGCCCTGGAGCAGCCACCCCATGCTGGCCTTGCCACACTCTTTCTCCTGCTTTAACCACCCCATCTGCATTCCCAGCTCTACCCTGCATGGCTGAGCTGCCCACAGCAGGCCAGGTCCAGAGAGACCGAGGAGGGAGAGTCTCCCAGGGAGCATGAGAGGAGGCAGCAGGACTGTCCCCTTGAAGGAGAATCATCAGGACCCTGGACCTGATACGGCTCCCCAGTACACCCCACCTCTTCCTTGTAAATATGATTTATACCTAACTGAATAAAAAGCTGTTCTGTCTTCCCACCCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA以CCL21的mRNA序列举例说明ORF识别139140141***142143ExPASy-Translatedtool144二、CpG岛——CpGislands

CpG岛是指DNA序列上的一个区域，此区域含有大量相联的胞嘧啶（C）、鸟嘌呤（G），以及使两者相连的磷酸酯键（p）。CpG岛的概念是Gardiner-garden和Fromner于1987年提出的，基因中平均每100Kb即可出现。CpG岛位于基因的启动子和第一个外显子区，约有60%~80%的人类基因的启动子和起始外显子含有CpG岛，其中GC含量大于50%，长度超过200bp。因此搜索CpG岛可以为基因及其启动子预测提供重要线索。145利用CpGPlot预测分析CpG岛CpGPlot是预测CpG岛的在线工具，它是由欧洲分子生物学实验室EMBL——EuropeanMolecularBiologyLaboratory提供的。其网址为：http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/cpgplot/index.html146CpGPlot在线操作页面147用CpGplot预测CpG岛的结果148三、转录终止信号

转录终止信号是在mRNA序列的3'端终止密码子下游位置上的加尾信号（tailingsignal）。前体mRNA3'端多聚腺苷酸化是真核细胞内mRNA转录后处理的三个最主要步骤之一，这三个步骤包括：5'帽子结构的形成、内含子的剪切及3'端的多聚腺苷酸化，因此，前体mRNA3'端多聚腺苷酸化与mRNA稳定性的调节、mRNA的细胞内转运、翻译的起始以及一些其他的细胞机制和疾病机制有着重要关系。149两个步骤：1.特异性的