CN119403444A 用于促进鱼类的性成熟的方法 （瑞吉诺水产研究所有限公司）

2024.11.14PCT/JP2023/0224712023.06.16WO2023/243725JA2023.12.21抑制鱼类的瘦素受体及瘦素中的至少一者的功自然界或常规养殖条件下相比能够大概率在1岁2回文重复/CRISPR相关蛋白9(CRISPR/Cas9)系统、CompoZr锌指核酸酶(ZFN)系统及转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)系统中的至少一3[0010]本发明的课题在于，为了获得与自然界或常规养殖条件下相比能够大概率在1岁[0013]项1.[0015]项2.[0017]项3.重复/CRISPR相关蛋白9(CRISPR/Cas9)系统、CompoZr锌指核酸酶(ZFN)系统及转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)系统中的至少一种基因[0019]项4.4[0021]项5.够表达该RNA分子的载体组成的组中的至少一[0023]项6.[0025]项7.[0027]项8.[0030]能够获得与自然界或常规养殖条件下相比能够大概率在1岁龄排卵或产卵、或者[0032]图2：图2的(A)示出雌性个体的瘦素受体基因缺损牙鲆的有无排卵、月龄5.1、[0033]图3示出雌性个体的瘦素受体基因缺损牙鲆的体重变化。图3的(A)示出观察到排箱鲀科(Ostraciidae：boxfishes)、鲷科(Sparidae：seabreamsandporgies)、鲑科(Salmonidae)、鲤科(Cyprinidae)、北美鲶总科(Ictaluroidea)、鲶科(Siluroidea)、Bagroidea、鮨科(Serranidae：seabasses)、慈鲷科(Cichlidae)、鳉鱼科(Oryziidae：鲈科(Latidae)、军曹鱼科(Rachycentridae)、舌鳎科(Cynoglossidae)、鳗鲡科[0038]上述牙鲆科的鱼类可包括例如牙鲆(TEMMINCKetSCHLEGEL)、属于斑鲆属5(Pseudorhombus)的牙鲆(重点斑鮃(Pseudorhombusdupliciocellatus)、少牙斑鲆(Pseudorhombusoligodon)、栉鳞斑鲆(Pseudorhombusctenosquamis)、大牙斑鲆(Pseudorhombusarsius)、五眼斑鲆(Pseudorhombuspentophthalmus)、桂皮斑鲆属(Tarphops)的牙鲆(大鳞鲆(Tarphopsoligolepis)等)、属于中间角鲆属(Asterorhombus)的牙鲆(中间角鲆(Asterorhombusintermedius))、属于双线鲽属(Lepidopsetta)的牙鲆(犘氏双线鲽(Lepidopsettamochigarei))、属于线鳍鲆属[0039]上述鲀科的鱼类可列举例如红鳍东方鲀(Takifugurubripes)、紫色东方鲀鲷属；黄牙鲷(连子鲷)(Dentextumifrons)等黄牙鲷属(Dentex)；大西洋鲷(Sparus[0042]上述鲑科的鱼类可包括例如麦奇钩吻鳟(Oncorhynchusmykiss)、大鳞鳟(Oncorhynchustshawytscha)、山女鳟(Oncorhynchusmasou)、石川马苏大马哈鱼(Oncorhynchusmasou)、斑点大麻哈鱼(Oncorhynchuskawamurae)、驼背大麻哈鱼(Oncorhynchusgorbuscha)、大麻哈鱼(Oncorhyn洋鲑(Salmosalar)等大西洋鲑属的鱼类；玛红点鲑(Salvelinusmalma)、北极红点鲑fontinalis)、突吻红点鲑(Salvelinusnamaycush)等红点鲑属的鱼类；远东哲罗鲑[0043]上述鲤科的鱼类可包括例如暗色颌须鮈(Gnathopogoncaerulescens)、鲢鱼(Hypophthalmichthysmolitrix)、鲤鱼(Cyprinuscarpio)、草鱼(Ctenopharyngodon(Megalobramaamblyc[0044]上述北美鲶总科(Ictaluroidea)的鱼类可包括例如美洲鲶(Ictalurus[0045]上述鲶科(Siluroidea)的鱼类可包括例如鲶(Silurusasotus)、琵琶湖鲶6[0047]上述鮨科的鱼类可包括例石斑鱼(Epinephelusbruneus)、赤点石斑鱼(Epinephelusakaara)、点带石斑鱼(Epinephelusmalabaricus)、青铜石斑鱼(Epinephelusaeneus)、镶点石斑鱼(Epinephelusamblycephalus)、宝石石斑鱼(Epinephelusareolatus)、橙点石斑鱼(Epinephelusbleekeri)、点列石斑鱼(Epinephelusbontoides)、网纹石斑鱼(Epinepheluschlorostigma)、斜带石斑鱼(Epinepheluscoiodes)、横带石斑鱼(Epinephelusfasciatus)、褐点石斑鱼(Epinephelusfuscoguttatus)、加州石斑鱼(Epinepheluslabriformis)、鞍带石斑鱼(Epinepheluslanceolatus)、花点石斑鱼(Epinephelusmaculatus)、点带石斑鱼(Epinephelusmalabricus)、乌鳍石斑鱼polyphekadion)、玳瑁石斑鱼(Epinephelusquoyanus)、六带石斑鱼(Epinephelusaltivelis)等驼背鲈属、豹纹鳃棘鲈(Plectropomusleopardus)等鳃棘鲈属(Plectropomus)等鱼类和鮨科鱼类彼此[0048]上述慈鲷科(Cichlidae)的鱼类可包括例如尼罗罗非鱼(Oreochromis(Stephanolepis)、绿鳍马面鲀(Thamnaconusmodestus)等马面鲀属(Thamnaconus)等鱼[0051]上述胡瓜鱼科的鱼类可包括例如香鱼(Plecoglossusaltivelis)等香鱼亚科(Plecoglossinae)、西太公鱼(Hypomesusnipponensis)、池沼公鱼(Hypomesusjaponicus)等公鱼亚科(Hypomesinae)、亚洲胡瓜鱼(Osmerusmordaxdentex)、柳叶鱼(Spirinchuslanceolatus)、长体油胡瓜鱼(Spirinchuslanceolatus)等胡瓜鱼亚科[0052]上述鲭科的鱼类可包括例如日本鲭(Scomberjaponicus)、大西洋鲭(Scomberscombrus)、澳洲鲭(Scomberaustralasicus)等鲭属(Scombrini)、太平洋蓝鳍金枪鱼(Thunnusalalunga)、青干金枪鱼(Thunnustonggol)等金枪鱼属鱼类(Thunnini)、鲔(Euthynnusaffinis)、小鲔(Euthynnusalletteratus)等鲔属鱼类(Euthynnus)、鲣[0053]上述鲽科的鱼类可包括例如尖吻黄盖鲽(Pseudopleuronectesherzensteini)、7钝吻黄盖鲽(Pleuronectesyokohamae)、石鲽(Kareiusbicoloratus)、狭鳞庸鲽[0054]上述鲹科(Carangidae)的鱼类可包括例如高体鰤(Se花鲈(Lateolabraxmaculatus)等，上述狼鲈科(Moronidae)的鱼类可包括欧洲鲈[0057]上述军曹鱼科(Rachycentridae)的鱼类为例如军曹鱼(Rachycentroncanadum)[0058]上述舌鳎科的鱼类可包括例如焦氏舌鳎(Cynoglossusjoyneri)、半滑舌鳎[0059]上述鳗鲡科的鱼类可包括例如日本鳗鲡(Anguillajaponica)、欧洲鳗鲡[0060]上述康吉鳗科的鱼类可包括例如星康吉鳗(Congermyriaster)、日本康吉鳗[0065]“促进性成熟”是指与自然界或常规养殖下成熟的平均的同一种个体的最短成熟[0066]将同一种个体的最短成熟月龄设为例如x个月时，“与……最短成熟月龄相比更具有含有吸水卵(卵巢卵)的成熟期卵巢的个体和具有第3次卵黄球期(tertiaryyolk8[0071]各鱼类的瘦素受体或瘦素的mRNA只要是由各鱼类的基因组中存在的瘦素受体或[0072]例如褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)的瘦素受体基因登录为GeneID(NCBI)：[0073]褐牙鲆的瘦素受体的mRNA序列登录为NCBIReferenceSequence：XM020098286.1。另外，褐牙鲆的瘦素的mRNA序列登录为参考序列：NW017859644及NW9[0079]向瘦素受体及瘦素中的至少一者导入功能缺损突变的方法只要能够对对象鱼类体的方法。作为上述蛋白质，可列举例如CRISPR(ClusteredRegularlyInterspaced复/CRISPR相关蛋白9(CRISPR/Cas9)系统。另外，作为其它基因组编辑系统，可列举选自CompoZr锌指核酸酶(ZFN)系统和转录激活样效应因子核酸酶(TALeffectornuclease、TALEN)系统中的至少一种方法。优选将Cas9以mRNA或蛋白质形态导入、将gRNA以sgRNA或crRNA和tracrRNA的状态导入的CRISPR/Cas9系统。另外，在使用载体的CRISPR/Cas9系统[0081]整合于CRISPR序列的以瘦素受体基因或瘦素基因为靶标的序列(以下也称为“靶行转录、或者以包含与靶标序列互补的序列的向导RNA形式导入到细胞中且能够对瘦素受5’侧上游区域的20个碱基左右的序列。靶标序列可以使用优化的CRISPR设计工具(MassachusettsInstituteofTechnology，ZhangLab的网页(http：//design(http：//(北京大学))、CRISPRdirect(http：//导入通过人工合成或通过体外转录合成的gRNA、crRNA、trans_activatingcrRNA[0086]进而，上述基因组编辑系统可以共导入单链低聚物(ssODNs)等供体寡聚DNA。选自瘦素受体及瘦素中的至少一者的mRNA为靶标的RNA分子或能够表达该RNA分子的载体mRNA的翻译的物质。这些RNA分子的序列可以基于作为靶标的上述基因的碱基序列信息通过本领域技术人员公知的方法来适当设计。另外，该RNA分子也可以基于公知的方法来制选siRNA和shRNA。上述能够表达以瘦素受体或瘦素mRNA为靶标的RNA分子的载体只要能够在个体的体内或细胞内表达抑制该瘦素受体或瘦素蛋白的表达的RNA分子则没有特别限适合于表达短链RNA的启动子碱基序列的下游具有与靶标mRNA的有义链相同的序列(其中，体或一部分能够与上述有义链DNA碱基序列互补结合的反义链DNA碱基序列；和终止子序[0091]选自由siRNA、shRNA和miRNA组成的组中的至少1种RNA分子可以通过显微注射对[0092]蛋白质的功能的抑制可以通过选自由下述抗体所组成的组中的至少一种来进行，所述抗体与瘦素受体及瘦素中的一者特异性结合且通过该结合来抑制结合对象的功能表[0104]向上述(1)中得到的单细胞期的受精卵的细胞质中，通过显微注射法导入调整为[0106]使上述(2)中得到的F0个体性成熟，得到F1代瘦素受体基因的同源缺损个体及异[0109]将上述(2)的F0代的孵化鱼苗在0.5t水槽出34个瘦素受体基因中诱导了突变的个体。在1t水槽[0114]图3示出F0代雌性个体的瘦素受体基因缺损牙鲆的体重变化。图3的(A)为确认到[0120]对F1代瘦素受体同源缺损个体中的雄性(实施例的鱼的后代个体)的性成熟进行[0124]制作了瘦素受体基因发生了缺损的红鳍东方鲀，与野生[0132]将上述(4)的F2代瘦素受体基因同源缺损个体在水温为自然水温、日照时间为自法导入调整为10～50pgCas9蛋白及1～5pg向导RNA的溶液，由此向瘦素受体基因导入突法导入调整为10～50pgCas9蛋白及1～5pg向导RNA的溶液，由此向瘦素受体基因导入突法导入调整为10～50pgCas9蛋白及1～5pg向导RNA的溶液，由此向瘦素受体基因导入突[0158]制作了瘦素受体基因发生了缺损的麦奇钩吻鳟，与野生[0162]突变的导入使用Cas9蛋白及向导RNA#1或向导RNA#2。靶基因的序列为5’_向单细胞期的受精卵的细胞质中，通过显微注射法导入调整为10～50pgCas9蛋白及1~[0170]突变的导入使用Cas9蛋白及向导RNA#1或向导RNA#2。靶基因的序列为5’_向单细胞期的受精卵的细胞质中，通过显微注射法导入调整为10～50pgCas9蛋白及1~[0181]11.瘦素受体基因缺损暗色颌须鮈(Gnathopogoncaer[0191]tacgcccgccgcatgcgtgtcaaaggtcaaagccgtcatgtgacgaggctgttggtccctcacgcagTTCCTGAACGCGGCCCGGACTTCTGGAGGATTCTCCAAGACCATCCGAACAGACCTCAGACCAAAGTCACCCTGTTGTTCAAGgaagtcgacacgtcaggtctctcgtactgtgtggatggttttctaatccagcaccggagctccagtggctctgtgacaaccgagcggatcgagccggccgcctccttcagcttcgactggaaccagaggcccgagaatgtgactgtgatggcctacaacagtttggggaactccagcaacaacagcttcatggtgctggacagacagcccaaacgtcgctgcgtgcgCTCCTTCAGCGTGCAGGTGGTCAACCCATCCTGCGTCTCCCTGACGTGGACGCTGTTTGAGAACTGCTCCACCCCCGACTTCATGGTGGTCCAGTGGTCCTCGCGGAGGCACCAGGGCTCCGCCCACCACCGCAGGCTGCAGGGCGGACACACCTGGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCGAAAGAGGAGAAGCTGCCGTCTACCAGATGCTGCTGATCGTCTTCTTCCTCTCTGTCGTCCTGTTTGTCACCCTCATCATCTCGCAGCAAAAaatgaagaagtttgtgtggaaggaggtgcccgaccccagcaagtgctcctgggccaaaggagtggacTTCAGAAGGGTGGACCCTCTTGACCACATGTTCCGTCCTGCCGACGATCTCCCAGCCAGGCCGCTGCTGCTGCTGCCGCTTGAAAACATCTCCAAATTGGTCGTCATGGACAAGATAGACCTGTCAGTGCTGAACGTAGACGTGGTCCAAGACCCCGCAGATCCAGTCGACTCGGAGGCCGACTGCCCTCAGCCACTTCCTGCTTCAGAGCCTCCATTCGTCCTCGACCTGGACGCTTTGACCAGCTTCAAACCAGAACAGGAAGACCCGGCGAGGAAGGAGAACTCGGCCCAGTCTTTTGTCACCTACTCCACTGTGCTGCTGCAGGATCCGCAGCAGCAGCACCAGCAGCAGCACTACAAAGACGGCAGCAGCGGCAGTAGCAGCAGCAGCGACGAAGGAAACTTCTCGGCCAACAACTCGGACATCTCAGGGTCGTTCCAGGGCGGCTTGTGGGAGCTGGACGACCCGCGGCGCTCCTGCTCCTTCAACTCCGTGGAGCAGCTGTCGGAGGCGTCGGAGCAGGAGGACGAGAGCCGAGTCAGAGGCGAGAAGGACTTGTTCTACCTGGGGGTGGAGGGGTACCCTGGGGACGAGAGCGAGGACGAGGAGGAGAAGGATGAGACGGACACCGAGCTGCTGAAGAGTGTCCCGGGCAGGGAGGAACGTCCCGCCGAGTCGCACCCTCTGCTG[0193]atgctggccttcctggtactcatcctcttcctctaccatggaactgtgtgtgtggagccagagagacacccacctgcaagggaggaagacctcccatggcagtcccatctttgctgtgacaccctgccccccctgccccccctgcccccccggctccccaggcccccccgtcccccccagcctgggagatccagagaggagctctctgattcaaagaacgtccacagctcctgcatctacttcaactcctccagcatggcatctcctccaccccccacagagagtcaagtgtgtttggatatccagtgtgtaattgacgcgagcggagagaaagtaatttgccatctgaaacctctcgatgattcttccaactccaccagcggcttcacagtaatcaccctgcagcgctctgaacgtggcgaggagagagagcgggaggaggtcgcgaacgccagcgacaccgtcggctgcgcggggacgccgcccttccggtgctccgtcgccgtcggcgccgtcgtcgcggcaaccgtgaacgtgtcgggagccgtggctcccccggtgctgctccgccttctacccgttaacggtaaaccagacccaccagtgaacgttacgcacatcctcaccccagacggagacctcctactgagttggagccccgcccccctcagctccgccccccccggctccgcctacctaagccccgccccgctccgctacgaggtccgctatgcccccagcgcctcccctgctgtttggaaggccccagctccgccccctcgcccttcctccttcctggagcgactggagccaggcttacaacttcctgttggacttgagaagaggaacaacaacaagatgaaggtccacccccccctgcccccccgtccccctgccctcagcccccctgccccccgcccctcagccctcctgccccctgccctcagcccccctgcctccccgcccctcagcccccgccccagcccccctggccctcattacgccagctacttcccagagagggtggcggtccgacgcggggaagacgtgagcctccgctgcttgttcaacgaccctgctgccaagtccagcacctccgtgtggttcctgaactggcaccctgtggaggccaccgtccaccaggtggtagaggtcagccccagggtcagccaggtcagccccagggtcagccaggtcggcaccagggtcagccaggtcagccccagggtcagccaggtcggccccagggtcagccagatcaccctgcggccccctgaggaacgactgcacagcacgctgcagtgctaccagagcagcaacactcgctactccttcaaggttccctacgctgacgtctacgtccacggagcgctcatcgatatccgctgccagaccaacggggtcatggacgccatgacctgcaggtggaacaacagccacagactggaggagctcaccttcttctacaggtcggaagctgtgacctgtgacatcatggaggaggaaggagaggaggaggaggggagcgtggaagagggtcgcagtgagatcaacgggacaaagtgtccaatcaggaaggaggaagggagtgggaggagctgtgttttccagccgctcagactgacgtactgctacaagctgtggctgcagatccagtcagaggacggacccgtgaggtcacatcctgtctacgtcacgcccaccgaaaatgtgaagcctaaccctccagcccaggtgcaggctcatgtctctcccagcagaattctgaagcttgtctggcagcctcctagactgcccttgtacgagctccagtaccaggtccgatacctccccgctgcaggtcgggccctcccagactggcaggaagtgggtccagtgagcgagccaagagcggagatccctgtacctgacgtgtgtggcgtgtacctggtccaggtgcgctgtgtacccaccaatgggactggccactggagcgactggagcaagcctgtctactccacaacccccaaccgcagtgctccccatcatggtccagacttctggaggattctggaggaagattcatccttgaacatcacctacgttactctgctcttcaagcatgtctctatggagccctcctcctgtgtagagggccttgcagttcagcaccaggtctctgggggcgctgtggtcacggagctgatcggcctagttccttcttacacgtttgaatggaaggaggaagtacacacggtgacggtgaaggcgcagaatcgcttgggatcgtcaggtcacaacgtcaacatgaccttggaccgacacgtcaaacgtccgtgtttactctggttcagagcgtccctggtcaacagcagctgtgtggagctatcctgggctctgctgccccagaacccgaccccctggtccctggtgctgcagtggtcaggagccaccagggggcgccggccagcccacgacccgacctcggggaccagcctgaagtgggccagggtgccgttcactgaccgcgttttctacctgcacggagaattctacggctctgaagagtatgagttcatcttgtaccctatatttgcagacagggaaggcgagccaatgcatgctaaagccagcagagggccccctgctgactacatgttgctgattatcatcaccttcctagccatcgtcctcatcatcactctcatgttgttccagaaccacatgaagaagctgatgtggagaaaggttcctaaccccaaccgctgctcctgggcgcaaggaagagacttccggaaggcagagaccatggaccagctgttcagacacccagacggtttccctgcctggcctctcctcctggtgtctgagaccatctctgaggtggtgatcatggagaagagcagccttccctctcctgctctctctccagctccggaccccgtccctgggcaaggccctcccagaggcctccctggccctcgcccctcctccacccccagcgaaggctctggctctgggttccccaggacatcagagacctcggcccagtcgtcggtcgcgtacgctactgttctcctctcca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